Name: Determinazione dellimmunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Impara a generare cellule dendritiche da monociti bovini per valutare l'immunogenicità dei vaccini in vitro. Questo metodo consente di selezionare candidati vaccinali e controllarne la qualità.

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Ringraziamo la dottoressa Eveline Wodak e la dottoressa Angelika Loistch (AGES) per il loro supporto nel determinare lo stato di salute degli animali e per aver fornito BTV, il dottor Bernhard Reinelt per aver fornito sangue bovino e il dottor Bharani Settypalli e il dottor William Dundon dell'AIEA per consigli utili rispettivamente sugli esperimenti di PCR in tempo reale e sull'editing linguistico.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo studio dimostra un metodo standardizzato in vitro per generare e fenotipizzare MoDC bovine e il loro successivo utilizzo nella misurazione dell'immunogenicità del vaccino di un vaccino commerciale (ad esempio, RV). I MoDC bovini possono essere utilizzati come strumento per lo screening di potenziali antigeni vaccinali contro le malattie del bestiame e prevedere il loro potenziale impatto clinico sulla base delle risposte immunitarie prima di procedere verso studi in vivo sugli animali. I MoDC gen...

La vaccinazione veterinaria rappresenta un aspetto cruciale della zootecnia e della salute, in quanto contribuisce a migliorare la sicurezza alimentare e il benessere degli animali conferendo protezione contro le malattie che colpiscono il settore zootecnico a livello globale1. Un metodo efficace in vitro per valutare l'immunogenicità di possibili candidati vaccini contribuirebbe ad accelerare il processo di sviluppo e produzione del vaccino. È quindi necessario ampliare il campo dei saggi immunitari con metodologie innovative basate su studi in vitro, in quanto ciò contribuirebbe a svelare la complessità dei processi immunitari legati all'immunizzazione e all'infezione da patogeni. Attualmente, gli studi di immunizzazione e di provocazione animale in vivo , che richiedono campionamenti periodici (ad esempio, sangue e milza), vengono utilizzati per misurare l'immunogenicità dei vaccini candidati e degli adiuvanti. Questi test sono costosi, richiedono tempo e hanno implicazioni etiche, perché nella maggior parte dei casi, l'eutanasia animale viene effettuata entro la fine delle prove.
In alternativa ai test in vivo, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state utilizzate per valutare le risposte immunitarie indotte dal vaccino in vitro2. Le PBMC sono una popolazione eterogenea di cellule composta per il 70%-90% da linfociti, per il 10%-20% da monociti e da un numero limitato di cellule dendritiche (DC, 1%-2%)3. Le PBMC ospitano cellule presentanti l'antigene (APC) come cellule B, monociti e DC, che pattugliano costantemente l'organismo alla ricerca di segni di infezione o danno tissutale. Le chemochine secrete localmente facilitano il reclutamento e l'attivazione delle APC in questi siti legandosi ai recettori della superficie cellulare. Nel caso dei monociti, le chemochine dirigono il loro destino a differenziarsi in DC o macrofagi4. Non appena le DC incontrano e catturano un agente patogeno, migrano verso organi linfoidi secondari, dove possono presentare gli antigeni peptidici patogeni trasformati utilizzando proteine di superficie di classe I o di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) rispettivamente alle cellule T CD8+ o alle cellule T CD4+, innescando così una risposta immunitaria 5,6.
Il ruolo chiave svolto dalle DC nell'orchestrare una risposta immunitaria protettiva contro vari agenti patogeni le rende un interessante obiettivo di ricerca per la comprensione dei meccanismi immunitari intracellulari, specialmente quando si progettano vaccini e adiuvanti contro agenti infettivi7. Poiché la frazione di DC che può essere ottenuta dalle PBMC è piuttosto piccola (1% -2%), i monociti sono stati invece utilizzati per generare DC in vitro8. Queste DC derivate da monociti (MoDC) sono state inizialmente sviluppate come possibile strategia di trattamento nell'immunoterapia del cancro9. Più recentemente, i MoDC sono stati utilizzati per la ricerca sui vaccini 10,11,12 e i monociti classici sono il sottotipo predominante (89%) per la produzione di MoDC 13. La produzione di MoDC in vitro è stata precedentemente ottenuta attraverso l'aggiunta del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) somministrato in combinazione con altre citochine come l'interleuchina-4 (IL-4), il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) o IL-1314,15,16.
Il successo di un test MoDC in vitro si basa sulla capacità dei MoDC maturi stimolati dall'antigene di modulare l'estensione e il tipo di risposta immunitaria specifica per il tipo di antigene rilevato17. Il tipo di patogeno riconosciuto e presentato dalle MoDC determina la differenziazione delle cellule T helper (Th) CD4+ in cellule effettrici Th1, Th2 o Th17 ed è caratterizzato da un profilo di citochine secretorie specifiche per patogeno. Una risposta Th1 è suscitata contro i patogeni intracellulari e provoca la secrezione di interferone-gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale beta (TNF-β), che modula la protezione fagocitico-dipendente. Una risposta Th2 viene attivata contro gli organismi parassiti ed è caratterizzata dalla secrezione di IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, che avvia la protezione umorale fagocitica-indipendente. Th17 offre protezione neutrofili-dipendente contro le infezioni batteriche e fungine extracellulari mediate dalla secrezione di IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Sulla base di studi precedenti, è stato notato che non tutti i patogeni rientrano nel profilo di citochine atteso. Ad esempio, le MoDC dermiche, in risposta all'infezione parassitaria da Leishmania, stimolano la secrezione di IFN-γ dalle cellule T CD4+ e dalle cellule T CD8+, inducendo così una risposta protettiva proinfiammatoria Th122.
È stato anche dimostrato che, nei MoDC di pollo innescati con Salmonella lipopolisaccaride (LPS), possono indurre una risposta variabile contro Salmonella typhimurium attivando sia le risposte Th1 che Th2, mentre Salmonella gallinarum induce una risposta Th2 da sola, il che potrebbe spiegare la maggiore resistenza di quest'ultima verso la clearance MoDC23. L'attivazione di MoDC contro Brucella canis (B. canis) è stata riportata anche in MoDC sia canine che umane, il che significa che questo potrebbe rappresentare un meccanismo di infezione zoonotica24. I MoDC umani innescati con B. canis inducono una forte risposta Th1 che conferisce resistenza a infezioni gravi, mentre i MoDC canini inducono una risposta Th17 dominante con una risposta Th1 ridotta, portando successivamente all'instaurazione di infezione cronica25. Le MoDC bovine mostrano una maggiore affinità per il virus dell'afta epizootica (FMDV) coniugato con immunoglobuline G (IgG) rispetto all'FMDV non coniugato da solo, poiché i MoDC formano un complesso di anticorpi virali in risposta ai primi10. Nel loro insieme, questi studi mostrano come le MoDC sono state utilizzate per analizzare la complessità delle risposte immunitarie durante l'infezione da patogeni. Le risposte immunitarie adattative possono essere valutate mediante la quantificazione di specifici marcatori associati alla proliferazione linfocitaria. Ki-67, una proteina intracellulare rilevata solo nelle cellule in divisione, è considerata un marker affidabile per gli studi di proliferazione26, e allo stesso modo, CD25 espresso sulla superficie delle cellule T durante la fase tardiva di attivazione corrisponde alla proliferazione linfocitaria27,28.
Questo studio dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di MoDC per bovini seguita dalla loro applicazione in un test immunitario in vitro utilizzato per testare l'immunogenicità dei vaccini. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio (RV) è stato utilizzato per convalidare l'efficacia di questo test. L'attivazione e la proliferazione dei linfociti T sono state misurate mediante citometria a flusso, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) attraverso l'analisi di marcatori di attivazione cellulare ben consolidati come Ki-67 e CD25 e la secrezione di IFN-γ 28,29,30,31. Durante il test MoDC non vengono eseguite prove sperimentali su animali o sull'uomo.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>tampone ammonio-cloruro-potassio per la lisi dei globuli rossi residui in provette per eparina per frazione PBMC BD</td></tr><tr><td>Vacutainer</td><td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td><td>366480</td><td>10 mL, additivo per eparina sodica 158 unità USP, tubo di vetro, 16 x 100 mm Kit per</td></tr><tr><td>la crescita di cellule dendritiche bovine</td><td>Bio-Rad, Regno Unito</td><td>PBP015KZZ</td><td>Cocktail di citochine composto da IL-4 bovina ricombinante e</td></tr><tr><td>IFN bovina GM-CSF-gamma; Kit ELISA</td><td>Bio-Rad</td> MCA5638KZZ <td>Kit da utilizzare per misurare l'espressione di IFN-&gamma; nel surnatante di coltura</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD14</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>Anticorpo monoclonale CD14 anti-bovino di topo, clone CC-G33, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>Anticorpo CD25</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>Anticorpo monoclonale CD25 antibovino di topo, clone IL-A11, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>CD4 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>Anticorpo monoclonale CD4 antibovino di topo, clone CC8, isotipo IgG2a</td></tr><tr><td>CD40 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>Anticorpo monoclonale CD40 antibovino di topo, clone IL-A156, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>CD8 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>Anticorpo monoclonale CD8 antibovino di topo, clone CC63, isotipo IgG2a</td></tr><tr><td>CD86 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>Anticorpo monoclonale CD86 anti-bovino di topo, clone IL-A190, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad-Thermal</td><td></td> <td>cycler Macchina per centrifuga</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352096 & 352070</td><td>15 mL e 50 mL, fondo conico in polipropilene ad alta chiarezza, graduato, steriale, tappo a vite con guarnizione, provetta di falco</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>Kit di fissaggio/permeabilizzazione con BD golgiPlug, da utilizzare per la colorazione cellulare del citometro a flusso</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>Absolute per analisi EMSURE&nbsp; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10500064</td> Placca di Ficoll <td>qualificata, inattivata a caldo</td></tr><tr><td>PLUS</td><td>GE Health care Life Sciences, USA</td><td></td><td>341691 Terreno di isolamento dei linfociti</td></tr><tr><td>FlowClean Cleaning Agent</td><td>Beckman Coulter, Life Sciences</td><td>A64669</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-</td><td></td><td>Citometro a flusso Software per istogramma</td></tr><tr><td>FlowTubes/ FACS&nbsp; (Selezione di singole cellule attivata da fluorescenza) Tubo</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352235</td><td>Provetta in polistirene steriale da 5 mL, a fondo tondo, con tappo a scatto per filtro cellulare, utilizzabile nell'analisi della citometria a flusso</td></tr><tr><td>Fluoresceinaisotiocinato-destrano</td><td>Sigma Aldrich, Germania</td><td>60842-46-8</td><td>Citometro a flusso FITC-destrano MW</td></tr><tr><td>Gallios Citometro</td> a flusso <td>Beckman Coulter-Flow</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plates Hard-Shell a 96 pozzetti Bio-Rad</td><td></td><td>HSP9601</td><td>96 pozzetti, a basso profilo, a parete sottile, con bordo, bianco/trasparente</td></tr><tr><td>Microsfere CD14 umane</td><td>Miltenyi Bioteck, Germania</td><td>130-050-201</td><td>Microsfere da 2 mL coniugate all'anticorpo CD14 monoclonale anti-umano isotipo IgG2a, utilizzato per la selezione di monociti bovini da PBMC</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter, Germania-Citometro</td><td></td> <td>a flusso software di analisi dati multicolore</td></tr><tr><td>Colonna MACS Miltenyi</td><td>Bioteck, Germania</td><td>130-042-401</td><td>Selezione cellulare attivata magneticamente o colonna di separazione cellulare magentica immunitaria per la separazione di varie popolazioni di cellule CD14 in base agli antigeni della superficie cellulare</td></tr><tr><td>MHC Classe II DQ DR Anticorpo polimorfico</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>Topo anti-pecora MHC Classe II DQ DR Polimorfico:FITC, clone 49.1, isotipo IgG2a, reattivo crociato con</td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga</td><td>bovina Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1,5 mL, fondo conico, graduato, tubo steriale</td></tr><tr><td>Microsoft Power Point</td><td></td> <td>Microsoft-Le</td> <td>illustrazioni grafiche del disegno sperimentale</td></tr><tr><td>Topo IgG1 Controllo negativo: FITC per CD14, CD40 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>Controllo isotipo CD14 e CD40 anticorpo monoclonale...</td></tr><tr><td>Controllo negativo IgG1 di topo: PE per l'anticorpo CD86</td><td>Bio-Rad</td> MCA928PE <td>Controllo dell'isotipo Anticorpo monoclonale CD86</td><td></td></tr><tr><td>Controllo negativo IgG1 di topo: RPE per anticorpo CD25</td><td>Bio-Rad</td> MCA928PE <td>Controllo dell'isotipo Anticorpo monoclonale CD25</td><td></td></tr><tr><td>Controllo negativo delle IgG2a di topo: FITC per l'anticorpo MHC di classe II</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA929F Controllo dell'isotipo per l'anticorpo monoclonale MHC di classe II.</td><td></td></tr><tr><td>Nobivac Rabbia</td><td>MSD Salute degli animali, UK-1</td><td></td> <td>& micro; L/mL di vaccino inattivato in coltura cellulare contenente > 2 U.I./mL di ceppo virale della rabbia</td></tr><tr><td>Sigilli ottici</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>Provetta PCR piatta da 0,2 mL Strisce a 8 tappi, ottiche, ultratrasparenti, compatibili per macchina qPCR</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>di tampone fosfato soluzione salina (PBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7,4, concentrazione</td></tr> <tr><td>1xPrisma - Software GraphPad 5</td><td>Dotmatics-Software</td><td></td> <td>statistico</td></tr><tr><td>Anticorpo Ki-67 umano purificato</td><td>Biolegend, USA</td><td>350501</td><td>Anticorpo monoclonale, reattivo incrociato con mucca, clone ki-67</td></tr><tr><td>Topo purificato IgG1 k Isotipo Ctrl Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>400101</td><td>Controllo dell'isotipo per l'anticorpo monoclonale Ki-67</td></tr><tr><td>READIDROP Propidium Iodure</td><td>BD</td><td>Bio Sciences 1351101</td><td>Marcatore di cellule vive/morte utilizzato per citometria a flusso, colorante reattivo amminico Proteina</td></tr><tr><td>IL-2 umana ricombinante</td><td>R& D System, USA</td><td>202-IL-010/CF</td><td>Interleuchina-2, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Kit da utilizzare per l'estrazione dell'RNA totale; tampone RLT = tampone di lisi; tampone RW1 = tampone di lavaggio contenente guanidina rigorosa; Buffer RDD = Buffer DNasi; tampone RPE = tampone di lavaggio delicato; RNaseOUT = Inibitore della RNasi.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>Terreni di coltura cellulare con L-glutammina e bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>SMART-servier medical art&nbsp;</td><td>Les Laboratories Servier-Concesso</td><td></td> <td>in licenza con licenza Creative Commons Attribuzione 3.0 non portato</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5270</td><td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymeras, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, coloranti di normalizzazione ROX.</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Filament Synthesis System</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td>Kit per sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>Piastra per test per colture tissutali 24</td><td>TPP, Svizzera</td><td>92024</td><td>Piastra a 24 pozzetti, sterilizzata mediante radiazioni, trattamento con crescita potenziata, volume 3,18 mL</td></tr> Soluzione <tr><td>di Trypan Blue</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>0,4%, 100 mL, colorante per valutare la vitalità cellulare</td></tr><tr><td>Acqua distillata UltraPure senza DNasi/RNasi</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>0,1 &; m acqua distillata filtrata a membrana</td></tr><tr><td>Provette per la raccolta del sangue con eparina VACUETTE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206067</td> Le <td>provette per la raccolta del sangue con eparina VACUETTE hanno una parte superiore verde e contengono eparina di litio, sodio o ammonio essiccata a spruzzo sulle pareti interne e sono utilizzate in chimica clinica, immunologia e sierologia. L'anticoagulante eparina attiva l'antitrombina, che blocca la cascata della coagulazione e quindi produce un campione di sangue/plasma intero.</td></tr><tr><td>Acqua</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-1L</td><td>Filtrato sterile, bioReagente adatto per colture cellulari</td></tr></tbody></table>

determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Le cellule dendritiche (DC) sono le cellule presentanti l'antigene (APC) più potenti all'interno del sistema immunitario. Pattugliano l'organismo alla ricerca di agenti patogeni e svolgono un ruolo unico all'interno del sistema immunitario collegando le risposte immunitarie innate e adattative. Queste cellule possono fagocitare e quindi presentare antigeni catturati alle cellule immunitarie effettrici, innescando una vasta gamma di risposte immunitarie. Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) isolate da cellule mononucleate del sangue periferico del bestiame (PBMC) e la loro applicazione nella valutazione dell'immunogenicità del vaccino.
La selezione cellulare su base magnetica è stata utilizzata per isolare i monociti CD14+ dalle PBMC e l'integrazione di terreno di coltura completo con interleuchina (IL)-4 e fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) è stata utilizzata per indurre la differenziazione dei monociti CD14+ in MoDC naïve. La generazione di MoDC immature è stata confermata rilevando l'espressione dei marcatori di superficie cellulare del complesso maggiore di istocompatibilità II (MHC II), CD86 e CD40. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio è stato utilizzato per pulsare i MoDC immaturi, che sono stati successivamente co-coltivati con linfociti naïve.
L'analisi citometrica a flusso delle MoDC pulsate dall'antigene e della co-coltura linfocitaria ha rivelato la stimolazione della proliferazione dei linfociti T attraverso l'espressione dei marcatori Ki-67, CD25, CD4 e CD8. L'analisi dell'espressione dell'mRNA di IFN-γ e Ki-67, utilizzando la PCR quantitativa, ha mostrato che i MoDC potrebbero indurre il priming antigene-specifico dei linfociti in questo sistema di co-coltura in vitro . Inoltre, la secrezione di IFN-γ valutata utilizzando ELISA ha mostrato un titolo significativamente più alto (**p < 0,01) nella co-coltura di linfociti MoDC pulsata dal vaccino antirabbico rispetto alla co-coltura di linfociti MoDC non pulsata dall'antigene. Questi risultati mostrano la validità di questo test MoDC in vitro per misurare l'immunogenicità del vaccino, il che significa che questo test può essere utilizzato per identificare potenziali candidati vaccini per i bovini prima di procedere con studi in vivo , nonché nelle valutazioni dell'immunogenicità dei vaccini commerciali.

Questa metodologia descrive la generazione in vitro di MoDC bovini per la valutazione degli antigeni vaccinali candidati prima di eseguire studi in vivo. La figura 1 illustra lo schema sperimentale della generazione di MoDC bovini e l'applicazione dei MoDC per il saggio in vitro. Utilizzando la tecnica di selezione cellulare basata sul magnetismo, è stato possibile raccogliere circa 26 milioni di miociti CD14+ dalle PBMC raccolte, che in precedenza erano...

La metodologia descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) e la loro applicazione per la valutazione in vitro di candidati antigenici durante lo sviluppo di potenziali vaccini veterinari nei bovini.

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Questo protocollo rappresenta un saggio funzionale in vitro che utilizza cellule dendritiche derivate da monociti bovini per misurare l'immunogenicità del vaccino prima degli studi in vivo. Pertanto, colmando una lacuna esistente nella vaccinologia del bestiame. È la generazione e l'applicazione di cellule dendritiche.Come le cellule presentanti l'antigene più potenti, le cellule dendritiche sono diventate un obiettivo di ricerca chiave per comprendere i meccanismi immunitari intracellulari, compresa l'efficacia del vaccino. Questo test può essere implementato come strumento per lo screening dei candidati vaccini, come stato di controllo della qualità per la produzione di vaccini e per la selezione dell'antigene e dell'adiuvante. A dimostrare la procedura sarà Richard Kangethe, scienziato del laboratorio di produzione e salute animale.Inizia invertendo e mescolando il sangue ottenuto dalla puntura della vena giugulare del vitello con vacutainers eparinizzati. Quindi trasferire 20 millilitri di sangue eparinizzato in un tubo sterile da 50 millilitri e diluirlo con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato o PBS. Pipettare 15 millilitri di terreno di isolamento dei linfociti su un tubo sterile da 50 millilitri e inclinare il tubo in una posizione di 45 gradi.Posizionare con cura 30 millilitri di terreno PBS di sangue sopra l'isolamento dei linfociti utilizzando una pipetta da 25 millilitri e riportare lentamente il tubo in posizione verticale prima di centrifugarlo. Quindi raccogliere il sottile strato bianco di cellule mononucleate del sangue periferico o strato di PBMC utilizzando una pipetta Pasteur e trasferirlo in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare i PBMC raccolti due volte utilizzando 40 millilitri di PBS per lavaggio e mescolare accuratamente.Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 15 millilitri di tampone di potassio cloruro di ammonio o tampone ACK. Dopo 10-15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere fino a 40 millilitri di PBS e centrifugare il tubo con la massima accelerazione e decelerazione. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura completo.Quindi aggiungere cinque microlitri di tampone CD14 MicroBead per 10 milioni di cellule e mescolare accuratamente usando una pipetta. Per l'analisi della citometria a flusso, aggiungere 10 microlitri di isotiocianato di fluoresceina CD14 o anticorpo colorante FITC alle PBMC e incubarlo per 15 minuti a quattro-otto gradi Celsius prima di procedere con la citometria a flusso. Alle PBMC non macchiate, aggiungere un millilitro di tampone fax e centrifugarlo per sette minuti a 500 g e quattro gradi Celsius.Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fax per 100 milioni di celle. Quindi, inserire la colonna di separazione cellulare immunomagnetica nel separatore e posizionare un tubo di raccolta da 50 millilitri sotto l'uscita della colonna per raccogliere il flusso attraverso. Dopo aver lavato la colonna con un buffer fax degassato da un millilitro, sostituire il tubo da 15 millilitri usato con uno nuovo.Pipettare cento milioni di cellule in 500 microlitri di tampone alla volta consentendo alla sospensione cellulare di passare attraverso la colonna. Quindi sciacquare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone fax degassato ogni volta. Dopo aver raccolto il flow-through, etichettare la prima frazione linfocitaria naïve eluita come frazione cellulare CD14 negativa.Rimuovere la colonna dal separatore e posizionare un nuovo tubo sterile da 15 millilitri sotto la colonna per la raccolta degli effluenti. Aggiungere cinque millilitri di buffer fax nella colonna e spingerlo immediatamente attraverso utilizzando lo stantuffo. Raccogliere ed etichettare il secondo flusso attraverso o la frazione monocitaria naïve come frazione cellulare CD14 positiva.Aggiungi terreno di coltura completo ai monociti CD14 positivi raccolti per ottenere 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, aggiungere una sospensione cellulare da un millilitro a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti prima di integrare ciascun pozzetto con 40 microlitri del cocktail di citochine fornito nel kit. Il secondo giorno, trasferire metà del contenuto di ciascun pozzetto in singoli tubi da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta.Dopo aver centrifugato i tubi da 1,5 millilitri a 500 g per sette minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di coltura fresco completo. Trasferire 500 microlitri di questa sospensione cellulare risospesa ai pozzetti corrispondenti in modo che il volume finale nel pozzo diventi di un millilitro. Arricchire ogni pozzetto con 20 microlitri di cocktail di citochine.Per generare MoDC pulsate dall'antigene, aggiungere un microlitro per millilitro di vaccino contro il virus della rabbia o sospensione RV a un millilitro di coltura MoDC naïve nella piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per 48 ore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Il settimo giorno, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati dall'antigene sul ghiaccio per 10 minuti prima di aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato per pozzetto e mescolarlo accuratamente. Trasferire la sospensione su un tubo da 15 millilitri.Lavare i pozzetti con due millilitri di PBS ghiacciato. Raccogliere le cellule residue all'interno di ciascun pozzetto e trasferire il contenuto lavato nei rispettivi tubi. Centrifugare la sospensione cellulare a 500g per sette minuti.Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare MoDC pulsato dall'antigene in un terreno di coltura completo per regolare la concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro. Per la co-coltura di linfociti MoDC, seminare i pozzetti di una piastra sterile a 24 pozzetti con un millilitro di sospensione di cellule linfocitarie naïve e un millilitro di sospensione MoDC pulsata dall'antigene o non pulsata dall'antigene il settimo giorno dell'impulso dell'antigene. Dopo due giorni di incubazione, integrare ogni pozzetto con 20 nanogrammi per millilitro di interleuchina-2 ricombinante e continuare l'incubazione per altre 120 ore.Il giorno 14, trasferire un millilitro di co-coltura in un tubo sterile da 1,5 millilitri e centrifugare il tubo. Quindi risospendere il pellet cellulare con un millilitro di MoDC pulsate dall'antigene o non pulsate. Mescolare bene e trasferire le sospensioni cellulari nei pozzetti corrispondenti.Dopo la colorazione della superficie cellulare delle PBMC e dei linfociti e monociti naïve, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 millilitri usando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 g. Quindi risospendere il pellet in un millilitro di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere anche le celle residue e i tubi corrispondenti utilizzando un millilitro di PBS.Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS al tubo da 15 millilitri contenente le celle e mescolare mediante pipettaggio. Dopo aver centrifugato il tubo per sette minuti a 850g, rimuovere il surnatante e risospendere con attenzione il pellet cellulare con sospensione residua rimasta dopo la decantazione del surnatante. Trasferire la sospensione della cella su una piastra a V da 96 pozzetti e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.Una volta completata la colorazione, eseguire l'analisi del citometro a flusso. Dall'anteprima in tempo reale, regolare la soglia di fluorescenza tra cui tensione e guadagno e dimensione della cella per disegnare eventualmente porte intorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari. La colorazione delle cellule CD14 e la citometria a flusso hanno mostrato che la frazione monocitaria naïve comprendeva il 98% di cellule monocitarie CD14 positive ed era funzionalmente in grado di assorbire l'antigene.Le MoDC naïve fenotipicamente caratterizzate dalla valutazione dell'espressione di MHC Classe 2 e dei marcatori di superficie delle cellule CD86 e CD40 co-stimolatorie hanno convalidato le cellule dendritiche o il fenotipo DC-like. Durante la co-coltura di linfociti MoDC il nono giorno, è stato osservato un cambiamento morfologico che mostra l'estensione dei dendriti nell'impulso RV ai MoDC. Rispetto alla coltura di linfociti MoDC non pulsata, un aumento significativo della proliferazione dei linfociti è stato dimostrato dalla sovraregolazione dei marcatori di attivazione Ki67 e CD25 sulle cellule T CD4 positive e CD8 positive al giorno 16 nella co-coltura di linfociti MoDC pulsati.Le cellule T CD8 positive delle co-colture mature di MoDC pulsate RV hanno mostrato una sovraregolazione di otto volte di Ki67 rispetto al gruppo non specifico. Le cellule CD4 positive nella stessa co-coltura hanno mostrato un aumento di sette volte di Ki67 rispetto ai controlli, dimostrando la capacità dei MoDC innescati da RV di presentare l'antigene RV ai linfociti naïve e attivarli in una condizione in vitro. La quantificazione qPCR delle co-colture ha mostrato un aumento di oltre il 30% nell'espressione di interferone gamma e di oltre il 5% nell'espressione di Ki67 in tutte le co-colture che hanno utilizzato GAPDH come calibratore.Una concentrazione significativamente più elevata di interferone gamma secreto è stata osservata nella co-coltura di linfociti MoDC pulsati RV rispetto al gruppo di trattamento non specifico. Eseguire la fase di stratificazione molto lentamente e con attenzione, assicurandosi che il sangue sia posto sopra il mezzo di isolamento dei linfociti. Prestare particolare attenzione a raccogliere tutte le PBMC senza raccogliere troppo materiale dagli altri livelli.Altri metodi come la citometria a flusso, l'ELISA e la PCR quantitativa, tra gli altri, possono essere applicati dopo questa procedura per valutare l'attivazione dei marcatori immunitari.

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un test basato su MoDC su cellule dendritiche derivate da monociti per misurare l'immunogenicità dei vaccini disponibili in commercio. I saggi MoDC studiano le risposte delle cellule dendritiche ad antigeni, agenti patogeni o trattamenti e possono fornire informazioni sulle risposte immunitarie, sullo sviluppo di vaccini e sulla ricerca sull'immunoterapia.

Un test in vitro basato su cellule dendritiche pulsate con vaccino per indurre la proliferazione dei linfociti

Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

Descriviamo un protocollo per la coniugazione chimica dell'antigene modello ovalbumina ad un anticorpo specifico del recettore dell'endocitosi per il targeting delle cellule dendritiche in vivo. Il protocollo comprende la purificazione dell'anticorpo, la coniugazione chimica dell'antigene, nonché la purificazione del coniugato e la verifica di una coniugazione efficiente.

Coniugazione chimica di un anticorpo purificato dec-205 diretto con proteina a lunghezza intera per il targeting di cellule dendritiche di topo in vitro e in vivo

Viene presentato un protocollo unico e completo per generare cellule dendritiche (mo-DC) derivate da monociti umani desialilati da cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC) utilizzando un trattamento con sialidasi. Inoltre, vengono descritti metodi per valutare la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle mo-DC e valutare come il trattamento con sialidasi migliora il livello di maturazione delle mo-DC.

Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14+ umani

Impara a generare cellule dendritiche da monociti bovini per valutare l'immunogenicità dei vaccini in vitro. Questo metodo consente di selezionare candidati vaccinali e controllarne la qualità.

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

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