Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza
February 24th, 2023
Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.
Lo studio della risposta al danno del DNA è necessario per comprendere la fisiopatologia dei potenziali biomarcatori del cancro ovarico in nuove terapie mirate. Questa tecnica consente al campione di rimanere intatto e consente l'esame degli antigeni nella loro posizione d'azione. Questo protocollo è rapido e può essere adattato a qualsiasi antigene suscettibile di immunofluorescenza.
Questo metodo fornisce informazioni sul cancro ovarico e sui processi di riparazione del danno al DNA coinvolti nella resistenza chemioterapica e agli inibitori PARP. Questi metodi possono essere applicati ad altre aree di studio che prevedono l'uso di colture 3D e organoidi. Per iniziare, aspirare il mezzo dagli organoidi irradiati e incubati senza interrompere la matrice 3D.
Quindi lavare con 300 microlitri di PBS. Fissare gli organoidi in 300 microlitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti. Dopo il fissaggio, lavare gli organoidi con 300 microlitri di tampone anticolorante e metterli su uno shaker per cinque minuti.
Quindi permeabilizzare l'organoide aggiungendo delicatamente 300 microlitri di tampone di permeabilizzazione. Dopo 20 minuti di incubazione, rimuovere il tampone e lavare con 300 microlitri di tampone colorante. Posizionare gli organoidi su uno shaker per cinque minuti.
Quindi, aggiungere 300 microlitri di tampone colorante per bloccare la fase di permeabilizzazione. Posizionare sullo shaker per 30 minuti e aspirare il tampone anticolorante con una pipetta. Quindi aggiungere 300 microlitri di anticorpi primari diluiti in tampone colorante.
Incubare a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale primaria. Eseguire tre lavaggi con 300 microlitri di tampone anticolorante per cinque minuti ciascuno sullo shaker.
Aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale secondaria diluita in tampone colorante e incubare per un'ora al buio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione anticorpale secondaria e aggiungere 300 microlitri di DAPI diluito. Mettere sullo shaker per cinque minuti.
Eseguire tre lavaggi con 300 microlitri di tampone anticolorante per cinque minuti ciascuno sullo shaker. Rimuovere il tampone anticolorante e staccare le camere utilizzando il kit di rimozione fornito con le guide della camera. Tagliare la punta di una punta di pipetta P200 e utilizzarla per aggiungere un mezzo di montaggio per coprire ciascun pozzetto contenente una linguetta organoide.
Posizionare una linguetta di copertura sul campione evitando le bolle. Prendi lo smalto trasparente e dipingilo sui lati del vetro di copertura per sigillare il vetrino. Lasciare indurire per un'ora e poi posizionarlo a 20 gradi Celsius.
Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale utilizzando un obiettivo 63X con olio ad immersione. Utilizzando questo protocollo, gli organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente sono stati colorati per le proteine di riparazione del danno al DNA prima e dopo l'irradiazione e valutati per biomarcatori come gamma H2AX, un marker di danno al DNA, e RAD51, un marker per la riparazione della ricombinazione omologa. Anche RPA, un marker dello stress di replicazione, 53BP1, un marker di ingiunzione non omologa, e Geminin, un marcatore del ciclo cellulare di fase GS2 sono stati valutati utilizzando questa tecnica.
Le linguette BME tendono a depolimerizzare, quindi prestare molta attenzione dopo il fissaggio e l'aspirazione è vitale. L'analisi degli antigeni per determinare il danno agli organoidi e la capacità di montare una risposta al danno del DNA potrebbe aiutare nella valutazione della resistenza chemioterapica.
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Panoramica
Questo protocollo delinea metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoids del cancro ovarico derivati dai pazienti. Include tecniche complete di placcatura e colorazione insieme a procedure di quantificazione oggettiva.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Ricerca sul cancro ovarico
- Risposta al danno del DNA
- Tecnologia degli organoids
Sfondo
- Comprendere la risposta al danno del DNA è cruciale per la fisiopatologia del cancro ovarico.
- Questo studio esplora potenziali biomarcatori per la terapia mirata.
- Il protocollo permette l'esame degli antigeni nelle loro posizioni funzionali.
- È adattabile a vari antigeni adatti per l'immunofluorescenza.
Scopo dello studio
- Investigare i processi di riparazione del danno al DNA nel cancro ovarico.
- Fornire informazioni sulla resistenza alla chemioterapia e agli inibitori del PARP.
- Sviluppare metodi applicabili ad altri studi che coinvolgono colture 3D e organoids.
Metodi utilizzati
- Aspirare il mezzo da organoids irradiati e incubati senza disturbare la matrice 3D.
- Utilizzare l'immunofluorescenza per l'esame degli antigeni.
- Implementare protocolli rapidi e adattabili per vari antigeni.
- Impiegando procedure di quantificazione oggettiva per l'analisi.
Risultati principali
- Informazioni sui meccanismi di riparazione del danno al DNA nel cancro ovarico.
- Identificazione dei meccanismi di resistenza alla chemioterapia.
- Dimostrazione dell'adattabilità del protocollo a diversi antigeni.
- Possibile applicazione dei metodi ad altre aree di studio.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare la risposta al danno del DNA nel cancro ovarico.
- Migliora la comprensione dei meccanismi di resistenza al trattamento.
- I metodi possono essere ampiamente applicati a vari contesti di ricerca che coinvolgono organoids.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Visualizing DNA damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids using immunofluorescence enables high-content, spatially resolved biomarker analysis in disease-relevant 3D models. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for therapeutic strategies addressing chemoresistance. Integrating these assays at the discovery and preclinical interface supports risk-adjusted portfolio decisions in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of DNA repair pathways and functional target validation in clinically relevant 3D tumor models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing protein recruitment and colocalization after genotoxic stress.
- Facilitates identification of predictive biomarkers for chemotherapeutic and PARP inhibitor resistance.
Screening & Assay Development
- Establishes validated immunofluorescence workflows for quantitative protein foci analysis in organoids.
- Delivers reproducible, high-sensitivity readouts for downstream screening of DNA repair modulators.
- Enables standardization of imaging and automated foci quantification for scalable assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker evaluation with disease-relevant 3D models, improving translational continuity.
- Supports preclinical assessment of drug response and resistance mechanisms in patient-derived systems.
- Provides a platform for evaluating temporal and spatial dynamics of DNA repair proteins in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence assay positions within the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational biomarker validation in ovarian cancer research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of DNA repair function and pathway engagement in intact organoids.
- Screening: Provides quantitative, reproducible foci counts for comparative analysis of treatment conditions.
- Analytics: Supports automated image analysis and statistical comparison of protein localization and colocalization.
- Translational Research: Connects in vitro findings to patient-relevant resistance mechanisms and biomarker profiles.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other antigens and 3D disease models for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of resistance.
- Operational Value: Standardizes immunofluorescence workflows for reproducibility and scalability in 3D models.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking biomarker dynamics to therapeutic response.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets and resistance-modifying strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D organoid culture and immunofluorescence imaging.
- Demands access to confocal microscopy and automated image analysis software.
- Necessitates careful handling to preserve organoid integrity during processing.
- Standardization across teams is essential for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to other tumor types or antigens may require protocol optimization.
