Name: Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Scopri due metodi innovativi di fenotipizzazione per analizzare lo sviluppo degli stomi in Arabidopsis utilizzando la colorazione con blu di toluidina O. Queste tecniche permettono di studiare i pattern epidermici senza sostanze tossiche.

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Questa ricerca è stata finanziata attraverso il programma Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery e la Concordia University. K.B. è supportato dalla borsa di studio nazionale d'oltremare dall'India.

1. Colorazione dei cotiledoni di Arabidopsis con TBO
<ol><li>Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita<ol><li>Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis per genotipo in una provetta da microcentrifuga aggiungendo 1 ml di una soluzione di sterilizzazione dei semi (33% di candeggina commerciale, 0,1% Triton X-100) e dosare delicatamente per 10-12 minuti a temperatura ambiente (RT). NOTA: Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis shire (Col-0) e/o ~60 semi di piante transgeniche portatrici di un gene chimicamente inducibile (ad esempio, Est::EPF27) per utilizzare piantine transgeniche coltivate su 1/2 piastre di Murashige e Skoog (MS) (2,16 g/L contenenti 0,8% di agar [p/v]) senza induttore (ad esempio, β-estradiolo) come controlli (Figura 1 e Figura 2).</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di sterilizzazione, lavare i semi quattro volte con 1 ml di acqua sterile in una cappa a flusso laminare e risospenderli in ~ 200 μL di agar sterile allo 0,1%.</li>
		<li>Seminare ~30 semi per genotipo su piastre di agar 1/2 MS o 1/2 piastre di agar MS contenenti un induttore (ad esempio, 10 μM β-estradiolo) per l'induzione chimica del transgene (ad esempio, Est::EPF27) usando una pipetta e sigillare con nastro micropore. NOTA: I semi devono essere distribuiti uniformemente sul piatto per evitare di metterli nelle immediate vicinanze, in quanto ciò impedirà alle piantine di crescere uniformemente.</li>
		<li>Stratificare i semi ponendo le piastre a 4 °C senza luce per 3-5 giorni per sincronizzare la germinazione.</li>
		<li>Dopo la stratificazione, incubare le placche in una camera di crescita a 22 °C sotto 120 μmol·m−2·s−1 di luce con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio per 10 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Campionamento e colorazione TBO di Arabidopsis cotiledoni<ol><li>A 10 giorni dalla germinazione, selezionare attentamente e ritagliare uno dei cotiledoni dalle singole piantine che crescono uniformemente con altre piantine sul piatto per limitare la variabilità. NOTA: I cotiledoni sono campionati da piantine di 10 giorni perché non hanno tricomi e cellule epidermiche immature, il che semplifica l'interpretazione dei fenotipi epidermici.</li>
		<li>Porre ciascun cotiledone in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di una soluzione di fissaggio (etanolo 9:1 in acido acetico) usando una pinza e lasciare il campione nella soluzione di fissaggio per una notte, almeno e a temperatura ambiente. NOTA: I campioni possono quindi essere conservati fino a un paio d'anni in questa condizione. L'immagine Figura 2E è stata presa da un campione di cotiledone che è stato conservato in soluzione di fissaggio per oltre 3 anni. È importante conservare il cotiledone in una soluzione di fissaggio immediatamente dopo il taglio e posizionare non più di cinque cotiledoni in ciascuna provetta da microcentrifuga per una successiva preparazione omogenea del campione.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di fissaggio e aggiungere 1 mL di etanolo al 70%. Dopo aver invertito il tubo un paio di volte, lasciare il tubo contenente i campioni a RT per ~ 30 min.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.2.3 utilizzando 1 ml di etanolo al 50% e poi al 20% di etanolo.</li>
		<li>Sostituire 1 mL di etanolo al 20% con 1 mL di acqua distillata, quindi lasciare il tubo contenente i campioni di cotiledone per ~ 30 minuti dopo aver invertito il tubo alcune volte. NOTA: I campioni possono rimanere in acqua distillata per più di 24 ore, ma questo non è raccomandato per ottenere immagini di buona qualità (immagini ben colorate per diversi tipi di cellule epidermiche) per l'analisi quantitativa.</li>
		<li>Rimuovere tutta l'acqua distillata dal tubo. Quindi, aggiungere immediatamente ~ 200 μL di soluzione colorante TBO (0,5% TBO in H 2 O, filtrato) per ~2min. NOTA: Assicurarsi che ogni campione di cotiledone sia uniformemente esposto alla soluzione TBO facendo scorrere delicatamente le provette durante l'incubazione. Per evitare la sovracolorazione con TBO (la tempistica della colorazione è essenziale e può essere variabile per ciascun genotipo), non elaborare più di sei provette contenenti campioni alla volta.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione colorante TBO il più accuratamente possibile, quindi lavare immediatamente i campioni un paio di volte aggiungendo 1 ml di acqua distillata fresca.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging e analisi dei dati<ol><li>Prendi un vetrino da microscopio e aggiungi una goccia di glicerolo al 15% (~ 50 μL). Posizionare il cotiledone con il lato abassiale verso l'alto in glicerolo al 15% sul vetrino usando una pinza fine. Quindi, coprirlo delicatamente con un vetrino di copertura in modo che eventuali bolle d'aria formate possano essere rimosse dal campione.</li>
		<li>Immagine del lato abassiale dell'epidermide cotiledone utilizzando un microscopio a campo luminoso (Figura 1 e Figura 2), quindi esaminare il fenotipo epidermico contando il numero di stomi e altri tipi di cellule epidermiche.</li>
		<li>Per ogni genotipo, calcolare il fenotipo epidermico utilizzando le seguenti formule descritte da Jangra et al.17: Indice stomatico (%) = (Numero di stomi/Numero totale di cellule epidermiche) × 100 Densità stomatica (mm−2) = Numero di stomi/Area (mm2) NOTA: Immagine di almeno otto cotiledoni (N = 8) per ciascun genotipo e documentare il fenotipo epidermico di ciascun genotipo confrontandolo con il fenotipo della pianta wild-type e/o delle piante transgeniche che esprimono un transgene chimicamente inducibile coltivato senza induttore.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Biosaggi per peptidi stomatici
NOTA: la procedura per i test biologici è illustrata nella Figura 3.
<ol><li>Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita<ol><li>Sterilizzare ~ 25 semi per ogni trattamento come sopra e seminare circa la metà dei semi su ciascuna delle due piastre di agar 1/2 MS in una cappa a flusso laminare. NOTA: Utilizzare il genotipo con cellule epidermiche alte e/o basse (ad esempio, epf22) invece di utilizzare uno sfondo wild-type (ad esempio, Col-0) per rilevare facilmente le attività biologiche dei peptidi sul pattern e sulla differenziazione delle cellule epidermiche (Figura 4).</li>
		<li>Stratificare i semi per 3 giorni a 4 °C al buio.</li>
		<li>Estrarre ciascuna delle due piastre ad intervalli di ~10 ore e incubare i semi su piastre a 22 °C sotto 120 μmol·m−2·s−1 di luce con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio per 1 giorno.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento e imaging dei peptidi<ol><li>In una cappa a flusso laminare, trapiantare con cura 10-12 piantine di Arabidopsis vecchie di un giorno da ciascuna delle due piastre preparate in una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo liquido 1/2 MS in ciascun pozzetto (~ 20 piantine per pozzetto). NOTA: La tempistica del trattamento peptidico per le piantine è fondamentale per gli esiti fenotipici del trattamento peptidico, quindi preparare i semi su due piastre separate per ottenere due diverse fasi di sviluppo della piantina per il trattamento.</li>
		<li>Aggiungere un tampone da solo (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) o due diverse concentrazioni del peptide (tipicamente, 1 μM e 2,5 μM peptide in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) a ciascun pozzetto contenente ~ 20 piantine di Arabidopsis di un giorno germinate su piastre di agar 1/2 MS. NOTA: Rimuovere le aliquote della soluzione peptidica da un congelatore e tenerle a RT per alcuni minuti prima del trattamento. I peptidi conservati in un congelatore a -80 °C sono stabili per un paio d'anni, ma i cicli di congelamento-scongelamento dovrebbero essere evitati conservando la soluzione peptidica in piccole aliquote.</li>
		<li>Dopo aver mescolato delicatamente le piantine con un tampone da solo o una soluzione peptidica usando una pipetta, sigillare la piastra con nastro a micropori. Incubare la piastra di analisi in condizioni di lunga giornata (fotoperiodo 16 ore, 120 μmol·m−2·s−1 luce) per 5-7 giorni a 22 °C. NOTA: Evitare che le piantine crescano troppo vicine tra loro per consentire a ciascuna piantina di avere un'esposizione uniforme alla soluzione peptidica. Ruotare delicatamente la piastra per 2-3 ore prima di incubare la piastra in una camera di crescita per aumentare l'aerazione.</li>
		<li>Trasferire ogni piantina dal pozzetto contenente tampone da solo o peptide su un vetrino di copertura e sezionare il cotiledone della piantina. Posizionare il lato abassiale del cotiledone usando una pinza e tagliarlo a pezzetti.</li>
		<li>Prendi un altro vetrino da microscopio pulito e posiziona su di esso una goccia di soluzione di ioduro di propidio (~ 25 μL, 2 mg / ml in H2O).</li>
		<li>Posizionare uno dei piccoli pezzi di cotiledone in una goccia di soluzione di ioduro di propidio usando una pinza e posizionare delicatamente il vetrino di copertura. Applicare un'ulteriore soluzione di ioduro di propidio sul bordo del coprivetrino per rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate.</li>
		<li>Immagine del lato abassiale del cotiledone usando un microscopio confocale e confronta le immagini con le immagini di piantine coltivate in mezzo 1/2 MS contenente solo tampone. NOTA: Le immagini presentate nella Figura 4 sono state prese da piantine selvatiche Col-0 o epf22,5 che sono state trattate solo con tampone (Figura 4A, B) o due lotti di soluzione peptidica EPF2 (Figura 4C-F) e sono state conservate a -80 °C per 1 anno.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Nadeau, J. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stomatal+distribution+on+the+Arabidopsis+leaf+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface.</a> Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+Arabidopsis+SERK+family+receptor-like+kinases+in+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning.</a> Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).</li>
<li>Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+stomatal+initiation+is+controlled+by+MAPK-mediated+regulation+of+the+bHLH+SPEECHLESS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS.</a> Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Theunissen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+studying+grass+leaf+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An improved method for studying grass leaf epidermis.</a> Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).</li>
<li>Venkata, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crw1--A+novel+maize+mutant+highly+susceptible+to+foliar+damage+by+the+western+corn+rootworm+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle.</a> PLoS One. 8 (8), 71296(2013).</li>
<li>Tucker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+small+RNA+pathways+promote+the+mitotic+events+of+megagametogenesis+during+female+reproductive+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis.</a> Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).</li>
<li>Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NMR+structure+of+stomagen+reveals+the+basis+of+stomatal+density+regulation+by+plant+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones.</a> Nature Communications. 2, 512(2011).</li>
<li>Jangra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+antagonistic+EPF+peptides+optimize+grass+stomatal+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation.</a> Development. 148 (16), (2021).</li>
<li>Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+and+phloem+transcriptomes+from+secondary+tissues+of+the+Arabidopsis+root-hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl.</a> Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+inflorescence+architecture+by+intertissue+layer+ligand-receptor+communication+between+endodermis+and+phloem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).</li>
<li>Tameshige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+peptide+and+its+receptors+shape+the+auxin+response+pattern+and+leaf+margin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis.</a> Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).</li>
<li>Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+signaling+specificity+in+Arabidopsis+by+spatially+restricted+buffering+of+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions.</a> The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).</li>
<li>Uchida, N., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+vascular+stem+cells+by+endodermis-derived+EPFL-family+peptide+hormones+and+phloem-expressed+ERECTA-family+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).</li>
<li>Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPFL+Signals+in+the+boundary+region+of+the+SAM+restrict+its+size+and+promote+leaf+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation.</a> Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).</li>
</ol>

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

I due metodi di analisi fenotipica per identificare e caratterizzare i geni che controllano il pattern stomatico e la differenziazione qui presentati sono saggi convenienti e affidabili poiché i protocolli non richiedono l'uso di peeling epidermici e attrezzature specializzate (che richiedono tempo e richiedono una formazione speciale per la preparazione del campione) ma producono immagini di alta qualità per l'analisi quantitativa dei fenotipi epidermici.
Una limitazione di questa tecnica per...

Il corretto pattern e differenziazione degli stomi vegetali sono fondamentali per la loro funzione in due processi biologici fondamentali, la fotosintesi e la traspirazione, e sono applicati dalle vie di segnalazione del peptide EPF. In Arabidopsis, tre peptidi ricchi di cisteina secreti, EPF1, EPF2 e STOMAGEN / EPFL9, controllano diversi aspetti dello sviluppo stomatico e sono percepiti dai componenti del recettore della superficie cellulare, tra cui le chinasi del recettore della famiglia ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERK e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Questo riconoscimento porta quindi alla downregulation dei fattori di trascrizione che promuovono la differenziazione stomatica mediante un processo MAPK-dipendente11. La scoperta di questi geni stomatici fondamentali è ottenuta principalmente dallo screening fenotipico di mutanti che presentano difetti epidermici. Questo articolo presenta metodi di fenotipizzazione relativamente semplici ed efficienti per visualizzare gli stomi e altre cellule epidermiche, che sono necessari per identificare e caratterizzare i potenziali geni che controllano il pattern e la differenziazione stomatica.
L'osservazione dei dettagli dell'epidermide vegetale è stata tipicamente ottenuta utilizzando peeling epidermici con o senza colorazione con un colorante come il blu di toluidina O (TBO) o la safranina12,13,14. Tuttavia, la sfida principale di questi metodi è che richiedono una formazione specializzata per sbucciare l'epidermide fogliare senza strappare i tessuti e per osservare e analizzare attentamente i dati di pattern evitando le immagini prese da diverse parti della foglia. Anche i trattamenti chimici per eliminare i campioni di tessuto con reagenti come le soluzioni di clearing a base di cloralio idrato sono stati ampiamente utilizzati per una vasta gamma di materiali biologici 8,15; Questi trattamenti generano una grande quantità di informazioni fenotipiche fornendo immagini di alta qualità, ma richiedono anche l'uso di sostanze chimiche pericolose (ad esempio, formaldeide, idrato di cloralio). Questo documento presenta innanzitutto un metodo di fenotipizzazione relativamente facile e conveniente che produce immagini sufficienti per l'analisi quantitativa, ma non richiede l'uso di sostanze chimiche pericolose e bucce fogliari epidermiche per la preparazione del campione. Un'epidermide cotiledonica colorata con TBO è ideale anche per lo studio dello sviluppo stomatico perché la mancanza di tricomi e il minore gradiente di sviluppo nei cotiledoni consentono l'interpretazione semplice e trattabile dei fenotipi epidermici.
I peptidi EPF stomatici appartengono al gruppo di peptidi ricchi di cisteina specifici per le piante che hanno dimensioni mature relativamente grandi e legami disolfuro intramolecolari tra residui di cisteina conservati. Il corretto ripiegamento conformazionale è fondamentale per la loro funzione biologica, ma i peptidi ricchi di cisteina, che sono prodotti dalla sintesi chimica o da un sistema di ricombinazione eterologo, possono essere inattivi e sono una miscela dipeptidi 3,7,16 correttamente piegati e dispiegati. Pertanto, lo screening dei peptidi bioattivi che hanno un ruolo nel controllo dello sviluppo stomatico è stato un compito molto impegnativo. Questo manoscritto descrive inoltre un saggio biologico per una migliore identificazione e caratterizzazione dei peptidi stomatici bioattivi. In questo metodo, le piantine di Arabidopsis vengono coltivate in una piastra multi-pozzetto contenente mezzi con e senza potenziali peptidi per 6-7 giorni. Quindi, l'epidermide cotiledone viene visualizzata utilizzando un microscopio confocale. In generale, per visualizzare chiaramente l'attività biologica di potenziali peptidi nello sviluppo stomatico, vengono utilizzati i genotipi che producono più e/o meno cellule della linea stomatica, come il mutante epf2, che produce più cellule epidermiche, e la linea STOMAGEN-ami, che conferisce una ridotta densità delle cellule epidermiche 2,4,5, in aggiunta al controllo wild-type Arabidopsis (Col-0) per i saggi biologici.
Nel complesso, i due protocolli qui presentati possono essere utilizzati per la valutazione rapida ed efficiente di vari fenotipi epidermici e per lo screening di piccoli peptidi e ormoni che hanno un ruolo nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico.

<table><tbody><tr><td>Vetrino coprioggetto 18 mm x 18 mm</td><td>VWR</td><td>16004-326</td><td></td></tr><tr><td>Piastre sterili a 24 pozzetti con coperchio</td><td>VWR</td><td>CA62406-183</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico 3M Micropore</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td>Nastro di carta chirurgica microporosa utilizzato per sigillare le piastre MS</td></tr><tr><td>76 x 26 mm Vetrino per microscopio</td><td>TLG</td><td>GEW90-2575-03</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico, &ge; 99,8%&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>Bleech</td><td>Candeggina per uso domestico (ad es. Clorox)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td>Nikon C2 gestito da NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Greenfield</td><td>P210EAAN</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open-srouce</td> <td>(Fiji è solo) ImageJ v2.1 / 1.5.3j</td><td>Scaricato da https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Pinza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miscela vitaminica di Gamborg</td><td>Cassson Labs</td><td>GBL01-100ML</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Camere di crescita</td><td>Conviron,&nbsp; modello E15</td><td></td><td>ciclo di luce 16h, impostato a 21&deg; C con un'intensità luminosa di 120 &micro; mol&middot; m-2&middot; s-1.</td></tr><tr><td>Luci</td><td>HD Supply</td><td>25272</td><td>Luci fluorescenti nelle camere di crescita, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td>Provette in cui vengono inseriti i semi di Arabidopsis thaliana per eseguire la sterilizzazione</td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE dotato di fotocamera digitale DsRi2</td></tr><tr><td>Murashige e sali basali Skoog</td><td>Cassson Labs</td><td>MSP01-1LT</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11Z</td><td>Piastre di Petri in cui viene versato il terreno MS allo scopo di coltivare Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Propidium Iodide&nbsp;</td><td>VWR</td><td>39139-064</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>BioShop</td><td>SUC700.5</td><td></td></tr><tr><td>Blu di toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Gli stomi sono piccoli pori sulla superficie delle piante terrestri che sono coinvolti nello scambio di gas e nel rilascio di vapore acqueo e la loro funzione è fondamentale per la produttività e la sopravvivenza delle piante. Come tale, comprendere i meccanismi con cui gli stomi si sviluppano e modellano ha un enorme valore agronomico. Questo articolo descrive due metodi fenotipici che utilizzano Arabidopsis cotiledoni che possono essere utilizzati per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo e il pattern stomatico. Le prime sono le procedure per l'analisi dei fenotipi stomatici utilizzando cotiledoni blu O-colorati con toluidina. Questo metodo è veloce e affidabile e non richiede l'uso di peeling epidermici, che sono ampiamente utilizzati per le analisi fenotipiche ma richiedono una formazione specializzata. A causa della presenza di residui multipli di cisteina, l'identificazione e la generazione di peptidi EPF bioattivi che hanno un ruolo nello sviluppo stomatico sono stati impegnativi. Pertanto, il secondo è presentato è una procedura utilizzata per identificare i ligandi stomatici e monitorare la loro attività biologica mediante saggi biologici. Il vantaggio principale di questo metodo è che produce dati riproducibili in modo relativamente semplice, riducendo la quantità di soluzione peptidica e il tempo necessario per caratterizzare il ruolo dei peptidi nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico. Nel complesso, questi protocolli ben progettati migliorano l'efficienza dello studio dei potenziali regolatori stomatici, compresi i peptidi secretori ricchi di cisteina, che richiedono strutture altamente complesse per la loro attività.

Varie piante transgeniche stomatiche e mutanti noti per avere meno o più densità stomatica e clustering (epf2 2,5, epf1 epf22,5, tmm12, una linea STOMAGEN-silenziata 4, e linee transgeniche che trasportano il costrutto di sovraespressione Est::EPF1 o Est::EPF2 7 ) sono stati util...

Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l'uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un'epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

I due metodi di analisi fenotipica qui presentati offrono immagini di alta qualità che sono sufficienti per condurre analisi fenotipiche quantitative e per dimostrare le risposte fenotipiche del trattamento peptidico con dettagli epidermici. Di conseguenza, questi due metodi possono essere utilizzati per comprendere il pattern e lo sviluppo delle cellule epidermiche. Questi due metodi sono tecniche relativamente facili e affidabili in quanto non richiedono sostanze chimiche tossiche o pezzi epidermici ampiamente utilizzati per l'analisi fenotipica epidermica.Tuttavia, le tecniche sono complicate e richiedono una formazione specializzata. Per iniziare, selezionare attentamente e ritagliare uno dei cotiledoni dalle singole piantine che crescono uniformemente con altre piantine sul piatto per limitare la variabilità. Porre ciascun cotiledone in una provetta da microcentrifuga contenente un millilitro di una soluzione di fissaggio con una pinza e lasciare il campione nella soluzione di fissaggio per una notte a temperatura ambiente.Rimuovere la soluzione di fissaggio e aggiungere un millilitro di etanolo al 70%. Capovolgere il tubo un paio di volte e lasciare il tubo contenente i campioni a temperatura ambiente per circa 30 minuti. Ripeti questo passaggio usando un millilitro di etanolo al 50% e poi al 20% di etanolo.Sostituire un millilitro di etanolo al 20% con un millilitro di acqua distillata, capovolgere il tubo contenente i campioni di cotiledone alcune volte e lasciarlo per circa 30 minuti. Rimuovere tutta l'acqua distillata dal tubo e aggiungere immediatamente circa 200 microlitri di soluzione colorante Toluidina Blue O o TBO per circa due minuti. Rimuovere la soluzione colorante TBO il più accuratamente possibile e quindi lavare immediatamente i campioni un paio di volte aggiungendo un millilitro di acqua distillata fresca.In una cappa a flusso laminare, trapiantare con cura da 10 a 12 piantine di Arabidopsis di un giorno da ciascuna delle due piastre preparate in una piastra da 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di mezzo liquido mezzo MS in ciascun pozzetto. Aggiungere 50 millimolari tampone tris HCL da solo o due diverse concentrazioni del peptide a ciascun pozzetto contenente le piantine germinate su mezze piastre di agar MS. Mescolare delicatamente le piantine con il tampone da solo o una soluzione peptidica usando una pipetta e sigillare la piastra con nastro micropore.Incubare la piastra di analisi in condizioni di lunga giornata per cinque-sette giorni a 22 gradi Celsius. Trasferire la piantina dal pozzo su un vetrino di copertura e sezionare il cotiledone della piantina. Posizionare il lato abassiale del cotiledone usando una pinza e tagliarlo a pezzetti.Prendi un altro vetrino da microscopio pulito e posiziona una goccia di soluzione di ioduro di propidio su di esso. Posizionare uno dei piccoli pezzi di cotiledone nella goccia usando una pinza e posizionare delicatamente il coprifoglio. Applicare un'ulteriore soluzione di ioduro di propidio sul bordo del coprivetrino per rimuovere eventuali bolle d'aria che si formano.Immagine del lato abassiale del cotiledone usando un microscopio confocale e confronta le immagini con le immagini di piantine coltivate in mezzo MS contenente solo tampone. Qui sono mostrate immagini di cotiledoni abassiali da piantine di 10 giorni di tre genotipi di Arabidopsis, wild type, una linea silenziata STOMAGEN e mutanti epf1 epf2. Qui, la linea silenziata STOMAGEN rappresenta i genotipi con basso numero di stomi e i mutanti epf1 epf2 rappresentano i genotipi con un alto numero di stomi.Le immagini rappresentative dell'epidermide di cotiledoni da piantine di 10 giorni di wild type, tmm e linee transgeniche portatrici di un costrutto di sovraespressione epf2 o epf1 inducibile da estradiolo sono state utilizzate per l'analisi quantitativa del fenotipo epidermico. In questa figura sono mostrate le immagini confocali rappresentative del wild type e dell'epidermide cotiledonica epf2 coltivata per sei-sette giorni in una soluzione tampone e di un'epidermide cotiledonica epf2 coltivata con due diversi lotti di peptidi epf2. Eseguendo questa procedura, assicurati di tagliare uno dei cotiledoni da una singola piantina che sta già crescendo uniformemente con le altre piantine.Scegli anche una piantina che non tocchi il supporto MS per limitare la variabilità. Un altro punto da ricordare è che non posizionare più di cinque cotiledoni in una singola provetta di microcentrifuga. Inoltre, sfiorare delicatamente il tubo per garantire una distribuzione uniforme delle macchie TBO intorno ai cotiledoni per colorarli bene.Considerando l'esistenza di più peptidi strutturali in una soluzione peptidica, questo metodo di saggio biologico sarà molto utile per l'identificazione di forme di peptide correttamente piegate e bioattive e le loro funzioni biologiche.

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Abbiamo sviluppato un protocollo semplice e riproducibile per l'accesso risposta stomatica di batteri vivi. Questo metodo riduce ferimento e la manipolazione della foglia rispetto all'utilizzo di bucce epidermica riferito in precedenza.

Valutazione della risposta stomatica a Live cellule batteriche utilizzando Imaging Whole Leaf

Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine ​​fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Svelare come la fisiologia e la morfologia sono collegati permette una più profonda comprensione meccanicistica funzionamento di foglie delle piante. Vi presentiamo sia una procedura per ricavare i parametri di regolazione degli stomi da misure conduttanza stomatica e correlazioni con tradizionali tratti fogliari funzionali.

Relative conduttanza stomatica a Leaf tratti funzionali

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come monitorare la dinamica delle proteine ​​fluorescenti-taggato sulla superficie delle cellule di piante con variabile angolo epifluorescenza, mostrando punti di GFP-tagged PATROL1, una proteina del traffico di membrana a lampeggiare, nella corteccia cella del complesso stomi in Arabidopsis thaliana.

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A livello subcellulare, gli eventi di segnalazione sono modulati dinamicamente da segnali di sviluppo e ambientali. Qui descriviamo un protocollo che impiega il sistema di espressione transitoria del tabacco per monitorare l'interazione dinamica proteina-proteina e per rivelare l'organizzazione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Questo protocollo descrive un metodo di preparazione arricchite stomatica cellule di guardia che è utile per gli studi biologici fisiologici e altri.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

Forniamo un metodo per identificare i modulatori della traspirazione fogliare mediante lo screening su larga scala di una libreria composta.

Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus

Tradurre la purificazione dell'affinità di ribosomi (TRAP) offre la possibilità di sezionare programmi di sviluppo con una minima elaborazione di organi e tessuti. Il protocollo produce RNA di alta qualità da cellule mirate con una sottounità ribosomica denominata GFP (Proteina fluorescente verde). Gli strumenti di analisi a valle, come qRT-PCR o RNA-seq, rivelano profili di espressione specifici del tessuto e del tipo di cellula.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

Diversi metodi comunemente usati sono introdotti qui per studiare gli eventi di traffico di membrana di una chinasi del recettore della membrana plasmatica. Questo manoscritto descrive protocolli dettagliati tra cui la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale.

Metodi basati su immagini per studiare eventi di traffico di membrana in cellule di lignaggio stomatico

Qui, presentiamo un metodo semplice per l'osservazione diretta e la misurazione automatizzata delle risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana. Questo metodo sfrutta un dispositivo di imaging stomatico portatile, insieme a una pipeline di analisi delle immagini progettata per le immagini delle foglie catturate dal dispositivo.

Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana

Questo protocollo presenta un metodo comparativo per valutare i tratti stomatici ed epidermici in due specie distinte utilizzando peeling epidermici, tecniche di clearing e analisi delle immagini assistite dall'IA. L'obiettivo è permettere la quantificazione ad alta produttività e riproducibile delle strutture cellulari alla base della funzione stomatica per applicazioni agricole e ricerche vegetali su larga scala.

Caratterizzazione dei tratti stomatici ed epidermici tramite peel, clearing e analisi delle immagini basate su IA

Scopri due metodi innovativi di fenotipizzazione per analizzare lo sviluppo degli stomi in Arabidopsis utilizzando la colorazione con blu di toluidina O. Queste tecniche permettono di studiare i pattern epidermici senza sostanze tossiche.

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

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