Name: Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri la caratterizzazione funzionale dei fibroblasti esofagei mediante co-colture con organoidi e imaging whole mount. Questo metodo permette di studiare le interazioni fibroblasto-progenitore nella nicchia staminale.

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Questo studio è stato sostenuto dal CER StG TroyCAN (851241). E.E. è un associato post-dottorato Cancerfonden. M.G. è Ragnar Söderberg Fellow e Cancerfonden Junior Investigator. Siamo grati per l'assistenza tecnica delle strutture principali del Karolinska Institutet, tra cui la Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, il Biomedicum Imaging Core (BIC) e la struttura per animali Comparative Medicine Biomedicum (KMB). Ringraziamo i membri del laboratorio Genander per aver attentamente letto e commentato il protocollo.

<ol><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>McGinn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomechanical+switch+regulates+the+transition+towards+homeostasis+in+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium.</a> Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+stem+cells+of+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development and stem cells of the esophagus.</a> Development. 148 (6), (2021).</li>
<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
<li>Pentinmikko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+produced+by+Paneth+cells+attenuates+regeneration+of+aged+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium.</a> Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).</li>
<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Il protocollo qui presentato stabilisce un modello in vitro per lo studio delle interazioni funzionali epiteliali-fibroblasti esofagei.
Lo strato epiteliale è separato dallo stroma, consentendo un protocollo di dissociazione ottimizzato sia per il compartimento epiteliale che per quello stromale. Nonostante l'ottimizzazione del protocollo di dissociazione epiteliale, i grumi di tessuto rimangono evidenti. Il pipettaggio su e giù vigorosamente ogni 15 minuti diminuisce sostanzialmente il numero e le dimensioni dei grumi. Altri protocolli utilizzano la tripsina per dissociare ulteriormente lo strato epiteliale 5,6. Qui, l'uso di tripsina, o aumentare ulteriormente il tempo di dissociazione, non è raccomandato, in quanto ciò tende a provocare una diminuzione della vitalità delle cellule epiteliali e dell'efficienza di formazione degli organoidi. In contrasto con l'epitelio, lo stroma è facilmente dissociato e 30 minuti in soluzione di dissociazione si traduce in una sospensione unicellulare con ~ 90% di vitalità dei fibroblasti (Figura 1E). L'esclusione della fase di separazione epiteliale-stomale nel protocollo aumenta sostanzialmente il tempo di dissociazione, con conseguente diminuzione della vitalità dei fibroblasti e una minore resa delle cellule epiteliali. Inoltre, separare l'epitelio dallo stroma offre l'opportunità di determinare il numero di cellule di ciascuna popolazione e mescolare cellule epiteliali e fibroblasti di diverse linee di topo durante la creazione delle co-colture.
Lo studio della funzione dei fibroblasti sulla crescita organoide è un metodo comunemente usato nella biologia delle cellule staminali 9,10,11,15,16. I terreni di co-coltura consolidati sono DMEM integrato con siero fetale di vitello al 10% (FCS)9,15 o con fattore di crescita ridotto10,16. In questo protocollo, il mezzo ridotto del fattore di crescita viene utilizzato per imitare le condizioni nella nicchia delle cellule staminali in vivo, dove i fibroblasti sono in gran parte quiescenti. FCS è un siero ricco di fattori di crescita che provoca l'attivazione e la proliferazione dei fibroblasti nelle co-colture, probabilmente corrispondente a uno stato cellulare di fibroblasti distinto dallo stato in vivo. Escludendo la FCS e riducendo i fattori di crescita, in modo che il mezzo da solo (ERbasso) non supporti la crescita organoide e non stimoli la proliferazione dei fibroblasti, è possibile isolare l'effetto dei fibroblasti sulla crescita degli organoidi. In questo mezzo, NOGGIN viene rimosso e RSPO ridotto al minimo (10% RPSO). Sia NOGGIN che RSPO hanno dimostrato di essere essenziali per la crescita degli organoidi esofagei6. L'EGF è stato mantenuto nel mezzo di cocoltura, in quanto non supporta di per sé la crescita degli organoidi. Tuttavia, i fibroblasti sono anche in grado di supportare la crescita organoide in un mezzo ridotto di EGF (E basso Rbasso; Figura 2B,D).
Le co-colture organoidi non possono essere sostenute attraverso il passaggio poiché i fibroblasti vengono persi durante la tripsinizzazione. Tuttavia, il passaggio degli organoidi è stato incluso nel protocollo poiché gli organoidi esofagei possono essere mantenuti, ampliati e utilizzati per ulteriori esperimenti come mono-colture. Gli organoidi passati da monocolture possono essere utilizzati per creare co-colture con fibroblasti appena isolati. Uno svantaggio dell'uso di cellule primarie è il numero di topi necessari per creare più co-colture di organoidi. Quando ci si concentra su piccole sottopopolazioni di fibroblasti, il numero di co-colture ottenute è limitato. In altri protocolli, i fibroblasti vengono prima espansi in coltura prima di utilizzarli per creare co-colture organoidi10. Tuttavia, i fibroblasti cambiano morfologia e identità durante il passaggio, come dimostrato utilizzando fibroblasti primari cutanei e cardiaci17,18. Il passaggio 2D convenzionale dei fibroblasti esofagei provoca cambiamenti sia di morfologia che di fenotipo, dimostrando che l'arricchimento in vitro dei fibroblasti non è adatto per le co-colture che mirano a fenocopiare la nicchia delle cellule staminali endogene.
La colorazione a montaggio intero fornisce uno strumento per mantenere e visualizzare l'interazione fibroblasto-organoide. Va notato che, mentre non tutti gli organoidi avranno fibroblasti direttamente attaccati ad essi, la maggior parte degli organoidi sono in contatto con fibroblasti (vedi Figura 2C). Per mantenere le interazioni epiteliali-fibroblasti, è importante maneggiare gli organoidi con cura ed evitare il pipettaggio vigoroso, il vortice e la rotazione ad alta velocità. La fissazione ottimale è importante per mantenere l'architettura tissutale 3D e mantenere la fluorescenza endogena. Una fissazione di 30 minuti è sufficiente per mantenere il segnale H2BeGFP ed è ottimale per gli anticorpi utilizzati in questo protocollo, tuttavia questo potrebbe variare tra i fluorofori e gli anticorpi utilizzati. La pulizia degli organoidi riduce la dispersione della luce e migliora sostanzialmente la visualizzazione dell'intera struttura 3D. Poiché gli organoidi sono piccoli, la pulizia è facile e veloce; tuttavia, l'imaging di interi organoidi utilizzando la microscopia confocale a scansione laser può richiedere molto tempo, poiché è necessario creare più stack Z. I microscopi confocali, come il disco rotante, possono essere utilizzati per ridurre i tempi di imaging.
Nel complesso, gli organoidi esofagei cresciuti in presenza di fibroblasti forniscono uno strumento prezioso per comprendere aspetti della nicchia delle cellule staminali esofagee. Inoltre, la compensazione dell'intera montatura fornisce un metodo accessibile per visualizzare l'interazione tra fibroblasti e organoidi.

Gli organoidi sono utilizzati come saggi 3D in vitro per caratterizzare le cellule staminali e progenitrici, nonché per comprendere i segnali di segnalazione derivati dai componenti cellulari della nicchia delle cellule staminali 1,2,3,4. Gli organoidi esofagei di topo sono stati descritti per la prima volta nel 2014 e diversi articoli hanno identificato fattori di crescita, come R-Spondin (RSPO), NOGGIN e fattore di crescita epidermico (EGF), necessari per mantenere e passare gli organoidi esofagei 5,6,7, sostenendo che segnali di segnalazione simili sono necessari per in vivo Rinnovamento delle cellule progenitrici. Tuttavia, i fattori di crescita sono comunemente aggiunti in concentrazioni non fisiologiche, con conseguenti condizioni di crescita organoide che non riflettono necessariamente l'ambiente di segnalazione in vivo.
I fibroblasti sono popolazioni eterogenee di cellule stromali che supportano le proprietà delle cellule progenitrici in molte nicchie di cellule staminali8. La combinazione di cellule progenitrici epiteliali e fibroblasti nella stessa coltura organoide consente la formazione di organoidi in concentrazioni ridotte di fattori di crescita integrati esogenamente. Sono descritti sistemi di co-coltura organoidi da epiteli intestinali ed epatici, ma un protocollo per stabilire co-colture organoidi-fibroblasti esofagei è ancora in sospeso 9,10,11.
In questo protocollo, vengono delineate due strategie di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per i fibroblasti dall'esofago, utilizzando topi transgenici PdgfrαH2BeGFP 12 o topi wild-type con colorazione anticorpale classica. Diverse sottopopolazioni di fibroblasti possono essere isolate utilizzando marcatori di superficie cellulare di scelta, fornendo così flessibilità al protocollo. Inoltre, una tecnica di imaging a fluorescenza 3D che preserva la morfologia organoide viene utilizzata per caratterizzare le interazioni fibroblasto-organoide. La pulizia degli organoidi fornisce un metodo rapido per aumentare la profondità di penetrazione della luce negli organoidi, migliorando la visualizzazione delle connessioni organoide-fibroblasti e consentendo la ricapitolazione della struttura organoide nella sua interezza. Questo protocollo combina la co-coltura di organoidi esofagei con una strategia di imaging a montaggio completo, consentendo la caratterizzazione funzionale dell'interazione fibroblasto-organoide.

<table><tbody><tr><td>Integratore di B-27 (50X), senza siero</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Matrigel&nbsp; Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR)</td><td>Fisher scientific</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Integratore</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>soluzione Triton X-100</td><td>Merck</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>25200-056<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI Soluzione</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione: 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnase in HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>Formaldeide, 37%, con 10-15% di metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetil-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murino</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>Proteina EGF di topo ricombinante, FC</td><td>R& D systems</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 murino</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Plastic & Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtri per cellule sterili 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtri per celle sterili 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl&auml; </td><td>Thermo Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>Provetta di reazione SafeSeal, 1,5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a scatto Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione 0,6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini SuperFrost</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05 mm 4 pozzetti circolari iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincipe, punta per biologia</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla angolate sulla punta laterale della sfera 8 mm Tagliente</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Stellaris 5&nbsp;</td><td>Microscopio</td> da dissezione Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi coniugati per FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-topo CD104 Antibody Clone: 346-11A</td><td></td><td>123608 123608</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo CD26 (DPP-4) Anticorpo</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-topo/umano CD324 (E-caderina) Anticorpo</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi per immunofluorescenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (&szlig;-integrina 4) Clone: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>citocheratina 14</td><td>Anticorpi Acris (AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Citocheratina13 Clone: EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-caderina (CD324) Clone: 2.40E+11</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Cheratina 5 Anticorpo policlonale di pollo, purificato Clone: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 Clone: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>Antibod ricombinante antibodbr/ Clone: EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Anticorpi secondari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-species* con fluoroforo di scelta</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Le cellule staminali epiteliali e progenitrici contribuiscono alla formazione e al mantenimento della barriera epiteliale per tutta la vita. La maggior parte delle popolazioni di cellule staminali e progenitrici sono nascoste in posizioni anatomicamente distinte, consentendo interazioni esclusive con segnali di nicchia che mantengono la staminalità. Mentre lo sviluppo di colture organoidi epiteliali fornisce un potente strumento per comprendere il ruolo delle cellule staminali e progenitrici nell'omeostasi e nella malattia, l'interazione all'interno dell'ambiente di nicchia è in gran parte assente, ostacolando così l'identificazione dei fattori che influenzano il comportamento delle cellule staminali. I fibroblasti svolgono un ruolo chiave nel dirigere il destino del tronco epiteliale e del progenitore. Qui viene presentato un protocollo completo di co-coltura organoide-fibroblasti che consente la delineazione delle sottopopolazioni di fibroblasti nel rinnovamento e nella differenziazione delle cellule progenitrici esofagee. In questo protocollo, viene descritto un metodo per isolare sia le cellule epiteliali che i fibroblasti in parallelo dall'esofago. Sono delineate distinte strategie di selezione cellulare attivate dalla fluorescenza per isolare sia le cellule progenitrici esofagee che le sottopopolazioni di fibroblasti da topi transgenici reporter o wild-type. Questo protocollo fornisce un approccio versatile che può essere adattato per adattarsi all'isolamento di specifiche sottopopolazioni di fibroblasti. La creazione e il passaggio di monocolture organoidi epiteliali esofagee è incluso in questo protocollo, consentendo un confronto diretto con il sistema di co-coltura. Inoltre, viene descritto un approccio di compensazione 3D che consente un'analisi dettagliata delle immagini delle interazioni epiteliali-fibroblasti. Collettivamente, questo protocollo descrive un metodo comparativo e relativamente ad alto rendimento per identificare e comprendere i componenti di nicchia delle cellule staminali esofagee in vitro.

L'esofago è diviso in diversi strati: epitelio, lamina propria, sottomucosa e muscularis externa (Figura 1A). I fibroblasti risiedono all'interno della sottomucosa e della lamina propria, indicata come stroma. In questo protocollo, la muscularis externa viene rimossa meccanicamente (Figura 1B), il che non porta a una perdita di fibroblasti (PdgfrαH2BeGFP+) residenti nello stroma (Figura 1C). Prima della dissociazione, l'epitelio viene separato dallo stroma risultando in due segmenti di tessuto (Figura 1B). La separazione dei due strati offre l'opportunità di aumentare il tempo di dissociazione per lo strato epiteliale più robusto rispetto allo strato stromale fragile. In questo modo, viene stabilito un protocollo di isolamento efficiente che produce sia cellule progenitrici epiteliali vitali che fibroblasti stromali (Figura 1B). Le cellule progenitrici esofagee sono classificate in base alla loro elevata espressione di INTEGRIN-β4 ed E-CADHERIN (Figura 1C,D).
Le sottopopolazioni di fibroblasti possono essere isolate utilizzando marcatori distinti. In questo protocollo, viene fornita una strategia per l'isolamento dei fibroblasti basata sui marcatori di fibroblasti comunemente usati PDGFRα e DPP4 (CD26). L'isolamento mediante l'espressione del reporter PdgfrαH2BeGFP o l'anticorpo DPP4 mostra che circa il 50% delle cellule isolate sono fibroblasti (Figura 1E,F). Inoltre, il 70% dei fibroblasti PDGFRα+ sono DPP4+, indicando che si ottiene una popolazione di fibroblasti in gran parte sovrapposta, ma non identica. Dopo aver isolato le popolazioni di cellule epiteliali e stromali, le cellule progenitrici esofagee vengono coltivate da sole o insieme ai fibroblasti in una cupola a matrice. Per studiare il contributo dei fibroblasti alla formazione di organoidi, la co-coltura viene mantenuta in un terreno ridotto dal fattore di crescita (Figura 1G).
Le cellule progenitrici esofagee formano organoidi in presenza di EGF, NOGGIN e RSPO (ENR). Rimozione di NOGGIN e riduzione della quantità di RSPO (25 ng/μL; ERbasso) è sufficiente per prevenire la formazione di organoidi (Figura 2A). È interessante notare che l'aggiunta di fibroblasti DPP4+ o PDGFRα+ alle cellule progenitrici esofageenel mezzo basso ER ripristina la capacità di formazione degli organoidi, dimostrando una funzione di supporto per entrambe le popolazioni di fibroblasti (Figura 2A-D). La visualizzazione del transgene PdgfrαH2BeGFP mostra che i fibroblasti sono in stretto contatto con le cellule progenitrici epiteliali durante la formazione degli organoidi (Figura 2A). Al giorno 6, i fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+ sono ancora abbondantemente presenti nella co-coltura. I fibroblasti sono presenti in tutta la cupola, vicino e toccando gli organoidi (freccia piena), o attaccati agli organoidi (punta di freccia; Figura 2D).
La colorazione a montaggio intero mostra una rappresentazione 3D dell'interazione dei fibroblasti con gli organoidi (Figura 3). Mentre è possibile eseguire l'intero protocollo di montaggio senza l'uso di una soluzione di clearing, diminuisce la trasparenza e la penetrazione laser dell'organoide (Figura 3B, z-view). Quando si montano gli organoidi, il distanziatore aiuta a mantenere la morfologia degli organoidi. Al contrario, placcando il coprislip direttamente sugli organoidi (senza distanziatore) appiattisce gli organoidi e provoca la perdita della struttura organoide (Figura 3A,B).
Entrambi i fibroblasti DPP4+ e PDGFRα+ sono avvolti attorno agli organoidi (Figura 3C, Video1 e Video 2). La differenziazione degli organoidi esofagei può essere valutata utilizzando diversi marcatori. La Figura 4 mostra che il protocollo di colorazione fornito è adatto per cheratine più facili da colorare (KRT14/13) e fattori di trascrizione più difficili da colorare (TRP63/KLF4). Il protocollo di co-coltura genera organoidi con un modello di differenziazione simile, come dimostrato in vivo13,14 e come visto negli organoidi coltivati in mezzo ENR; Le cellule progenitrici KRT14+ o TRP63+ formano lo strato esterno e le cellule differenziate KRT13+ o KLF4+ si orientano verso l'interno.
Questo protocollo fornisce uno strumento per studiare la nicchia delle cellule staminali esofagee in vitro e visualizza l'interazione tra organoidi e fibroblasti. Implementando un protocollo per l'isolamento dei fibroblasti utilizzando anticorpi, il metodo è adattabile e può essere utilizzato per studiare sottopopolazioni di fibroblasti senza la necessità di topi transgenici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento delle cellule progenitrici e delle sottopopolazioni di fibroblasti dall'esofago . (A) Panoramica schematica dei diversi strati dell'esofago. Lo stroma contiene la lamina propria e la sottomucosa. (B) Panoramica schematica del protocollo di isolamento. Il muscolo (muscularis externa) viene rimosso meccanicamente usando una pinza; L'esofago rimanente viene tagliato e incubato in termolisina per separare lo strato epiteliale dallo stroma. L'epitelio e lo stroma sono separati, tritati meccanicamente e digeriti enzimaticamente in sospensioni monocellulari. Le cellule dissociate vengono quindi colorate e preparate per FACS. (C) Sezione trasversale dell'esofago strappato dal muscolo esterno che mostra fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+ nello stroma. Le cellule doppie positive di INTEGRIN-β4 (ITGβ4) e E-CADERINA (ECAD) sono le cellule progenitrici epiteliali dell'esofago. Barra di scala = 100 μm. (D) Grafico rappresentativo della citometria a flusso dell'isolamento delle cellule epiteliali che mostra la percentuale di cellule vive (pannello superiore) da tutte le singole cellule. Il pannello inferiore mostra la percentuale di cellule progenitrici (Prog.) ITGβ4+ ECAD+ isolate da tutte le cellule vive. (E) Grafico rappresentativo della citometria a flusso dell'isolamento delle cellule stromali che mostra la percentuale di cellule vive (pannello in alto a sinistra). Grafici rappresentativi della citometria a flusso che mostrano la percentuale di fibroblasti DPP4+ isolati (Fibr.; pannello in alto a destra) e fibroblasti Pdgfrα+ (pannello in basso a sinistra) di tutte le cellule vive. Il 70% dei fibroblasti Pdgfrα+ sono anche DPP4+ (pannello in basso a destra). (F) Grafico rappresentativo della citometria a flusso dello stroma che mostra solo cellule DPP4+ (2,5%), cellule DPP4+ PDGFRα+ (37,5%) e solo cellule PDGFRα+ (17,7%). Le percentuali sono di tutte le cellule vive. (G) Le cellule solo epiteliali sono placcate in una cupola a matrice in presenza di 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN e 250 ng/μL RSPO (ENR), o insieme a fibroblasti in presenza di EGF e una bassa concentrazione di RSPO (25 ng/μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> Figura 2: Risultati rappresentativi delle cocolture di organoidi. (A) Immagini in campo chiaro che mostrano la crescita degli organoidi dal giorno 1 al giorno 6. Le immagini in campo chiaro con gli organoidi co-coltivati con fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+ mostrano anche il segnale nucleare eGFP. Barra di scala = 25 μm. (B) Immagini in campo chiaro dell'intera cupola della matrice al giorno 6. La colonna di sinistra mostra co-colture organoidi coltivate in presenza di fibroblasti Pdgfrα+ in ER basso o Ebasso Rbasso medio. La colonna centrale mostra co-colture organoidi coltivate in presenza di fibroblasti DPP4+ in ER basso o E bassoRbasso medio. La colonna di destra mostra monocolture organoidi coltivate in mezzo ENR. Mezzo ENR = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) e RSPO (250 ng/μL). ERbasso = EGF e 25 ng/μL RSPO. E bassoRbasso = 5 ng/μL EGF e 25 ng/μL RSPO. Barra di scala = 500 μm. (C) Grafico che mostra l'efficienza di formazione degli organoidi (%) (cioè la percentuale di cellule che formano organoidi in diverse condizioni di coltura). Ogni punto rappresenta una cupola a matrice e la barra rappresenta la media di tutti i punti per condizione. (D) Immagine in campo chiaro e fluorescente di organoidi del giorno 6 co-coltivati con fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+. I fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+ sono presenti in tutta la cupola, attaccati agli organoidi (punta di freccia) e non attaccati ma a contatto con gli organoidi (freccia completa). Barra di scala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> Figura 3: Protocollo di colorazione a montaggio intero per lo studio delle interazioni fibroblasto-organoide . (A) Panoramica schematica dell'intero protocollo di immunofluorescenza a monte. AB = anticorpo. (B) Immagine di immunofluorescenza della colorazione dell'intera montatura non cancellata che mostra una diminuzione della trasparenza e della penetrazione della luce laser rispetto agli organoidi eliminati. L'assenza di un distanziatore provoca l'appiattimento dell'organoide e la perdita della morfologia organoide. (C) Le immagini a montaggio intero degli organoidi co-coltivati mostrano superfici 3D degli organoidi con fibroblasti VIMENTINA + (Fibr.) avvolti intorno e a stretto contatto con l'organoide. Le sezioni trasversali 3D e le immagini del piano 2D mostrano il lume dell'organoide. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> Figura 4: Le immagini a montaggio intero rivelano distinte popolazioni di cellule basali e soprabasali. (A) Colorazione a montaggio intero di organoidi mono- e co-coltivati con fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+ che mostrano cellule basali KRT14+ nello strato esterno e cellule soprabasali differenziate KRT13+. Barra di scala = 50 μm. (B) Colorazione a montaggio intero di organoidi mono- e co-coltivati con fibroblasti PdgfrαH2BeGFP+ che mostrano cellule basali TRP63+ nello strato esterno e cellule soprabasali differenziate KLF4+. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella 1: Tabella che descrive i componenti dei terreni di coltura organoidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Video 1: Fibroblasto PdgfrαH2BeGFP+ avvolto intorno e a stretto contatto con l'organoide. Il video accompagna il pannello superiore della Figura 3C. La barra della scala nella Figura 3C è di 50 μm e l'organoide ha un diametro di ~ 120 μm. VIMENTINA è mostrato in bianco, E-CADHERIN in rosso, PdgfrαH2BeGFP in verde e DAPI in blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Fibroblasto DPP4+ avvolto intorno e a stretto contatto con l'organoide. Il video accompagna il pannello inferiore della Figura 3C. La barra della scala nella Figura 3C è di 50 μm e l'organoide ha un diametro di ~ 120 μm. VIMENTIN è mostrato in bianco, E-CADHERIN in rosso e DAPI in blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

Le co-colture organoide-fibroblasti forniscono un modello per studiare la nicchia delle cellule staminali in vivo . Qui viene descritto un protocollo per le co-colture organoide-fibroblasti esofagee. Inoltre, l'imaging a montaggio intero viene utilizzato per visualizzare l'interazione fibroblasto-organoide.

Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

Quindi le cellule progenitrici interagiscono con l'ambiente per mantenere l'omeostasi dei tessuti. E usando questo protocollo possiamo iniziare a capire come i fibroblasti influenzano il comportamento delle cellule progenitrici dell'esofago. Il sistema di co-coltura utilizza in primo luogo cellule isolate che imitano la normale nicchia progenitrice esofagea.La pulizia degli organoidi prima dell'imaging consente l'analisi sia delle interazioni cellulari che della morfologia degli organoidi. Questo metodo potrebbe essere applicato agli organoidi esofagei umani. Ad esempio utilizzando materiali provenienti da pazienti sani o oncologici.In tal modo, possiamo ottenere informazioni sulla funzione specifica dei fibroblasti associati al cancro. La dissociazione delle cellule epiteliali e stromali è fondamentale per ottenere organoidi vitali. Sotto digestione si tradurrà in una bassa resa cellulare, dove la digestione eccessiva ridurrà la vitalità cellulare e la capacità di formazione di organoidi.Per iniziare, rimuovere meccanicamente la muscolaris esterna dell'esofago usando un microscopio a dissezione e una pinza. Tenere l'estremità distale dell'esofago sezionato usando un paio di pinze e usare l'altra pinza per afferrare e tirare il muscolo dall'estremità distale all'estremità prossimale dell'esofago. Rimuovere e scartare lo strato muscolare.Per aprire l'esofago longitudinalmente, tenere un'estremità dell'esofago e inserire la sfera delle forbici a molla di micro dissezione nel lume per prevenire danni ai tessuti. Tagliare l'esofago mentre si tiene l'estremità e posizionarlo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri o in una piastra da 24 pozzetti. Immergere l'esofago aperto in 0,5 milligrammi per millilitro di termolisina in HBSS e incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker a bilanciere per 15 minuti.Dopo aver rimosso l'esofago dalla soluzione di termolisina, separare accuratamente l'epitelio esofageo dallo stroma. Trasferire lo strato epiteliale e stromale in due provette separate da microcentrifuga da 1,5 millilitri con 200 microlitri di soluzione di dissociazione in HBSS e metterle su ghiaccio. Tritare l'epitelio esofageo usando un bisturi affilato e raccogliere il tessuto tritato dalla capsula di Petri con 200 microlitri di soluzione di dissociazione.Trasferirlo in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 800 microlitri di soluzione di dissociazione fresca e posizionare il tubo con lo strato epiteliale tritato su uno shaker a bilanciere a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Pipettare la soluzione su e giù circa 20 volte utilizzando una punta da 200 microlitri ogni 15 minuti.Tagliare lo strato stromale in pezzi fini in un tubo da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di soluzione di dissociazione usando forbici da dissezione e aggiungere 800 microlitri di soluzione di dissociazione fresca. Posizionare il tubo su uno shaker a bilanciere a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione per la soluzione stromale e 60 minuti di incubazione per la soluzione epiteliale, pipettare la soluzione su e giù per altre 20 volte.Far passare la soluzione stromale attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri e la soluzione epiteliale attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in nuove provette da microcentrifuga da 1,5 millimetri. Centrifugare a 300G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante rimuovendo il liquido in eccesso con una pipetta da un millilitro. Risospendere il pellet in 200 microlitri di miscela anticorpale.Dopo aver trasferito la miscela in un tubo di citometria a flusso, incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di 1% FBS e centrifugare nuovamente per cinque minuti. Quindi risospendere le cellule in un minimo di 200 microlitri di 1% FBS.Aggiungere uno a 10.000 marcatori di macchie di cellule morte diluite, cinque minuti prima dello smistamento fax per isolare le cellule vive. Mescolare le cellule epiteliali ordinate e i fibroblasti in un rapporto di uno a due in un tubo. Dopo la centrifugazione a 300 g per cinque minuti, scartare il surnatante rimuovendolo con cura con una pipetta da 200 microlitri.Lavare le cellule una volta risospendendo il pellet in mezzo organoide basico freddo e centrifugare nuovamente per cinque minuti. Posizionare le cellule sul ghiaccio e scartare il surnatante rimuovendolo con cura con una pipetta da 200 microlitri. Risospendere le celle in 10 microlitri di miscela di matrice per cupola e rimettere il tubo sul ghiaccio.Prendi la piastra a 48 pozzetti preriscaldata dall'incubatore a 37 gradi Celsius e crea una cupola a matrice per pozzetto. Utilizzando una pipetta da 20 microlitri, aggiungere 200 microlitri di terreno ER basso preriscaldato alle cupole della matrice contenenti co-colture organoidi e mezzo ENR alle rispettive cupole della matrice contenenti solo organoidi epiteliali. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.E per i primi due giorni, integrare il mezzo con 10 inibitori della roccia micromolare. Rimuovere il mezzo organoide e aggiungere 200 microlitri di PBS ghiacciato alle cupole della matrice. Dopo aver posizionato la piastra sul ghiaccio per cinque o 10 minuti, pipettare su e giù e trasferire la soluzione in un tubo non aderente da 0,6 millilitri.Centrifugare brevemente per 30-60 secondi a 100 g per far depositare gli organoidi sul fondo. Dopo aver rimosso il liquido in eccesso, aggiungere PBS ghiacciato al tubo e centrifugare nuovamente per 30-60 secondi. Rimuovere il liquido in eccesso come mostrato in precedenza e fissare l'organoide con 200 microlitri di formaldeide fredda al 4% in soluzione PBS per 30 minuti su ghiaccio.Posizionare il tubo in posizione verticale per far affondare l'organoide e rimuovere la formaldeide. Aggiungere 500 microlitri di PBS freddo per lavare via la formaldeide rimanente. Dopo aver rimosso il PBS in eccesso, aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante.Posizionare il tubo su uno shaker a bilanciere per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante e risospendere gli organoidi in 200 microlitri di tampone bloccante con anticorpi primari. Posizionare nuovamente gli organoidi su uno shaker a bilanciere durante la notte a quattro gradi Celsius.Rimuovere la miscela di anticorpi primari e lavare gli organoidi utilizzando 500 microlitri di 0,02% Triton X 100 in PBS per 60 minuti a temperatura ambiente. Ripeti questa operazione tre volte. Allo stesso modo, rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 200 microlitri di anticorpo secondario coniugato a fluorescenza nel tampone di blocco durante la notte a quattro gradi Celsius.Rilavare gli organoidi utilizzando 0,02% Triton X 100 in PBS seguito da 500 microlitri di PBS. Dopo aver rimosso tutto il liquido in eccesso aggiungere 10 microlitri di soluzione limpida agli organoidi e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare un distanziatore a quattro pozzetti appiccicoso a doppia faccia da 0,05 millimetri su un vetrino da microscopio.Aggiungere i 10 microlitri di soluzione di pulizia con gli organoidi in un pozzetto e posizionare un vetrino di copertura sopra il distanziatore. Acquisire immagini utilizzando un sistema di microscopia confocale. Le cellule progenitrici esofagee sono ordinate in base alla loro elevata espressione integrata di beta quattro ed e-caderina.Il grafico rappresentativo della citometria a flusso dell'isolamento delle cellule epiteliali mostra la percentuale di cellule vive da tutte le singole cellule. La percentuale di cellule progenitrici isolate di integrina beta quattro e e-caderina da tutte le cellule vive è mostrata qui. I grafici di citometria a flusso mostrati qui rappresentano la percentuale di fibroblasti alfa positivi isolati del recettore DPP4+ e Pdgf.Le immagini in campo luminoso con gli organoidi co-coltivati con fibroblasti positivi al recettore Pdgf alfa H2 BEGFP mostrano il segnale EGFP nucleare. Le immagini a campo luminoso dell'intera cupola della matrice il sesto giorno sono mostrate qui. L'efficienza di formatura degli organoidi è presentata da questa immagine grafica.Ogni punto rappresenta una cupola a matrice e la barra rappresenta la media di tutti i punti per condizione. Il campo luminoso e le immagini fluorescenti della co-coltura di organoidi del sesto giorno con fibroblasti alfa positivi del recettore Pdgf sono mostrati qui. L'intera immagine di montaggio degli organoidi co-coltivati mostra superfici 3D degli organoidi con fibroblasti positivi alla vimentina avvolti intorno e a stretto contatto con l'organoide.L'intera colorazione a monte di organoidi mono e co-coltivati con fibroblasti alfa positivi del recettore Pdgf rivela distinte popolazioni cellulari basali e soprabasali. L'efficienza di formazione degli organoidi e la dimensione dell'organoide sono influenzate dal fibroblasto incluso nella co-coltura. Variazioni e risultati sono da aspettarsi quando si utilizzano diverse sottopopolazioni di fibroblasti.La stessa strategia può essere impiegata per caratterizzare i fibroblasti associati al tumore sia nei topi che negli esseri umani.

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