Name: Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Impara a isolare e coltivare neuroni gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni patch-clamp. Questo metodo consente studi elettrofisiologici di alta qualità sui canali ionici coinvolti nell'udito e nell'equilibrio.

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Ringraziamo le dottoresse Jing Bing Xue e Ruth Anne Eatock per i loro primi contributi a questi metodi. Questo lavoro è stato supportato da NIH NIDCD R03 DC012652 e NIH NIDCD DC012653S, e R01 DC0155512 a RK e T32 DC009975 a DB, NN e KR.

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<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

I metodi qui presentati sono specifici per le registrazioni da neuroni isolati; Studi precedenti si sono concentrati sulle registrazioni dei terminali assonali in una preparazione semi-intatta. Rispetto alle tecniche di registrazione terminale esistenti, le registrazioni isolate offrono un comportamento superiore di space-clamp e isopotenziale. Inoltre, questo protocollo fornisce l'accesso a un campione più ampio di neuroni, poiché solo le sottopopolazioni portatrici di calici sono accessibili nelle registrazioni semi-in...

I neuroni bipolari del nervo vestibolococleare collegano le cellule ciliate sensoriali dell'orecchio interno al tronco encefalico. Sono i principali vettori di informazioni sul suono e sui movimenti della testa; Il danno a queste importanti cellule porta a sordità e disturbi dell'equilibrio. Le porzioni vestibolari e uditive del nervo sono costituite ciascuna da tipi di cellule distinte che sono morfologicamente e funzionalmente diverse 1,2. Nel sistema vestibolare, due sottopopolazioni afferenti si attivano spontaneamente a intervalli regolari o irregolari2. Si ritiene che la temporizzazione dello spike afferente rifletta una diversità sottostante nella composizione dei canali ionici 3,4. Nel sistema uditivo, ci sono due sottopopolazioni principali di neuroni gangliari spirali (SGN); mentre gli SGN di tipo I contattano le singole cellule ciliate interne5, gli SGN di tipo II contattano più cellule ciliate esterne5. Registrazioni in vitro da colture semi-intatte e organotipiche suggeriscono differenze nelle proprietà di membrana degli SGN di tipo I e di tipo II 6,7.
Molti canali ionici e recettori dei neurotrasmettitori che si trovano ai terminali di questi neuroni si trovano anche nei loro corpi cellulari. Pertanto, le colture del vestibolare isolato e del ganglio a spirale somata possono essere studiate in vitro per capire come i canali ionici e i recettori dei neurotrasmettitori contribuiscono alla risposta di questi neuroni. La morfologia compatta dei corpi cellulari isolati consente registrazioni elettriche di alta qualità, adatte per la caratterizzazione dettagliata di canali ionici voltaggio-dipendenti e recettori dei neurotrasmettitori. Il facile accesso a una varietà rappresentativa di sottotipi di neuroni consente un'analisi ad alto rendimento della diversità cellulare.
Questo articolo presenta un metodo per isolare e coltivare corpi cellulari gangliari dissociati dalla porzione superiore del ganglio vestibolare nei ratti al giorno postnatale da (P)9 a P20. Vengono inoltre forniti suggerimenti per estendere questi metodi al ganglio a spirale, oltre ai passaggi necessari per estrarre, dissociare e placcare con successo le cellule ganglionari. Questi metodi sono un'evoluzione di quelli ideati nelle pubblicazioni di vari laboratori 8,9,10. In questo documento è inclusa anche una guida per la selezione di cellule sane per le registrazioni patch-clamp.
Infine, il protocollo delinea la procedura per la registrazione patch-clamp utilizzando la configurazione perforated-patch11. Sebbene la configurazione del cerotto perforato sia più dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente più impegnativa rispetto alla più comune configurazione del cerotto rotto, è migliore per mantenere l'ambiente citoplasmatico che consente sessioni di registrazione lunghe e stabili. I vantaggi di questa configurazione di registrazione sono illustrati qui attraverso la migliore stabilità delle correnti cationiche attivate dall'iperpolarizzazione nelle registrazioni di patch perforate rispetto alle registrazioni di patch rotte.
Questo protocollo è organizzato in cinque sezioni. Le sezioni 1-3 descrivono le soluzioni e gli strumenti che possono essere preparati e conservati in anticipo. La sezione 4 descrive le fasi per la dissezione e la placcatura delle vestibolari e degli SGN. La sezione 5 descrive le fasi per la registrazione dai neuroni dopo un periodo di coltura. Nelle nostre mani, la sezione 4 e la sezione 5 vengono eseguite per un periodo di 2 giorni consecutivi.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>Per registrazioni di patch perforate.</td></tr><tr><td>ATP di-sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Additivo alla soluzione interna</td></tr><tr><td>Integratore B27 (50x), senza siero</td><td>Thermo Fisher Scientific 17504044</td><td></td><td>additivo al terreno di coltura, per</td></tr><tr><td>becher SGN (1000, 100, 10) millilitri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuga da banco</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Bruciatore</td><td></td><td></td><td></td> Bunsen</tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>Additivo alla soluzione interna</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>uno dei tre enzimi per digerire il tessuto</td></tr><tr><td>Coverglass, rettangolare, spessore #1, 22x40&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, dal pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>uno dei tre enzimi per digerire i tessuti</td></tr><tr><td>Dumont #3 Pinze (smussate)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze (Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze ( Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>Additivo per soluzione interna</td></tr><tr><td>Estrattore di elettrodi</td><td>Narashige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa Epi-illuminazione&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>per la testina di pulizia e intorno al banco di dissezione</td></tr><tr><td>Capillari in borosilicato filamentato per elettrodi</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>Lama di dissezione a bordo fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro</td><td>Pasteur VWR</td><td>14673-010</td><td>per estrarre pipette di triturazione</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td>additivo al terreno di coltura</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>per il tamponamento del pH di tutte le soluzioni nel protocollo</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante / agitatori magnetici&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>Secchio isolato riempito di ghiaccio</td><td></td><td></td><td>per mantenere freschi tutti i campioni e le soluzioni</td></tr><tr><td>K2SO4, solfato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>Additivo per soluzione interna</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>Additivo per soluzione interna</td></tr><tr><td>KOH (1 M)</td><td>Honeywell</td><td>319376-500ML</td><td>Per portare la soluzione interna a pH desiderato.</td></tr><tr><td>Forbici a molla grandi</td><td>strumenti di scienze fini</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz medium&nbsp;</td>Soluzioni per dissezione e bagno <td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Camera di registrazione a bagno a basso profilo per piastre di coltura</td><td>Siringhe luer-lok Warner Instruments</td><td>64-0236</td><td></td></tr><tr>, <td>302832</td><td>BD</td> da<td>30 ml</td><td>per il prelievo di soluzione L-15/HEPES/HEPES.</td></tr><tr><td>MEM + Glutamax Integratore</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>base del terreno di coltura</td></tr><tr><td>MgCl2-Esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Additivo alla soluzione interna</td></tr><tr><td>Ago microFil per il riempimento di micropipette - 34 gauge&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narashige</td><td>MF-90</td><td>Per la lucidatura degli elettrodi.</td></tr><tr><td>Integratore N2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>additivo al terreno di coltura, per SGN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>additivo alla soluzione interna</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Thomas Scientific</td><td>319511-500ML</td><td>per titolazione pH</td></tr><tr><td>Osmometro</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>Ossigeno, grado medico, con regolatore e tubo adeguati</td><td>USC Material Management</td><td>MEDOX200 (Identificatore: 00015)</td><td>per la dissoluzione in soluzioni di dissezione e bagno</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Lampadina per pipetta Pasteur (3 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td>lampadina per pipette per triturazione</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Additivo scientifico</td><td>15140122</td><td>per prevenire la contaminazione del terreno di coltura</td></tr> Soluzione per <tr><td>eutanasia a base di pentobarbital (ad es. Fatal Plus. 50 - 60 mg/kg di dosaggio)&nbsp;</td><td>MWI Animal Health</td><td>15199</td><td>per l'eutanasia</td></tr><tr><td>Filtri a membrana PES, 0,2 micrometri.</td><td>Nalgene</td><td>566-0020</td><td>per soluzioni filtranti</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe sterili con membrana in PES, 0,22 um, 30 mm</td><td>CELLTREAT</td><td>229747</td><td>per filtrare soluzioni aspirate in siringhe</td></tr><tr><td>Piastre di Petri, 35 x 10 mm</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-103</td><td>per micro dissezione e per contenere la punta soluzione di immersione in configurazione patch perforata</td></tr><tr><td>Piastre di Petri, 60 x 15 mm</td><td>Midland Scientific</td><td>P7455</td><td>per dissezione grossolana</td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>modello S20</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatori (1000, 200, 10) microlitro</td><td>USA Scientific Piatto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di coltura con fondo in vetro rivestito in poli-d-lisina</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>per piastra di neuroni per coltura</td></tr><tr><td>Piattaforma a cambio rapido, base riscaldata, per piastre di coltura da 35 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Reference Cell</td><td>World Precision Instruments</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi</td><td>Miltex</td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia scientifica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (10, 25) millilitri</td><td>Kit</td> grasso siliconico Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>(per sigillare il vetro di copertura e la camera)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Ghigliottina per piccoli animali</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>Ghigliottina per piccoli animali</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td>per la decapitazione in caso di dissezione di ratti di età superiore a P15.</td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione stereoscopica</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche diritte</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (3, 10, 30) millilitro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td>uno su tre enzima per digerire i tessuti</td></tr><tr><td>Siringa di tubercolina&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881500105</td><td>per la somministrazione di soluzione per eutanasia mediante iniezione intraperitoneale</td></tr><tr><td>Forbice a molla Vannas, 2,5 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Pallone tarato, 1000 millilitri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, sterile u ltrapure, R>18,18 megaOhm cm (ad esempio, filtrato da una purificazione dell'acqua Millipore-Sigma </td><td>Millipore-Sigma</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

La morfologia compatta dei neuroni gangliari dell'orecchio interno isolati e in coltura consente una caratterizzazione dettagliata dei canali ionici e dei recettori dei neurotrasmettitori che contribuiscono alla diversità cellulare in questa popolazione. Questo protocollo delinea i passaggi necessari per il successo della dissezione, della dissociazione e della coltura a breve termine dei somata dei neuroni bipolari dell'orecchio interno ai fini delle registrazioni patch-clamp. Vengono fornite istruzioni dettagliate per la preparazione dei neuroni gangliari vestibolari con le modifiche necessarie per la placcatura dei neuroni gangliari a spirale. Il protocollo include le istruzioni per l'esecuzione di registrazioni patch-clamp a cellula intera nella configurazione a patch perforato. I risultati di esempio che caratterizzano le registrazioni voltage-clamp di correnti mediate da HCN (Cyclic Nucleotide-Gated) attivate dall'iperpolarizzazione evidenziano la stabilità della configurazione di registrazione a patch perforata rispetto alla configurazione a patch di rottura più standard. La combinazione di questi metodi, somata isolati più registrazioni perforate-patch-clamp, può essere utilizzata per studiare i processi cellulari che richiedono registrazioni lunghe e stabili e la conservazione dell'ambiente intracellulare, come la segnalazione attraverso i recettori accoppiati alla proteina G.

L'esecuzione di protocolli di voltage-clamp mediante l'applicazione di famiglie di gradini di tensione rivela l'attivazione dipendente dalla tensione di una varietà di diverse famiglie di correnti. Esempi rappresentativi di correnti intere evocate da un VGN e adattate da registrazioni pubblicate13 sono mostrati nella Figura 1A,B. L'applicazione di tensioni depolarizzanti (Figura 1B) attiva una corrente verso l'interno (ne...

Di seguito sono presentati metodi che forniscono istruzioni dettagliate per la dissezione, la dissociazione, la coltura e la registrazione di patch-clamp dai neuroni gangliari vestibolari e gangliari a spirale dell'orecchio interno.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Molti canali ionici e recettori dei neurotrasmettitori che si trovano ai terminali dei neuroni afferenti uditivi e vestibolari si trovano anche nei loro corpi cellulari. Le colture di corpi cellulari isolati possono essere studiate in vitro per capire come questi canali ionici e recettori influenzano le risposte dei neuroni. La morfologia compatta dei corpi cellulari consente registrazioni elettriche di alta qualità per caratterizzare le proprietà voltaggio-dipendenti dei canali ionici e dei recettori dei neurotrasmettitori.Inoltre, il facile accesso a un'ampia varietà di tipi di cellule consente un'elevata produttività grazie all'analisi fisica della diversità cellulare. Le procedure saranno dimostrate dalla dottoranda Katherine Regalado, insieme ai borsisti post-dottorato, il dottor Daniel Bronson e Nathaniel Nowak del mio laboratorio. Per iniziare, tenere una pipetta di vetro da pascolo alla fiamma di un bruciatore Bunsen per preparare le pipette di tritrazione per la dissociazione cellulare.Una volta che la punta del vetro inizia a sciogliersi, allungare il vetro fino al diametro desiderato. Allontanare un'estremità della pipetta dalla fiamma per creare una piccola curva. Posiz

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Questo video mostra il processo per isolare gli espianti di ganglio spirale dall'orecchio interno e co-coltivarli con l'organo di Corti su un array multielettrodo. I gangli spirale vengono accuratamente estratti e sezionati in sezioni di tessuto più piccole o espianti. Questi espianti vengono coltivati sull'area attiva dell'array multielettrodo per promuovere la crescita del processo neuronale.

Coltura di espianti di neuroni gangliari a spirale murina su array multielettrodi

Questo video mostra un metodo per isolare i neuroni vestibolari dall'orecchio interno di un cucciolo di topo. Delinea meticolosamente i passaggi necessari per sezionare l'orecchio interno, raccogliere il ganglio vestibolare e successivamente dissociare il ganglio in singole cellule. Queste cellule vengono quindi coltivate su piastre con fondo di vetro per stabilire una coltura di neuroni vestibolari.

Isolamento dei neuroni gangliari vestibolari da un orecchio interno di topo

Questo video mostra una tecnica di patch-clamp su cellule intere per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto. Una sottile pipetta di vetro con un elettrodo viene utilizzata per avvicinare le cellule amacrine starburst (SAC) all'interno della retina. Dopo aver formato una guarnizione, viene applicata l'aspirazione per rompere la membrana e formare la configurazione patch-clamp a cella intera. Infine, il flusso di ioni attraverso i recettori sinaptici SAC...

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto

Questo video mostra la tecnica del patch-clamp per misurare le correnti ioniche nei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno. Descrive in dettaglio la preparazione e l'uso di una pipetta patch-clamp lucidata riempita con una soluzione interna contenente amfotericina B, che perfora la membrana per consentire il movimento degli ioni preservando le condizioni intracellulari. Gli impulsi di tensione vengono applicati per innescare e registrare l'attività dei canali ionici,...

Registrazioni perforate Patch-Clamp dei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno

Stimolazione nervosa infrarossi è stato proposto come alternativa alla stimolazione elettrica in una gamma di tipi nervose, comprese quelle associate al sistema uditivo. Questo protocollo descrive un metodo patch clamp per studiare il meccanismo di stimolazione nervosa infrarossa in una cultura di neuroni uditivi primari.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all'interno della parte più dura del cranio, l'osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

Descriviamo la dissezione del sistema nervoso della marina mare...

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

Questo manoscritto descrive come preparare i gangli delle radici dorsali intatti per le registrazioni con patch clamp. Questo preparato mantiene il microambiente per i neuroni e le cellule gliali satelliti, evitando così i cambiamenti fenotipici e funzionali osservati utilizzando i neuroni DRG dissociati.

Bloccare Registrazioni patch intatta dei gangli dorsali da ratti adulti

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento, la purificazione e la coltura delle cellule marginali primarie dalla stria vascolare del muro, e per stabilire modelli in vitro di stress ossidativo e senescenza cellulare allo scopo di studiare i disturbi della parete laterale cocleare.

Isolamento e coltura delle cellule marginali primarie della stria vascolare da topi neonatali

Impara a isolare e coltivare neuroni gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni patch-clamp. Questo metodo consente studi elettrofisiologici di alta qualità sui canali ionici coinvolti nell'udito e nell'equilibrio.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

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