Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Il nostro protocollo fornisce strumenti per studiare l'epitelio intestinale suino per la ricerca veterinaria e biomedica. Gli organoidi intestinali dei maiali possono essere utilizzati per studiare il trasporto dei nutrienti, la funzione barriera e le interazioni ospite-microbo. Attraverso la conservazione delle cripte epiteliali intestinali dei suini consentono di creare un grande stock di cellule staminali che possono essere successivamente utilizzate per la coltura organoide in monostrati 3D o 2D.

Questo protocollo è dettagliato per il digiuno, ma può essere utilizzato anche per altri segmenti intestinali come duodeno, ileo e colon. Per iniziare, scongelare rapidamente una fiala contenente 900 cripte congelate a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Trasferire la soluzione di cripta in un tubo conico da 15 millilitri.

Centrifugare a 300 x g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 150 microlitri di matrice extracellulare o ECM con una punta raffreddata per ottenere una concentrazione finale di 150 cripte per 25 microlitri di ECM. Pipet su e giù 10 volte per ottenere una sospensione omogenea delle cripte nella ECM.

Seminare sei pozzetti con una goccia da 25 microlitri per pozzetto in una piastra preriscaldata da 48 pozzetti. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per la polimerizzazione della ECM. Aggiungere un 250 microlitro per pozzetto di coltura di mezzo a temperatura ambiente e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Cambiare il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Per far passare organoidi 3D derivati da cripte congelate 10 giorni dopo la semina, rimuovere i terreni di coltura e aggiungere 250 microlitri di PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sostituire il PBS con 250 microlitri di reagente di dissociazione enzimatica preriscaldato integrato con 10 inibitori della roccia micromolare a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto.

Staccare gli organoidi nell'ECM raschiando con una pipetta P-1000 e omogeneizzarli accuratamente mediante pipettaggio cinque volte. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima di dissociare le cellule pipettando su e giù 10 volte. Aggiungere 500 microlitri di DMEMc in ciascun pozzetto contenente cellule dissociate e tirare fino a 12 pozzetti in un tubo conico da 15 millilitri contenente tre millilitri di DMEMc freddo.

Centrifugare a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di DMEMc freddo. Contare le celle con una diluizione da una a due in blu tripano con un contatore di celle.

Centrifugare il volume necessario della soluzione cellulare per avere 3000 celle vive per cupola. Risospendere il pellet con 17 microlitri di DMEMc freddo per 3000 cellule vive su ghiaccio. Regolare il volume in base al numero richiesto di pozzetti.

Aggiungere lentamente 33 microlitri di ECM freddo per 3000 cellule vive. Regolare il volume al numero richiesto di pozzetti e omogeneizzare senza creare bolle. Quindi vedere i pozzetti con 50 microlitri di sospensione della cella ECM per pozzetto in una piastra preriscaldata a 24 pozzetti e incubare per 30 minuti per la polimerizzazione dell'ECM.

Aggiungere 500 microlitri del terreno di coltura per pozzetto. Quindi incubare e cambiare il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Per rivestire l'inserto di coltura, preparare la soluzione di rivestimento contenente collagene IV diluito a 50 microgrammi per millilitro in PBS freddo.

Aggiungere 150 microlitri della soluzione di rivestimento diluito a ciascun inserto di coltura cellulare e incubare durante la notte o per tre ore. Cinque giorni dopo la scissione, staccare gli organoidi con l'ECM raschiandoli con una pipetta P-1000. Omogeneizzare accuratamente mediante pipettaggio nel terreno di coltura e trasferire in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di DMEMc freddo su ghiaccio.

Centrifugare gli organoidi raccolti a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di reagente di dissociazione enzimatica preriscaldato integrato con 10 inibitori micromolari ROCK. Pipet su e giù 10 volte per iniziare la dissociazione degli organoidi.

Incubare per cinque minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius per la digestione enzimatica. Interrompere meccanicamente gli organoidi pipettando 10 volte e aggiungere quattro millilitri di DMEMc ghiacciato. Centrifugare ed eliminare il surnatante prima di risospendere il pellet di cellule organoidi in un millilitro di DMEMc.

Contare le cellule in tripano blu con un contatore di cellule e calcolare il volume necessario per seminare 2,5 volte 10 alla quinta cellula per inserto di coltura. Centrifugare il volume necessario della sospensione cellulare corrispondente a 2,5 volte 10 delle quinte cellule per inserto di coltura. Durante la centrifugazione, aspirare con cura la soluzione di rivestimento dagli inserti di coltura e lasciarla asciugare sotto il cofano senza il coperchio per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet nel volume necessario di mezzo 2D integrato con inibitore ROCK 10 micromolare. Seminare 200 microlitri della sospensione cellulare sulla membrana permeabile rivestita. Aggiungere 500 microlitri di mezzo 2D integrato con 10 inibitori micromolari ROCK al compartimento inferiore e incubare.

Un'alta densità di cellule dovrebbe essere osservata sulla membrana. Un giorno dopo la semina, sostituire i mezzi epici e basali con nuovi supporti 2D senza l'inibitore ROCK. Cambia i media ogni giorno.

Il monostrato diventa confluente un giorno dopo la semina e può essere utilizzato per i suoi esperimenti. In questo studio, le cripte epiteliali sono state ottenute dall'intestino del maiale e crioconservate per la conservazione a lungo termine in azoto liquido. Dopo lo scongelamento, le cellule staminali della cripta sono state seminate nell'ECM.

Gli organoidi sono stati osservati entro tre o quattro giorni e sono cresciuti rapidamente e hanno sviluppato strutture in erba. Circa 10 giorni dopo lo scongelamento, è stato eseguito il passaggio degli organoidi per espandere la coltura. Per un mantenimento ottimale della coltura, gli organoidi utilizzati per il confezionamento devono presentare un lume chiaro e vuoto e bordi ben definiti senza detriti neri nel lume come osservato negli organoidi maturi.

Le cellule si attaccano e formano un monostrato completamente confluente entro un giorno, il che è confermato dall'elevata resistenza elettrica transepiteliale, o TEER, di circa 700 cupole centimetri quadrati. Il TEER rimane alto per tre giorni. La colorazione dell'actina indica che il lato apicale delle cellule epiteliali è orientato verso il lume negli organoidi 3D.

Le cellule organoidi seminate negli inserti di coltura formano un singolo strato confluente di cellule epiteliali con il lato apicale orientato verso il compartimento superiore. La colorazione dell'occludina rivela la presenza di giunzioni strette sul lato apicale delle cellule epiteliali negli organoidi 3D e nei monostrati cellulari. È importante ricordare che l'organoide utilizzato per seminare monostrati cellulari dovrebbe apparire chiaro con un lume vuoto senza detriti neri corrispondenti a un accumulo di cellule morte.

I monostrati dell'organoide intestinale del maiale possono essere utilizzati per testare gli effetti di metaboliti o microbi sulla funzione di barriera epiteliale utilizzando saggi funzionali, imaging e analisi dell'espressione genica.