Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Questo protocollo consente l'identificazione dei partner di legame proteico di una sequenza di RNA nota estraendoli dall'estratto cellulare utilizzando oligonucleotidi di RNA biotinilato. Rispetto ai metodi che richiedono detergenti o alte temperature per staccare le proteine dall'RNA, questi protocolli utilizzano invece condizioni molto blande che permettono anche di preservare potenziali complessi proteici. A dimostrare la procedura sarà Jakob Rupert, uno studente di dottorato sotto la mia disposizione.

Iniziare la raccolta totale delle proteine rimuovendo il mezzo dai pozzetti della piastra cellulare HEK 293T e lavare i pozzetti delle sei piastre del pozzetto con un millilitro di PBS. Scartare il PBS e trasferire le piastre sul ghiaccio, prima di aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi a ciascun pozzetto. Staccare e rompere le cellule usando un raschietto cellulare prima di trasferire l'estratto cellulare derivato da due pozzetti nello stesso tubo da 1,5 millilitri.

Dopo 30 minuti di incubazione su ghiaccio e centrifugazione, trasferire il surnatante in un tubo pre-raffreddato. Quindi, calcolare il volume di estratto proteico corrispondente a 1,5 milligrammi di proteine. Quindi portare tutti i campioni a un volume finale di 600 microlitri utilizzando un tampone di lisi.

Conservare i campioni sul ghiaccio fino all'uso. Per preparare le perline, mescolarle nel buffer di stoccaggio facendo scorrere il tubo. Dopo aver calcolato i 100 microlitri di mezzo liquame per campione, posizionare il volume calcolato del liquame in un rack magnetico.

Per lavare le perline, rimuovere la soluzione di stoccaggio e lavare le perline aggiungendo un millilitro di tampone di lisi e invertendolo manualmente. Quindi rimuovere il tampone utilizzando la cremagliera magnetica e ripetere la fase di lavaggio. Alle perle, aggiungere un volume di tampone di lisi pari al volume iniziale del mezzo liquame e mescolarlo facendo scorrere il tubo prima di erogare uniformemente il mezzo in tanti tubi da 1,5 millilitri come campioni.

Per il blocco delle perline, rimuovere il tampone utilizzando il rack magnetico e aggiungere 600 microlitri di 0,25 milligrammi per millilitro di soluzione di lievito TRNA preparata in tampone di lisi. Incubarlo per un'ora a temperatura ambiente su una ruota rotante. Rimuovere la soluzione TRNA utilizzando la cremagliera magnetica prima di aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi e lavarla mescolando manualmente.

Ripetere la fase di lavaggio ed eliminare il tampone. Per ogni provetta contenente i 100 microlitri iniziali del mezzo liquame, preparare 200 microgrammi di oligonucleotide di RNA in 600 microlitri di tampone di lisi. Aggiungere l'oligo alle perle e incubare per un'ora a temperatura ambiente durante la rotazione.

Rimuovere la soluzione dalle perle e lavare due volte con 600 microlitri di tampone di lisi ruotando i tubi per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Eliminare il buffer. Per il legame proteico sulle perle, separare il 5% o 30 microlitri di volume dalla soluzione proteica da 600 microlitri e tenerlo come input o IN per ulteriori analisi.

Aggiungere il mix proteico rimanente a ciascun tubo di perline caricate e incubare con rotazioni lente durante la notte a quattro gradi Celsius. Rimuovere la frazione proteica non legata dalle perle utilizzando il rack magnetico. Risparmia il 5% o 30 microlitri del suo volume ed etichettalo attraverso o FT. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio 1 alle perline e ruotarlo per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il tampone e ripetere il lavaggio una volta. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio 2 alle perline. E dopo aver incubato a quattro gradi Celsius su un rotatore per cinque minuti, scartare il surnatante.

Per eluire i leganti specifici, aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione 1 alle perline. Dopo aver mescolato manualmente a sfioramento, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in un miscelatore termico e agitare vigorosamente per cinque minuti a 95 gradi Celsius.

Quindi posizionare il tubo nel rack magnetico e raccogliere la frazione eluita in un tubo pulito. Una volta fatto, girare rapidamente le perline con una centrifuga da banco per massimizzare il recupero dell'eluato. E risparmiare il 5% o cinque microlitri del volume totale di eluato o EL per ulteriori analisi.

Le proteine eluite sono state identificate mediante spettrometria di massa. Tracciare le proteine significativamente arricchite in un diagramma di vulcano ha rivelato che il contenuto proteico totale e le proteine arricchite eluite dall'RNA erano significativamente più alte dell'RNA, suggerendo che l'RNA può stabilire un numero maggiore di interazioni specifiche. Come esempi dell'accordo tra risultati previsti e ottenuti, i punteggi di interazione per più RNA e meno RNA con proteine del proteoma umano hanno mostrato che HNRNPH3 è stato progettato per legarsi selettivamente più RNA e PCBP2 per interagire specificamente con l'RNA.

Inoltre, è stato previsto che la proteina RBM41 sia promiscua per entrambi gli oligonucleotidi dell'RNA. L'analisi della spettroscopia di massa di campioni di dosaggio di pull-down proteico ha confermato la presenza di HNRNPH3 nell'RNA e PCBP2 nel meno RNA. Mentre RBM41 è stato trovato per interagire con entrambi.

Western blot è stato utilizzato per rilevare la presenza di TDP-43 nei risultati e nelle fasi di ottimizzazione del protocollo. Nell'RNA, TDP-43 è stato osservato nel campione di input e nell'eluato, indicando la sua presenza fin dall'inizio. TDP-43 è stato trattenuto dall'RNA durante le fasi di lavaggio ed è stato eluito alla fine con un tampone salino elevato.

Mappando le interazioni dell'RNA proteico, questo metodo può rivelare reti macromolecolari dietro molti percorsi fisiologici. Ad esempio, regolazione trascrizionale o meccanismi patologici tra cui cancro e neurodegenerazione.