Name: Isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia immunoterapica per il glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Scopri il protocollo di isolamento e purificazione di β-glucani fungini per valutare il loro potenziale immunomodulatorio contro le cellule di glioblastoma. Questo metodo combina tecniche biotecnologiche avanzate con colture cellulari per studiare l'attivazione dei microglia.

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Vorremmo ringraziare la dott.ssa Vasiliki Economopoulos per il suo script interno per misurare il segnale di fuluorescenza in ImageJ. Vorremmo anche ringraziare la CITIUS (Università di Siviglia) e tutto il loro personale per il loro sostegno durante la manifestazione. Questo lavoro è stato sostenuto dallo spagnolo FEDER I + D + i-USE, US-1264152 dell'Università di Siviglia, e dal Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Le quattro diverse varianti di funghi descritte in questo protocollo sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Isolamento di β-glucani fungini
<ol><li>Estrazione e isolamento di polisaccaridi solubili di funghi NOTA: I polisaccaridi solubili dei funghi (SMP) sono stati ottenuti secondo la procedura schematicamente mostrata nella Figura 1.<ol><li>Risciacquare delicatamente i corpi fruttiferi freschi di P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum (circa 2.000 g / fungo) in acqua distillata cinque volte.</li>
		<li>Essiccare i corpi fruttiferi a 50 ± 2 °C in un forno ad aria convenzionale fino a raggiungere un peso costante (~24 h).</li>
		<li>Macinare i funghi secchi in un mulino a lame, ottenendo circa 200 g di polvere da ciascun fungo.</li>
		<li>Sospendere 100 g di polvere di funghi (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum) in 1.000 ml di H2Od. Quindi, autoclavare a 121 °C per 15 min, e infine lasciare a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione risultante a 6.000 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Essiccare il precipitato contenente polisaccaridi di funghi insolubili (IMP) a 50 ± 2 °C in un forno ad aria per 24 ore.</li>
		<li>Scartare il precipitato e mantenere il surnatante. Concentrare il surnatante 10 volte in un evaporatore rotante.</li>
		<li>Precipitare il concentrato contenente SMP con etanolo (concentrazione finale dell'80%) a 4 °C durante la notte.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione di etanolo a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C, trattenere il pellet (precipitato) e gettare il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Lavare il precipitato tre volte con etanolo all'80% prima di scioglierlo in H2Od (10% p/v). Regolare il pH a 6,5/7 e la temperatura a 37 °C e trattare con 2 U e 4 U di α-amilasi e glucoamilasi, rispettivamente, per solubilizzare i α-glucani seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Dopo il trattamento con α-amilasi/glucoamilasi, regolare il pH e la temperatura rispettivamente a 8,0 e 50 °C e trattare con alcalasi (2,5 U/g di proteine) (vedere Tabella dei materiali) per solubilizzare le proteine. NOTA: Questo trattamento enzimatico sequenziale rimuove la maggior parte dei α-glucani e delle proteine che co-precipitano con β-glucani nella precipitazione dell'etanolo.</li>
		<li>Dopo l'idrolisi, centrifugare l'idrolizzato a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C e il concentrato di surnatante pulito cinque volte in un evaporatore rotante. Precipitare nuovamente con etanolo all'80%.</li>
		<li>Solubilizzare il precipitato risultante in H2Od e dializzarlo in acqua distillata per 24 ore utilizzando membrane tubolari di cellulosa (membrane cut-off da 12.000 Da; vedi Tabella dei materiali) per rimuovere molecole a basso peso molecolare. Recuperare la parte idrosolubile e liofilizzarla per produrre β-glucani solubili (SβG).</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazione di zuccheri e proteine<ol><li>Misurare il contenuto totale di zucchero di ciascuna frazione con il metodo dell'acido fenolo-solforico, utilizzando il glucosio come standard8. NOTA: La quantificazione del contenuto di β-glucano può essere effettuata anche utilizzando il kit di dosaggio β-glucano (funghi e lieviti; vedi Tabella dei materiali), basato sull'idrolisi enzimatica e sull'attività delle ossidoreduttasi: vale a dire eso-1,3-β-glucanasi, glucosio ossidasi, β-glucosidasi e perossidasi, con successiva formazione della chinonerimina. Seguire le istruzioni del produttore, con lievi modifiche.</li>
		<li>Utilizzare 18 MH 2 SO4 invece di 12 MH2SO4.</li>
		<li>Valutare separatamente il contenuto dei glucani e dei α-glucani totali.</li>
		<li>Misurare i valori di β-glucano risultanti come differenza tra i valori di glucano totale e α-glucano (triplicato) seguendo il protocollo Kjeldahl. In alcuni casi, il contenuto proteico può essere determinato con il metodo di Lowry, utilizzando l'albumina per tracciare la curva di calibrazione11,12.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi della spettroscopia di assorbimento ultravioletto<ol><li>Ottenere gli spettri ultravioletti (UV) SβG utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile (vedi Tabella dei materiali) scansionando i campioni nella regione 200-400 nm (Figura 2).</li>
		<li>Preparare 1,0 mg/ml di ogni SβG in H2Od, trasferire la soluzione in una cuvetta di quarzo e scansionare a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi della distribuzione del peso molecolare<ol><li>Stimare l'omogeneità dei SβG e il peso molecolare dei polimeri mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (vedi Tabella dei materiali) dotato di un rivelatore di indice di rifrazione e di una colonna lineare di filtrazione in gel ultra-idrogel (300 mm x 7,8 mm; Figura 3).</li>
		<li>Eseguire il test a 40 °C utilizzando acqua deionizzata come eluente ad una portata di 0,5 mL/min-1 e destrani (110, 80 e 50 kDa) come standard (vedere Tabella dei materiali). Raccogliere una frazione di 5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR)<ol><li>Registrare gli spettri infrarossi (Figura 4) su uno spettrometro FTIR nell'intervallo 4000-500 cm-1. I campioni devono essere precedentemente miscelati con KBr per formare pellicole (procedura FTIR standard; vedere le istruzioni del produttore e la tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi della composizione molecolare<ol><li>Stimare le composizioni molecolari di SβG mediante cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) e gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS), seguendo le procedure standard12.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Studio in vitro della stimolazione microglia indotta da β-glucano
<ol><li>Coltura cellulare di glioblastoma di topo e cellule di microglia in vetrini a 8 pozzetti NOTA: Questo protocollo è specifico per le linee cellulari GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). Tuttavia, con lievi modifiche, questi passaggi potrebbero potenzialmente essere utilizzati per studiare altre linee cellulari tumorali e immunitarie.<ol><li>Preparare il mezzo completo modificato di Eagle (DMEM) di Dulbecco modificato con L-glutammina, 4,5 g / L D-glucosio e senza piruvato. Aggiungere il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (vedere la tabella dei materiali). Preriscaldare il materiale a bagnomaria a 37 °C per 15 min.</li>
		<li>Scongelare le aliquote BV2 e GL261 congelate a bagnomaria (37 °C) per 2 minuti e, poco prima che si scongelano completamente, trasportarle in una cappa a flusso laminare e placcare le cellule in due diversi palloni sterili T25 (uno per ogni linea cellulare).</li>
		<li>Incubare i matraccio T25 a 37 °C, 5% CO2 fino a quando la coltura è confluente. NOTA: A seconda delle condizioni di congelamento e del tempo di crioconservazione, il tempo fino alla confluenza può variare. Queste linee cellulari di solito richiedono da 3 a 5 giorni per raggiungere la confluenza in un matraccio T75.</li>
		<li>Dopo che la coltura cellulare BV2 diventa confluente, trasferirla in vetrini a 8 pozzetti 0,6 x 106 cellule/pozzetto. Conservare i vetrini della camera a 8 pozzetti nell'incubatore per 24 ore.</li>
		<li>Una volta che le cellule della microglia sono placcate nei vetrini della camera a 8 pozzetti, ripetere lo stesso protocollo con le cellule GL261.</li>
	</ol></li>
	<li>Attivazione della microglia con β-glucani<ol><li>Rivestire le cellule BV2 con quattro diversi β-glucani (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) ad una concentrazione di 0,2 mg/ml per 72 ore. Una condizione sperimentale deve rimanere non trattata (mezzo normale), agendo come gruppo di controllo.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante con una pipetta dopo 72 ore e far passare il volume rimanente attraverso un filtro a siringa da 0,20 μm. Quindi, congelare il surnatante a -80 °C per almeno 24 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento di GL261 con terreno pre-attivato condizionato da microglia<ol><li>Una volta che GL261 è confluente all'80% all'interno dei vetrini della camera a 8 pozzetti, aggiungere il mezzo microgliale trattato con β-glucano (fase 2.2.2) ad una concentrazione di volume finale del 25% per 72 ore (volume totale: 250 μl/pozzetto).</li>
		<li>Rimuovere il terreno dopo 72 ore di incubazione e scartarlo.</li>
		<li>Lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS; pH 7,4, 0,1 M) tre volte per 5 minuti.</li>
		<li>Fissare le cellule aggiungendo 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per 15 minuti. NOTA: A seconda dei diversi anticorpi che potrebbero essere utilizzati per l'immunofluorescenza, i metodi di fissazione possono differire dal tipico 4% di PFA. I fissativi a base di alcol possono essere più efficienti nel preservare alcuni epitopi.</li>
	</ol></li>
	<li>Studio di immunofluorescenza<ol><li>Lavare i campioni con PBS con tritone X (PBST; 0,01%) per 10 minuti tre volte.</li>
		<li>Rimuovere il PBST e aggiungere tampone bloccante l'albumina sierica bovina (BSA) al 10% in PBST (Tabella 1) per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 200 μL per pozzetto di PBS contenente la miscela di anticorpi primari (1:500 anticorpo monoclonale Ki-67 di ratto e 1:500 anticorpo caspasi-3 scisso di coniglio; vedere Tabella dei materiali). Incubare per una notte a 4 °C.</li>
		<li>Dopo 24 ore di incubazione a 4 °C, lasciare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
		<li>Lavare i pozzetti tre volte per 10 minuti con PBS su uno shaker (bassa velocità).</li>
		<li>Rimuovere il PBS e sostituirlo con 200 μL per pozzetto di PBS contenente la miscela di anticorpi secondari (1:200 anticorpo secondario anti-ratto asino (H + L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 488 e 1:200 anticorpo secondario anti-coniglio anti-coniglio (H + L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 647; vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Lavare i campioni con PBS per 10 minuti su uno shaker multiuso.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL per pozzetto di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in PBS (1:5.000) per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere DAPI (vedere Tabella dei materiali) e lavare le celle per 5 minuti in PBS.</li>
		<li>Rimuovere il telaio del pozzetto e aggiungere 50 μL di PBS:glicerolo (1:1) su ciascun pozzetto e coprire con un vetrino.</li>
		<li>Sigillare le diapositive con lo smalto.</li>
		<li>Acquisire immagini a 20x utilizzando un sistema di microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantificazione e analisi della proliferazione e dell'apoptosi delle cellule tumorali
NOTA: Al fine di misurare il potenziale effetto dei diversi β-glucani sulla proliferazione e sull'apoptosi delle cellule tumorali, è stato utilizzato uno script interno nel software ImageJ per quantificare il numero di pixel positivi di Ki67 (proliferazione) e cCasp3 (apoptosi)13.
<ol><li>Aprire ImageJ. Fare clic sul pulsante Plugin . Fare clic su Coloc2, un plugin precedentemente installato nella cartella plugin, e infine selezionare l'immagine da analizzare11. NOTA: Questo plugin era disponibile dopo un precedente contatto con il Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Invece dello script, sia il software ImageJ che Fiji hanno strumenti diversi per l'analisi di colocalizzazione (vedi Tabella dei materiali), con proprietà simili.</li>
	<li>Impostare le soglie in base alle condizioni di controllo (non trattate, solo DMEM). Fare clic sul pulsante OK . NOTA: per evitare discrepanze di sfondo e intensità, tutte le immagini devono essere scattate nelle stesse condizioni. Preferibilmente, le sessioni di imaging dovrebbero essere eseguite lo stesso giorno e i parametri del microscopio inalterati tra le immagini.</li>
	<li>Assicurati che vengano visualizzate le immagini risultanti dei pixel colocalizzati e una finestra di riepilogo che fornisca la percentuale o il numero non elaborato di pixel al di sopra della soglia. Normalizzare i risultati rispetto alle condizioni di controllo (non trattate). NOTA: Tutti i dati sono indicati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software grafici e di analisi (vedi Tabella dei materiali). È stata utilizzata una ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey. Gli errori sono rappresentati come errore standard della media (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

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Questo lavoro descrive l'uso di tecniche consolidate per isolare, purificare e caratterizzare con successo il contenuto di SβG da quattro diversi funghi. I risultati hanno mostrato come dopo l'estrazione con acqua calda di SMP, ottenuti da P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguita da un trattamento idrolitico con α-amilasi, glucosidasi e proteasi, il contenuto di α-glucano e proteine è stato ridotto, arricchendo così significativamente la quantità di SβG puri.
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Nonostante l'avvento di nuove conquiste nel campo della neuro-oncologia, l'aspettativa di vita dei pazienti con glioblastoma rimane scarsa. Le terapie gold standard contro i tumori cerebrali si basano sulla fusione di chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, nell'ultimo decennio, l'immunoterapia è emersa come una potente strategia per trattare diversi tipi di cancro1. Pertanto, la possibilità di sfruttare la risposta immunitaria del corpo contro le cellule tumorali è recentemente diventata il quarto pilastro dell'oncologia.
È noto da tempo che una delle maggiori sfide nel campo è quella di superare la forte immunosoppressione trovata all'interno del microambiente tumorale2. In particolare, nel caso del glioblastoma, una delle forme più comuni e aggressive di cancro al cervello, svelare percorsi chiave che orchestrano tali scenari pro-tumorali e trovare nuovi composti che potrebbero contrastare la risposta deprimente del sistema immunitario potrebbe aprire la strada a future terapie contro questa malattia incurabile.
Il cervello possiede le proprie cellule del sistema immunitario e il tipo di cellula più rilevante sono le microglia. Queste cellule hanno dimostrato di avere un comportamento piuttosto complesso in diverse malattie centrali3. Nel caso di tumori cerebrali primari (ad esempio, glioblastoma), queste cellule sono spostate verso un fenotipo anti-infiammatorio che supporta le cellule tumorali per colonizzare il parenchima cerebrale3. Numerose pubblicazioni hanno migliorato il ruolo principale di queste cellule durante la progressione del tumore. Una delle ragioni principali di ciò è che la microglia associata al glioma e i macrofagi infiltrati (GAM) rappresentano un terzo della massa tumorale totale, suggerendo così l'influenza inequivocabile dei loro stati di attivazione durante la progressione del tumore cerebrale 4,5.
In questo senso, i β-glucani fungini sono stati descritti come potenti molecole che innescano risposte immunitarie efficaci, tra cui la fagocitosi e la produzione di fattori pro-infiammatori, portando all'eliminazione di agenti perniciosi 6,7,8,9,10. I β-glucani fungini sono stati generalmente studiati utilizzando estratti di diverse parti di funghi. Tuttavia, l'attribuzione di effetti specifici richiede la sua purificazione per evitare ambiguità e per essere in grado di comprendere il meccanismo d'azione di tali molecole come agenti immunomodulatori8.
In questo lavoro, i β-glucani solubili sono purificati dal corpo fruttifero di quattro diversi funghi, regolarmente impiegati come funghi commestibili (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinali (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). In particolare, questi quattro funghi hanno un grande uso nell'industria alimentare e farmaceutica e sono stati prodotti nell'ambito di un'economia circolare rispettosa dell'ambiente in un'impresa commerciale (vedi Tabella dei materiali).
Al fine di gettare le basi per l'uso futuro di β-glucani fungini nelle terapie del cancro al cervello, strategie di purificazione ben definite e studi preclinici che approfondiscono la loro presunta interazione con le cellule del sistema immunitario sono essenziali per valutare il loro potenziale ruolo come mediatori antitumorali. Questo lavoro descrive i numerosi passaggi di isolamento e purificazione necessari per recuperare i β-glucani solubili contenuti all'interno dei corpi fruttiferi del fungo selezionato. Una volta purificate con successo, le cellule della microglia vengono attivate per migliorare il loro fenotipo infiammatorio. Le cellule di glioblastoma di topo (GL261) sono rivestite con un diverso mezzo condizionato dalla microglia, precedentemente trattato con questi estratti, e quindi viene valutato il suo effetto sul comportamento delle cellule tumorali. È interessante notare che studi pilota del nostro laboratorio (dati non mostrati) hanno scoperto come la microglia pro-infiammatoria possa rallentare la migrazione delle cellule tumorali e le proprietà di invasione non solo nelle cellule di glioblastoma ma anche in altre linee cellulari tumorali. Questo lavoro multidisciplinare può fornire uno strumento utile per i ricercatori oncologici per testare composti promettenti in grado di aumentare la risposta immunitaria in molti diversi tipi di tumori.

<table><tbody><tr><td>Vetrini a 8 pozzetti</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Forno di essiccazione ad aria</td><td>J.P. Selecta S.A., Spagna</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Danimarca</td><td>proteasi</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Mulino a lame</td><td>Retsch, Germania</td><td>&nbsp; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>MERK, Germania</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Membrana per tubi di cellulosa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>MERK, Germania</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Pluggins di colocalizzazione</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Germania</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Danimarca</td><td>destrano 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Eagle modificato&acuto; s medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- Amilasi/Glucoamilasi)</td><td>Novozymes, Danimarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro FT-IR</td><td>Bruker-Vertex, Svizzera</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>di grafica e analisiGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema H2SO4HPLC</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Waters</td><td>Corp, Milford, MA, USA</td><td>Incubatore HPLC</td><td></td>Waters 2695</tr><tr><td></td><td>Spettrometro di massa Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>MERK, Germania</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Crison, Barcellona, Spagna</td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato Basic 20</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Caspasi-3 (Asp175) di coniglio</td><td>Abcam, Regno Unito</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Thermofisher monoclonale di ratto Ki-67</td><td>, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>B&uuml; chi Ib&eacute; rica S.L.U., Spagna</td> Colonna di filtrazione lineare in gel ultra-idrogel <td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>(300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Visibile</td><td>Amersham Bioscience, Regno Unito</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, USA</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>J.P. Selecta S.A., Spagna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microscopio confocale Zeiss LSM 7 DUO.</td><td>Zeiss, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucano Assay Kit</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucani</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Fornite le quattro varianti di funghi</td></tr></tbody></table>

isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia immunoterapica per il glioblastoma

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Una delle maggiori sfide nello sviluppo di terapie efficaci contro il glioblastoma è superare la forte soppressione immunitaria all'interno del microambiente tumorale. L'immunoterapia è emersa come una strategia efficace per trasformare la risposta del sistema immunitario contro le cellule tumorali. I macrofagi e le microglia associati al glioma (GAM) sono i principali motori di tali scenari anti-infiammatori. Pertanto, il miglioramento della risposta antitumorale nelle GAM può rappresentare una potenziale terapia coadiuvante per il trattamento dei pazienti con glioblastoma. In questo senso, le molecole fungine di β-glucano sono state a lungo conosciute come potenti modulatori immunitari. È stata descritta la loro capacità di stimolare l'attività immunitaria innata e migliorare la risposta al trattamento. Queste caratteristiche modulanti sono in parte attribuite alla loro capacità di legarsi ai recettori di riconoscimento dei pattern, che, curiosamente, sono molto espressi nei GAM. Pertanto, questo lavoro è focalizzato sull'isolamento, la purificazione e il successivo uso di β-glucani fungini per migliorare la risposta tumoricida della microglia contro le cellule di glioblastoma. Le linee cellulari di glioblastoma di topo (GL261) e microglia (BV-2) sono utilizzate per testare le proprietà immunomodulatorie di quattro diversi β-glucani fungini estratti da funghi pesantemente utilizzati nell'attuale industria biofarmaceutica: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Per testare questi composti, sono stati eseguiti saggi di co-stimolazione per misurare l'effetto di un mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia sulla proliferazione e l'attivazione dell'apoptosi nelle cellule di glioblastoma.

Purificazione riuscita dei β-glucani La massa di MP, SMP e SβG ottenuta dai corpi fruttiferi di P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus dopo il processo di estrazione e purificazione è riassunta nella tabella 1. La composizione di base (carboidrati totali, β-glucani e proteine) di MP, SMP e SβG ottenuti dai funghi è raffigurata nella Tabella 2. Questi risultati mostrano come il protocollo abbia permesso il recupero di una...

Il presente protocollo descrive le fasi di purificazione e i successivi studi di quattro diversi β-glucani fungini come potenziali molecole immunomodulatrici che potenziano le proprietà antitumorali della microglia contro le cellule di glioblastoma.

Isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia immunoterapica per il glioblastoma

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

I beta-glucani fungini sono importanti modulatori del sistema immunitario. Migliorare i protocolli di purezza e isolamento è essenziale per affermare il loro potenziale ruolo come coadiuvanti per la terapia del cancro. Un alto grado di quattro diversi beta-glucani è stato raggiunto utilizzando vari dispositivi comunemente presenti nei laboratori di biologia molecolare e proteomica.Questo protocollo si concentra sul test degli effetti dei beta-glucani sulla microglia, la cellula immunitaria residente più abbondante del cervello. La modulazione del fenotipo della microglia nel glioblastoma può fornire importanti informazioni su. Iniziare l'estrazione di polisaccaridi solubili di funghi o SMP risciacquando corpi fruttiferi freschi di Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum con acqua distillata cinque volte.Quindi asciugare completamente i corpi fruttiferi lavati a 50 gradi Celsius in un forno di essiccazione ad aria convenzionale per circa 24 ore prima di macinarli in un mulino a lama ottenendo circa 200 grammi di polvere da ciascun fungo. Quindi, sospendere 100 grammi di tutte e quattro le polveri di funghi o MP in 1.000 millilitri di acqua distillata e autoclavare la sospensione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione risultante a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi asciugare il precipitato contenente polisaccaridi di funghi insolubili o IMP a 50 gradi Celsius in un forno ad aria di essiccazione per 24 ore. Scartare il precipitato e concentrare il surnatante 10 volte in un evaporatore rotante. Quindi, precipitare il concentrato contenente SMP con etanolo durante la notte a quattro gradi Celsius.Dopo aver centrifugato la sospensione di etanolo a 6.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante con una pipetta e lavare il pellet tre volte con etanolo all'80% prima di scioglierlo e acqua distillata. Regolare il pH a 6,5-7 e la temperatura a 37 gradi Celsius e solubilizzare gli alfa-glucani trattando la sospensione con due unità e quattro unità di alfa-amilasi e glucoamilasi rispettivamente. Quindi, regolare il pH a 8,0 e la temperatura a 50 gradi Celsius e solubilizzare le proteine trattando la sospensione con alcalasi equivalente a 2,5 unità per grammo di proteine.Dopo l'idrolisi, centrifugare l'idrolizzato e pulire il concentrato di surnatante cinque volte in un evaporatore rotante. Precipitare nuovamente il concentrato di surnatante aggiungendo l'80% di etanolo. Per rimuovere le molecole a basso peso molecolare, solubilizzare il precipitato in acqua distillata e dializzarlo nell'acqua distillata per 24 ore utilizzando 12.000 membrane di tubi di cellulosa Dalton.Recuperare la parte solubile in acqua e liofilizzarla per produrre beta-glucani solubili o S beta-G. Valutare separatamente i glucani totali e gli alfa-glucani. Misurare i valori di beta-glucano risultanti come differenza tra i valori totali di glucano e alfa-glucano.Per ottenere gli spettri UV S beta-G utilizzando uno spettrofotometro UV visibile, preparare 1,0 milligrammi per millilitro di ogni S beta-G in acqua distillata. Trasferire il campione in una cuvetta di quarzo e scansionarlo a temperatura ambiente nella regione da 200 a 400 nanometri. Stimare l'omogeneità di S beta-G e il peso molecolare dei polimeri mediante cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC utilizzando una cromatografia liquida ad alte prestazioni o un sistema HPLC dotato di un rivelatore UV visibile e di una colonna di filtrazione in gel Superdex TM 200 10/300 GL.Registrare gli spettri infrarossi del campione su uno spettrometro a infrarossi o FTIR a trasformata di Fourier nell'intervallo da 4.000 a 500 per centimetro. Attivare la microglia rivestendo le cellule della microglia BV2 per 72 ore con una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro di quattro diversi beta-glucani isolati da P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum e H.erinaceus. Dopo 72 ore, raccogliere il surnatante con una pipetta e passare il volume rimanente attraverso un filtro a siringa da 0,20 micrometri.Quindi congelare il surnatante a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Per trattare GL 261 con il mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia, aggiungere 250 microlitri di terreno microgliale trattato con beta-glucano all'80% di cellule GL 261 confluenti per 72 ore. Scartare il mezzo dopo 72 ore.Gli spettri UV dei diversi S beta-G non hanno mostrato picchi di assorbimento UV a 260 e 280 nanometri, indicando che gli S beta-G mancavano di acidi nucleici e proteine. I cromatogrammi HPLC hanno mostrato una buona omogeneità con un picco principale acuto e singolo a 10,9 minuti per P.ostreatus, 10,5 minuti per lucidum, 11,3 minuti per P.djamor e 8,20 minuti per H.erinaceus, suggerendo che la frazione è coerente con gli omopolimeri. Gli spettri FTIR hanno misurato le vibrazioni molecolari corrispondenti ai legami polisaccaridici covalenti.Ha dimostrato che i beta-G SS comprendevano carboidrati coniugati con una proteina minima. HPTLC e GC-MS analizzando il profilo monosaccaridico di S beta-G hanno rivelato la presenza di una grande quantità di D-glucosio, piccole quantità di D-galattosio e D-mannosio e una traccia di D-xilosio, D-ramnosio, D-fucosio e L-arabinosio. Utilizzando uno script interno nel software ImageJ, è stato quantificato il numero di pixel positivi per ciascun canale fluorescente.Lo script utilizzava campioni di controllo come soglia per l'intensità di ciascun fluoroforo e forniva il numero di pixel. Ha indicato l'espressione per ciascun marcatore dopo diverse condizioni sperimentali. È interessante notare che GL 261 non ha subito differenze significative per quanto riguarda la proliferazione tumorale sull'esposizione ai diversi mezzi condizionati dalla microglia.Tuttavia, P.djamor e H.erinaceus hanno mostrato una forte induzione di un aumento di circa sei e nove volte rispettivamente della caspasi-3 scissa. Garantire una purezza di alta qualità dei beta-glucani è essenziale per questo protocollo. Questo protocollo utilizza apparecchiature avanzate come spettrofotometro, HPLC.o FITR. L'utilizzo di questi strumenti migliora la robustezza dei nostri risultati. Possiamo analizzare con sicurezza gli effetti dei beta-glucani sulla microglia e ottenere risultati più sicuri.A causa del tempo e dei limiti mondiali, abbiamo limitato il nostro protocollo allo studio dei beta-glucani sulle cellule microgliali. Tuttavia, altre cellule del sistema immunitario come macrofagi o cellule T possono essere facilmente durante questo protocollo. Per la prima volta, questi protocolli combinano due diverse aree di conoscenza.In primo luogo, l'uso di procedure biotecnologiche per purificare prodotti specifici e, in secondo luogo, l'uso di tecniche di coltura cellulare per testare le loro proprietà immunomodulatorie.

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Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Questo video mostra un test in vitro che utilizza β-glucani per attivare le cellule microgliali per la produzione di radicali superossido, una specie reattiva dell'ossigeno. Nelle cellule tumorali cerebrali, gli ossidanti reattivi generati sopprimono attivamente la proliferazione delle cellule tumorali e inducono la morte cellulare.

Un test per l'analisi del test β-glucano come strategia di immunoterapia contro le cellule tumorali cerebrali

Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Gli effetti linfodepletivi e immunomodulatori della chemioterapia e dello standard di cura delle radiazioni possono essere sfruttati per migliorare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia con cellule T. Descriviamo un metodo per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) specifiche per EGFRvIII e somministrarle nel contesto dello standard di cura del glioblastoma.

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Alla ricerca di tumore terapeutiche cellule staminali mesenchimali (MSCs) mostrano la promessa come trattamento per glioblastoma dilagante. Trapianto ottimo coinvolge consegna delle MSC in cavità di resezione del tumore su ponteggi. Qui, preclinici tecniche per studiare il trattamento del MSC di glioblastoma sono forniti tra cui: resezione del tumore immagine-guida; impianto di scaffold MSC-seminato; e terapia postoperatoria di rilevamento.

Immagine-Guida di resezione del Glioblastoma e l'impianto intracranico di terapeutica delle cellule staminali-seminato ponteggi

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

Scopri il protocollo di isolamento e purificazione di β-glucani fungini per valutare il loro potenziale immunomodulatorio contro le cellule di glioblastoma. Questo metodo combina tecniche biotecnologiche avanzate con colture cellulari per studiare l'attivazione dei microglia.

Isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia immunoterapica per il glioblastoma

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