Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Questo protocollo è il primo a descrivere come elaborare e valutare le dimensioni del topo per le patologie RP utilizzando elettroni a trasmissione luminosa e microscopia confocale. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'inclusione di valutazioni quantitative delle patologie RP, utilizzando queste tre tecniche di imaging per confronti statistici. Le tecniche descritte in questo protocollo possono anche aiutare ad ampliare la nostra conoscenza dei percorsi molecolari importanti per la salute dell'RPE.

Gli individui che non hanno precedentemente sezionato le dimensioni del mouse possono avere difficoltà con questo protocollo. Suggeriamo a questi individui di esercitarsi con alcuni topi per padroneggiare le tecniche descritte in questo protocollo. Per iniziare, preparare un sistema di perfusione per gravità su un sottoscocca assorbente per la perfusione cardiaca in una cappa aspirante.

Versare 40 millilitri di tampone fissativo appena preparato nel cilindro della siringa del sistema di perfusione. Ruotare la valvola parallelamente alla linea dei tubi per consentire al buffer di fluire attraverso la linea dei tubi. Lavare la linea fino a rimuovere tutte le bolle d'aria dalla linea.

Quindi ruotare la valvola perpendicolarmente alla linea del tubo per impedire al buffer di fluire nella linea del tubo. Per eseguire la perfusione cardiaca, trasferire il topo eutanasia in un vassoio poco profondo vicino al sistema di perfusione. Con l'addome rivolto verso l'alto.

Spruzzare l'addome con etanolo al 70%, quindi creare un taglio inferiore di cinque centimetri usando forbici e pinze curve attraverso la pelle e la parete addominale sul lato sinistro del topo sotto la gabbia toracica. Procedere a fare un taglio mediale di tre centimetri attraverso la pelle e la parete addominale nella parte superiore del taglio inferiore. Fai un altro taglio inferiore di cinque centimetri alla fine del taglio mediale attraverso la pelle e la parete addominale sul lato destro del topo sotto la gabbia toracica.

Fai un'altra incisione mediale di tre centimetri per rimuovere il lembo della pelle addominale con una pinza curva. Quindi, tagliare il diaframma e lo sterno per esporre il cuore. Inserire l'ago del misuratore nel ventricolo sinistro del cuore e ruotare la valvola.

Tagliare l'atrio destro con forbici curve per consentire al sangue e al fissativo di uscire dal cuore. Lasciare 10 millilitri di tampone fissativo per perfondere il topo per uno o due minuti, o fino a quando il fegato diventa di colore pallido e nessun sangue fuoriesce dall'atrio destro. Una volta completata la perfusione, ruotare la valvola perpendicolarmente alla linea del tubo per arrestare il flusso del tampone.

Per nucleare gli occhi, rimuovere il mouse dal vassoio poco profondo e posizionarlo sul sottoscocca assorbente in una cappa aspirante. Quindi orientare la testa del topo con l'occhio sinistro rivolto verso lo sperimentatore e l'occhio destro fuori dalla vista. Annotare il lato superiore dell'occhio con un colorante per la marcatura dei tessuti.

Spingere delicatamente verso il basso intorno all'orbita oculare con il pollice e l'indice per la sporgenza dell'occhio dall'orbita oculare. Quindi, usando le forbici curve, tieni l'occhio con la lama con un angolo di 30 gradi dall'orbita dell'occhio e taglia intorno all'occhio. Rimuovere il bulbo oculare dalla testa con una pinza curva e posizionarlo su un sottoscocca assorbente.

Tagliare la cornea con una lama di bisturi numero 11 e posizionare l'occhio con una pinza curva in un micro tubo da due millilitri contenente due millilitri di tampone fissativo. Dopo aver nucleizzato entrambi gli occhi, incubarli in un tampone fissativo durante la notte su uno shaker in una stanza di quattro gradi ad una velocità di 75 giri / min. Il giorno seguente, sostituire il tampone fissativo con due millilitri di PBS e incubare per 10 minuti su uno shaker a temperatura ambiente e 75 giri / min.

Successivamente per generare segmenti posteriori posizionare l'occhio in una capsula di Petri piena di PBS sotto un microscopio da dissezione. Sollevare delicatamente il grasso e il muscolo lontano dal bulbo oculare con una pinza a punta fine. Tagliare con cura il grasso e il muscolo con micro forbici da dissezione in direzione parallela al bulbo oculare fino a quando il bulbo oculare ha un colore nero-bluastro uniforme Posizionare una pinza a punta fine nel sito di puntura corneale e tagliare attorno al perimetro della cornea iniziando dal sito di puntura con micro forbici da dissezione per rimuovere la cornea e l'iride dal bulbo oculare.

Quindi, utilizzando una pinza a punta fine, rimuovere delicatamente la lente dal bulbo oculare per ottenere il segmento posteriore. Posizionare il segmento posteriore in un tubo contenente due millilitri di PBS e conservare a quattro gradi Celsius in frigorifero fino all'uso. Trasferire l'occhio su una capsula di Petri contenente PBS e rimuovere la cornea e l'iride come dimostrato.

Estrarre l'obiettivo con una pinza a punta fine. Quindi, utilizzando due pinze a punta fine, separare delicatamente la retina neurale dal segmento posteriore. Tagliare con cura la retina neurale alla testa del nervo ottico per la rimozione dalla coppa oculare posteriore.

Posizionare la concia oculare in un micro tubo da due millilitri contenente cinque microlitri di PBS. Per fissare le conchiglie oculari posteriori, aggiungere 500 microlitri di metanolo al tessuto e incubare su uno shaker a 75 giri / min, per cinque minuti. Ripetere la fissazione del metanolo tre volte con l'incubazione finale per due ore.

Dopo la fissazione, lavare il tessuto tre volte con PBS, prima di procedere alla colorazione con immunofluorescenza e alla visualizzazione attraverso la microscopia confocale. I topi TMEM 135 TG di quattro mesi hanno mostrato una significativa riduzione dell'epitelio pigmentato retinico o dello spessore RPE a 600 e 900 micrometri di distanza dal nervo ottico, rispetto ai topi wild type di pari età. Sono stati calcolati gli incidenti di patologie RPE tra cui microvascuolizzazione, macrovacuolizzazione e migrazione di topi WT e TMEM 135 TG di 325 giorni.

La frequenza media di microvacuolizzazione RPE era inferiore nel tipo selvatico rispetto ai topi TMEM 135 TG. Nessuna macrovacuolizzazione e migrazione RPE è stata rilevata nel wild type rispetto ai valori medi osservati nei topi TMEM 135 TG. Nella microscopia elettronica a trasmissione, sono stati osservati depositi laminari basali nelle retine di 24 mesi che erano assenti nelle retine di due mesi.

L'analisi delle frequenze cumulative delle altezze dei depositi laminari basali, ha indicato uno spostamento a destra della linea per il 24 mesi, rispetto ai due mesi, dimostrando un aumento dei depositi nei topi di 24 mesi. Questa osservazione è stata supportata da altezze medie più elevate nelle retine di 24 mesi. RPE nei topi TMEM 135 TG di quattro mesi era dismorfico.

L'RPE nelle retine TMEM 135 TG è più grande e meno denso delle retine wild type di pari età. Inoltre, sono state osservate più cellule RPE multinucleate nelle retine TG, rispetto ai controlli. Seguendo questo protocollo i ricercatori potrebbero valutare percorsi specifici utilizzando tecniche di biologia molecolare nei topi, che potrebbero contribuire alla nostra comprensione di come queste patologie RP si sviluppano nei topi.

Questo protocollo aiuterà a standardizzare la fenotipizzazione RP nei topi, che tradurrà i risultati degli studi sui topi in altri modelli AMD e aiuterà nella nostra comprensione della patobiologia AMD.