Name: Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a rastrear canais iônicos individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia TIRF, sem necessidade de marcação fluorescente que interfere na função proteica. Este método óptico de molécula única revela a relação entre mobilidade lateral e atividade do canal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Beate Nitschke por sua ajuda com a preparação de proteínas e a Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) e Maximilan Ulbrich (Freiburg) por discussões perspicazes. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Pesquisa em Biologia de Sistemas de Stuttgart (SRCSB) e uma bolsa da Fundação Baden Württemberg (BiofMO-6 para SN).

Declaramos a inexistência de conflitos de interesse.

O protocolo aqui apresentado fornece uma introdução ao uso de membranas DIB para estudar a interação entre o movimento do canal iônico lateral e a função do canal usando microscopia TIRF de molécula única. Para obter os melhores dados possíveis, a preparação de membranas DIB estáveis com o maior número possível de canais bem separados é crucial para a obtenção de séries temporais de partículas individuais, que podem ser analisadas satisfatoriamente.
Os parâmetros críticos a serem otimizados incluem a escolha do lipídio, a concentração de lipídios na fase oleosa e as concentrações de proteína e detergente nas gotículas aquosas. Os lipídios empregados são incomuns, pois não apresentam transição de fase clara em baixas temperaturas. O DPhPC é um lipídio comumente usado para produzir sistemas de membrana estáveis40. Em princípio, qualquer lipídio que mantenha seu ambiente fluido em baixas temperaturas pode ser adequado para esta aplicação. Além disso, o lipídio não deve ser sensível à oxidação. A concentração de detergente nas gotículas deve ser a mais baixa possível para evitar a ruptura da membrana. Membranas estáveis e boas taxas de incorporação de proteínas são geralmente alcançadas com concentrações de detergente abaixo da concentração micelar crítica (CMC), uma vez que a proteína de membrana não precipita.
Se as membranas de DIB não tolerarem detergentes específicos21,41, ou se as proteínas não se integrarem a partir de solução de baixo detergente às membranas de DIB, os canais proteicos podem primeiro ser reconstituídos em pequenas vesículas lipídicas unilamelares (SUVs), que são então fundidas às membranas de DIB do lado da gota, como foi demonstrado com sucesso para E. coli MscL 42 . Às vezes, as membranas de DIB não se formam porque a concentração de lipídios na fase oleosa é muito baixa. Para evitar o rompimento das membranas de DIB, deve-se também estar ciente de que a pressão osmótica entre o hidrogel e a gotícula deve ser precisamente equilibrada sem afetar o fluxo de Ca2+ de cis para trans excessivamente. A espessura e a malha otimizadas da agarose parecem ser cruciais para observar a difusão das proteínas de membrana. Qualquer ressecamento da camada de agarose deve ser evitado. A espessura pode ser determinada por microscopia de força atômica17. Variando a concentração, o volume e a velocidade de rotação de agarose durante o revestimento de spin, o tamanho da malha e a espessura do hidrogel podem ser otimizados. Note, no entanto, que a espessura da camada de hidrogel afeta o contraste da imagem. Para capturar proteínas de membrana em DIBs, o hidrogel de agarose pode ser substituído por agarose de baixo derretimento sintetizado, não reticulado, modificado por Ni-NTA e de baixo derretimento para aprisioná-los através de um His-tag17. Um fundo de fluorescência excessivamente alto é frequentemente causado pela ruptura das membranas DIB. Isso é particularmente um problema com câmaras de poços múltiplos, já que o corante sensível ao Ca2+ se difunde para o hidrogel. Neste caso, poços adjacentes devem ser evitados. O clareamento por fluorescência do corante sensível ao Ca2+ acima da membrana não deve ser um fator limitante significativo, pois é trocado por corantes não excitados na maior parte da gotícula (Figura 3A) fora do campo evanescente do TIRF. A precisão de localização para a proteína é dada pela precisão de ajuste dos pontos e do tamanho do pixel.
Sinais de fluorescência fracos podem ser causados pelo baixo fluxo de Ca2+ através do canal. Possíveis razões incluem: (i) configurações imprecisas de TIRF (por exemplo, intensidade do laser), (ii) a pressão osmótica de Ca 2+ através da membrana ou (iii) a permeabilidade intrínseca de Ca2+ dos canais é muito baixa. Para lidar com o primeiro problema, a intensidade do laser, o ângulo TIRF e o ganho da câmera precisam ser otimizados. As duas últimas questões podem ser superadas com a aplicação de um potencial elétrico através da membrana 2,43. No entanto, a aplicação de tensões externas pode distorcer o resultado, pois efeitos elétricos podem influenciar a abertura do canal de canais iônicos ligados ao ligante ou mecanossensíveis que, na verdade, não são controlados por tensão. Exemplos de tais canais são a proteína mitocondrial translocase TOM-CC27, e sua subunidade formadora de canais Tom40 26,44,45,46. Finalmente, deve-se notar que a inserção de proteínas de membrana em membranas DIB em uma orientação específica para alcançar a funcionalidade desejada é complicada, e estudos quantitativos são raros47,48. Em alguns casos, a orientação das proteínas integradas é aleatória. Este é um problema sério para o estudo de proteínas de membrana, porque certas proteínas de membrana são ativadas em apenas um lado da membrana.
A microscopia TIRF é um método poderoso para abordar eventos de molécula única em membranas planares suportadas49. Exemplos incluem a montagem e elucidação da via de dobramento de proteínas do canal como α-hemolisina 50, perfringolisina O51 e OmpG52. Esses estudos incluíram o FRET como técnica adicional. Além disso, a ativação do canal iônico mecanossensível MscL foi previamente estudada por estimulação mecânica de bicamadas DIB suportadas42 usando medidas de corrente. Com base neste trabalho, estudos futuros poderiam combinar a plataforma aqui descrita com experimentos de FRET de molécula única para abordar canais mecanossensíveis em nível de molécula única de forma óptica17. A injeção de tampão na gota, o estiramento da monocamada DIB interna ou a ligação direcionada de canais individuais ao hidrogel subjacente podem ser usados para estudar mais detalhadamente não apenas o mecanismo físico dos canais ativados mecanicamente, que respondem à tensão e/ou curvatura da membrana, como mostrado para MscL e MscS, os canais K+ de domínio de dois poros, TREK-1, TREK-2, e TRAAK, e PIEZO (para revisão, ver53), mas também ligação local ao citoesqueleto celular, como mostrado para o canal iônico sensível ao toque NOMPC54,55.

O presente protocolo tem como objetivo descrever como estudar a correlação entre a mobilidade da membrana e a permeabilidade do canal iônico de proteínas de membrana em membranas de bicamada de interface gota-gota (DIB) suportada por polímero 1,2,3.
A presente técnica complementa uma impressionante gama de ferramentas ópticas e analíticas de superfície avançadas, tais como rastreamento de partículas únicas 4,5, espectroscopia de correlação de fluorescência6,7 e microscopia de força atômica de alta velocidade 8,9,10. Estes fornecem informações valiosas sobre a composição dinâmica e a estrutura das membranas que influenciam as reações baseadas em membranas11,12,13. Enquanto o movimento e a difusão lateral das proteínas dependem da densidade local das proteínas na membrana, moléculas proteicas individuais também podem ser aprisionadas em jangadas lipídicas14 e por interações proteína-proteína15,16. Dependendo dos domínios proteicos que se projetam da membrana para o meio extracelular ou citosol, a mobilidade da proteína pode variar de altamente móvel a completamente imóvel. No entanto, devido à complexidade da membrana e de suas estruturas periféricas, muitas vezes é difícil decifrar a interação entre a natureza da mobilidade lateral e a função proteica17.
As membranas DIB têm se mostrado uma plataforma eficiente para análises biofísicas de moléculas únicas de proteínas de membrana 18,19,20,21,22. São formados pela automontagem lipídica através do contato de gotículas aquosas com substratos suportados em hidrogel em fase lipídica/oleosa. À semelhança das bicamadas lipídicas suportadas (BCLs) comumente utilizadas1,23,24,25, as DIBs permitem sintonia local da mobilidade lateral pela ligação temporária ou permanente de proteínas à matriz polimérica quando funcionalizadas com ligantes adequados17. Este último pode servir como sistema modelo para processos bioquímicos em membranas celulares com distribuição heterogênea deproteínas10.
A abordagem experimental aqui descrita baseia-se na fluorescência de corantes sensíveis ao Ca 2+ para medir o fluxo do íon Ca 2+ através de canais individuais próximos à membrana 2,22 usando microscopia TIRF. Esta abordagem óptica limita a iluminação da amostra a uma distância próxima à membrana, o que, devido às propriedades físicas da luz de excitação evanescente, leva a uma redução significativa da fluorescência de fundo. Este último é um pré-requisito se alta resolução espacial e temporal for necessária para a detecção de moléculas únicas. Ao contrário dos métodos eletrofisiológicos clássicos26,27, não são necessárias tensões de membrana para estudar o fluxo iônico através de canais individuais. Além disso, o método não requer marcação com corantes fluorescentes ou moléculas que possam interferir com o movimento lateral dos canais na membrana.
O método é particularmente útil para estudar canais de proteínas embutidas na membrana no nível de uma única molécula sem usar eletrofisiologia clássica. Usando o canal condutor de proteínas mitocondriais TOM-CC de Neurospora crassa28,29,30 e OmpF, que suporta a difusão de pequenas moléculas hidrofílicas através da membrana externa de Escherichia coli17,31, ilustramos como as mobilidades da membrana e as atividades de canal das duas proteínas podem ser estudadas e correlacionadas. Sugerimos que esta abordagem, embora otimizada para TOM-CC e OmpF, pode ser prontamente aplicada a outros canais de proteína.

<table><tbody><tr><td>1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x Objetiva de óleo Apocromático N.A. 1.49</td> Microscópio TIRF <td>MRD01991 Nikon</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetiva de contraste de modulação Hoffmann 10x NA 0.25&nbsp;</td><td>Microscópio Nikon</td><td></td><td>para avaliar a formação de membrana DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Objetiva N.A. 0.25</td><td>Nikon</td><td>MRL00102</td><td>microscópio TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>40x Objetiva de contraste de modulação Hoffmann NA 0.55</td><td>Microscópio Nikon</td><td></td><td>para avaliar a formação de membrana DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Laser de 488 nm, 100 mW&nbsp; &nbsp;</td>Microscópio TIRF <td>Visitron</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fita</td><td></td><td></td><td></td> adesiva</tr><tr><td>&Auml; KTA PURE&nbsp; &nbsp;</td><td>Sistema de purificação de proteínas</td> <td>Cytiva</td><td></td></tr><tr><td>Bradford kit de ensaio, Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Resina Chelax 100</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio&nbsp;</td>de diálise <td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>Câmara DIB&nbsp;</td>Câmara <td>PMMA feita sob medida</td><td></td><td>para membranas DIB</td></tr><tr><td>Medidor de potência digital e console de energia</td> Medidor de potência a laser <td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Roth</td><td>&nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr> Microscópio de contraste de modulação <tr><td>H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 duplamente destilado&nbsp;</td><td>Microscópio Nikon</td><td></td><td>para avaliar a formação de membrana DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>Microscópio TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo Ti70</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluorTM</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-362561</td><td>Corante sensível a Ca2+</td></tr><tr><td>homogeneizador de ruptura de células de prensa francesa</td><td>Igneus</td><td>Igneus 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>Filtro GFP</td><td>AHF</td><td></td><td>Filtro de infiltração usado para excitação de membranas DIB por epifluorescência com fonte de luz branca&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidro</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 40 mm x 24 mm x 0,13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 10 mL</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 100 mL</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton 500 mL</td><td>Roth</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento&nbsp;</td>Placa de aquecimento <td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Minitube&nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth&nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>Hexadcane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>His Trap HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>coluna Ni-NTA</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>10314243</td><td></td></tr><tr><td>KLM spin coater&nbsp;</td><td>Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>Lista médica L/M-3P-A extrator de pipeta vertical</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão agarose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Estereomicroscópio A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8</td><td>Wild</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil pontas de pipeta</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>N2 gás</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Injetor Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitro 2010&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanolitro 2010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecil-b-d-maltosídeo</td><td>Glycon Bioquímicos</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose, cubo não reticulado</td><td></td><td>124115393</td> Software <td>personalizado</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td></td> Nikon <td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>n-octil-polioxietileno Sigma-Aldrich</td><td></td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O2 gás</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonila</td><td>Roth&nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de fotodiodo&nbsp; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td><td>Sensor Thorlabs</td><td>S130C</td><td>para medidor de potência a laser&nbsp;</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Diener Electronics</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga preparativa Optima</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro TIRF-band quad-band 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>Configuração de filtro usada para excitação de membranas DIB com laser de 488 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Recurso Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>Coluna de troca aniônica</td></tr><tr><td>Óleo de silício AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Super LoLux</td><td>JVC</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Microscópio de fluorescência&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>Banho Ultrassônico&nbsp;</td><td>Bomba de vácuo Bandelin Sonorex</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vacuubrand</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz branca para iluminação de epifluorescência (100 W)</td> <td>Microscópio</td><td>TIRF</td> <td>Nikon MBF72655</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (tirf)

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Técnicas de imagem de alta resolução têm mostrado que muitos canais iônicos não são estáticos, mas sujeitos a processos altamente dinâmicos, incluindo a associação transitória de subunidades auxiliares e formadoras de poros, difusão lateral e agrupamento com outras proteínas. No entanto, a relação entre difusão lateral e função é pouco compreendida. Para abordar este problema, descrevemos como a mobilidade lateral e a atividade de canais individuais em membranas lipídicas suportadas podem ser monitoradas e correlacionadas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF). As membranas são fabricadas sobre um substrato hidrogel ultrafino usando a técnica de bicamada de interface de gotículas (DIB). Em comparação com outros tipos de membranas modelo, essas membranas têm a vantagem de serem mecanicamente robustas e adequadas para técnicas analíticas altamente sensíveis. Este protocolo mede o fluxo de íons Ca 2+ através de canais únicos, observando a emissão de fluorescência de um corante sensível ao Ca2+ em estreita proximidade com a membrana. Em contraste com as abordagens clássicas de rastreamento de molécula única, não são necessárias proteínas ou marcadores de fusão fluorescente, que podem interferir com o movimento lateral e a função na membrana. Possíveis alterações no fluxo iônico associadas a mudanças conformacionais da proteína são devidas apenas ao movimento lateral da proteína na membrana. Resultados representativos são mostrados usando o canal de translocação de proteínas mitocondriais TOM-CC e o canal bacteriano OmpF. Em contraste com OmpF, o fechamento do TOM-CC é muito sensível ao confinamento molecular e à natureza da difusão lateral. Assim, as bicamadas suportadas de interface gota-gota são uma ferramenta poderosa para caracterizar a ligação entre a difusão lateral e a função dos canais iônicos.

A gravação óptica de canal único sem eletrodos em tempo real revela a interação entre o movimento lateral da proteína e a função de canais iônicos individuais em membranas DIB. A reconstituição do complexo mitocondrial TOM core (Figura 1A) em uma membrana DIB (Figura 4D) ilustra uma forte correlação temporal entre mobilidade lateral e permeabilidade iônica (Figura 5A). O gating TOM-CC parece ser sensível ao modo de movimento lateral17. Canais móveis mostram fluxo de Ca2+ através de seus poros e altas intensidades de ponto de fluorescência. Moléculas aprisionadas e não móveis apresentam baixas e médias intensidades de fluorescência. Para o poro geral de importação de proteínas da mitocôndria TOM-CC, esta abordagem de molécula única revelou uma forte correlação temporal entre mobilidade lateral e permeabilidade iônica, sugerindo que o canal TOM-CC tem propriedades mecanossensíveis17. Uma parada lateral de moléculas de TOM-CC em movimento livre é acompanhada por um fechamento parcial ou completo do canal de TOM-CC. A aquisição de imagens das membranas DIB com OmpF (Figura 1E e Figura 4F), que está quase totalmente embutida na membrana, não mostra efeitos stop-and-go (Figura 5B). As paradas aleatórias da OmpF não estão associadas a uma mudança de intensidade e, portanto, ao fechamento de seus poros. Com base nos sinais de fluorescência38, a precisão posicional dos canais individuais pode ser estimada na faixa entre 5 e 10 nm. No entanto, deve-se notar que essa precisão não pode ser alcançada se os canais oscilarem ligeiramente devido à ancoragem móvel com o hidrogel de agarose, como mostrado, por exemplo, para as moléculas TOM-CC em um estado intermediário com um deslocamento médio da raiz de 120 nm (Figura 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento do TOM-CC. (A) Estrutura Cryo EM de N. crassa TOM-CC30,39. Mitocôndrias de uma cepa de N. crassa contendo Tom22 com tag 6xHis foram solubilizadas em DDM e submetidas à cromatografia de afinidade Ni-NTA (B) e cromatografia de troca iônica (C). (D) SDS-PAGE do TOM-CC isolado. (E) Estrutura cristalina (PDB, 1OPF) e (F) SDS-PAGE de E. coli OmpF purificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figura 2: Fluxograma de montagem da câmara de PMMA. Passo 1: Uma tampa de vidro é revestida com um hidrogel de agarose. Passo 2: A tampa revestida por spin é montada em uma câmara de microscopia de PMMA feita sob medida. Passo 3: Agarose adicional de baixo derretimento é adicionada à porta de entrada da câmara de PMMA em uma placa quente de 35 °C. Passo 4: As monocamadas lipídicas são formadas em torno de gotículas aquosas em uma interface tampão/óleo (esquerda) e na interface hidrogel/óleo de agarose (direita). Passo 5: Gotículas aquosas individuais são pipetadas nos poços da câmara de PMMA para formar uma bicamada lipídica ao entrar em contato com as duas monocamadas lipídicas. Passo 6: A formação das membranas DIB é validada pela microscopia de contraste modulada de Hofmann. Passo 7: Imagens de áreas selecionadas das membranas DIB com canais iônicos inseridos são adquiridas por microscopia TIRF. Verde: 0,75% agarose; amarelo: 2,5% de agarose contendo íons Ca2+ ; magenta: fase lipídica/oleosa; azul escuro: tampão aquoso de gotículas contendo corante e proteína sensíveis ao Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figura 3: Montagem experimental. (A) Representação esquemática de uma membrana DIB em um poço de PMMA. A bicamada repousa sobre um filme ultrafino de agarose a 0,75% para permitir a obtenção de imagens TIRF do fluxo de Ca 2+ através de um canal iônico ao longo do tempo usando um corante de fluorescência sensível ao Ca 2+ (Fluo-8) em trans. (B) O fluxo de Ca2+ é controlado exclusivamente pela pressão osmótica de cis para trans. Isso permite tanto a determinação da posição na membrana quanto do estado aberto-fechado do canal. O canal mostrado aqui é o canal condutor de proteínas TOM-CC da mitocôndria de N. crassa 30. (C) Trajetória de um único canal TOM-CC. Verde: canal móvel; amarelo: canal não móvel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figura 4: Imagem TOM-CC e OmpF em membranas DIB. (A) Membrana DIB fotografada por microscopia de contraste modulada de Hoffmann mostrando a área de contato bicamada entre o hidrogel e a gota. (B) Membrana DIB quebrada como em (A). Seta, borda da câmara de PMMA. (C) Membrana DIB imageada por microscopia TIRF sem canais proteicos. (D) Membrana DIB com TOM-CC reconstituída, imageada por microscopia TIRF. Os quadrados brancos marcam pontos de alta (SH), intermediária (SI) e baixa (SL) intensidade. (E) O ajuste do perfil de intensidade de fluorescência dos três pontos marcados em (A) às funções gaussianas bidimensionais revela a posição dos TOM-CCs individuais e o fluxo de Ca2+ através do canal. (F) Membrana DIB com OmpF reconstituído. (G) Encaixe gaussiano da mancha fluorescente marcada em (F). Em contraste com o complexo proteico de β barris de dois poros TOM-CC, o OmpF de β de três poros revela apenas um estado de permeabilidade. Tamanho do pixel, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figura 5: A atividade do canal correlaciona-se com a mobilidade lateral do TOM-CC. (A) O traçado de amplitude fluorescente (superior) e o trajeto correspondente (inferior) do TOM-CC indicam que a atividade do canal aberto-fechado do TOM-CC correlaciona-se com a mobilidade da membrana lateral do complexo. A trajetória apresenta três estados de permeabilidade. Verde: estado totalmente aberto; amarelo: estado intermediário de permeabilidade; vermelho: estado do canal fechado; estrela vermelha: TOM-CC no estado intermediário oscila em torno de sua posição média em cerca de ±60 nm. As precisões posicionais37 baseadas nos sinais de fluorescência nos estados totalmente aberto e intermediário variam entre 5 nm e 10 nm. (B) Traçado de amplitude fluorescente (superior) e trajetória correspondente (inferior) de OmpF. OmpF revela apenas um nível de intensidade, independentemente de estar em movimento ou preso. Os segmentos de trajetória correspondentes aos períodos de tempo das moléculas aprisionadas são marcados em cinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Concentrações de reagentes</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">Tris-HCl 20 mM pH 8,5, 0,1 % (p/v) n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM), 10% (v/v) glicerol, NaCl 300 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1 mM</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">Tris-HCl 20 mM pH 8,5, DDM 0,1% (p/v), glicerol 10% (v/v), imidazol 1 M e PMSF 1 mM</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (p/v) DDM, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (p/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Desgaseifique e passe por um filtro de 0,22 μm antes de usar.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Soluções tampão para isolamento TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Concentrações de reagentes</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (p/v) de triptona, 1% (p/v) de NaCl e 0,5% (p/v) de extrato de levedura</td>
			<td>1100 mL</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2, e ~750 unidades DNAse e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (p/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS), 2 mM β-mercaptoetanol e 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">SDS 2% (p/v), NaCl 500 mM e Tris-HCl 50 mM pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (p/v) de octil polioxietileno (octil POE), 1 mM EDTA e 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Esterilizar antes de usar.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Soluções tampão para isolamento de OmpF.

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Os canais iônicos não são estáticos nas membranas biológicas. Aqui apresentamos uma abordagem óptica de molécula única para desvendar a ligação entre a difusão da membrana lateral e a função do canal iônico. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos é que a marcação fluorescente de proteínas que possam interferir com seu movimento lateral e função não é necessária.O método pode ser aplicado a qualquer canal de proteína de membrana onde a difusão livre ou restrita é importante para a organização e função. Para começar, transfira 380 microlitros da solução estoque de DPhPC para um frasco de vidro e sobreponha a solução de estoque lipídico com argônio ou gás nitrogênio para evitar a oxidação lipídica. Use o menor fluxo de gás possível para evitar a evaporação do solvente orgânico no qual os lipídios são dissolvidos ou respingos dos sprays de solvente do frasco para injetáveis.Secar a amostra lipídica sob uma corrente de nitrogênio e remover o solvente orgânico restante da amostra lipídica sob vácuo usando uma bomba de vácuo isenta de óleo durante a noite. Dissolva o filme lipídico em uma solução de óleo de silicone hexadecano adicionando volumes iguais de hexadecano e óleo de silicone usando uma pipeta de um mililitro para uma concentração lipídica final de 9,5 miligramas por mililitro. Coloque algumas tampas de vidro em um suporte de deslizamento de aço inoxidável e limpe-as em um copo de vidro por cerca de 10 minutos com acetona em um limpador ultrassônico.Enxágue as lamínulas com água duplamente deionizada e seque-as sob uma corrente de nitrogênio. Além disso, limpe e hidrofilize uma tampa em um limpador de plasma com oxigênio por cinco minutos. Monte uma lamínula tratada com plasma em um revestidor de spin e cubra a lamínula com uma película de agarose de espessura sub-micrômetro adicionando lentamente 140 microlitros de agarose aquecida 0,75% de baixa fusão com uma pipeta de 200 microlitros a 3.000 RPM por 30 segundos.Fixe imediatamente a lamínula revestida por spin com a fina camada do hidrogel de agarose à parte inferior da câmara de PMMA. Certifique-se de que o hidrogel de agarose aponta para cima. Fixe as bordas da tampa no dispositivo microusinado de PMMA com fita adesiva transparente e coloque o dispositivo em uma placa quente aquecida a 35 graus Celsius.Despeje cuidadosamente 200 microlitros de solução de agarose a 2,5% na entrada da câmara sem criar bolhas de ar. Cobrir imediatamente os poços da câmara de PMMA com cerca de 60 microlitros da solução de óleo lipídico para iniciar a formação de monocamada lipídica na interface óleo de agarose para evitar a desidratação da agarose revestida por spin nos poços da câmara de PMMA. Coloque o dispositivo em uma placa quente a 35 graus Celsius por cerca de duas horas.Coloque cerca de 20 microlitros de solução de óleo de silicone hexadecano lipídico em cada um dos vários poços microfabricados em uma câmara de incubação de gotículas. Prepare uma agulha de vidro microcapilar com um diâmetro de abertura da ponta de cerca de 20 micrômetros usando um puxador de micropipeta vertical ou horizontal. Encher a agulha com cerca de cinco microlitros de solução aquosa de injeção contendo 8,8 milimolares de HEPES, sete micromolares de um corante fluorescente, Fluo-8, 400 EDTA micromolares, cloreto de potássio 1,32 molar e complexo de núcleo TOM nanomolar 30 ou, alternativamente, 20 OMPF nanomolares.Monte a agulha com a solução de injeção aquosa em um nanoinjetor piezo-acionado e injete 100 a 200 nanolitros de gotículas aquosas nos poços na câmara de incubação de gotículas preenchida com solução de óleo de silicone hexadecano lipídico usando o nanoinjetor. Permitir a formação de uma monocamada lipídica na interface óleo de gotícula por cerca de duas horas, mantendo as câmaras de incubação de PMMA e gotículas em uma placa quente aquecida a 35 graus Celsius. Transfira manualmente gotículas aquosas individuais dos poços da câmara de incubação de gotículas para os poços da câmara de PMMA usando uma pipeta de microlitro de canal único com uma ponta de polipropileno descartável de 10 microlitros.Deixe as gotículas afundarem nas monocamadas lipídicas nas interfaces hidrogel-óleo para formar uma bicamada lipídica entre as gotículas e o hidrogel de agarose. Monte a câmara de PMMA com as membranas de bicamada ou DIB de interface de gotículas no porta-amostra de um microscópio de luz invertida e avalie a formação da membrana usando uma objetiva de contraste de modulação Hoffman de 10x. Se as membranas DIB se formaram, monte a câmara de PMMA no porta-amostras de um microscópio TIRF equipado com uma fonte de luz convencional para iluminação de epifluorescência, um laser de 488 nanômetros e uma câmera CCD multiplicadora de elétrons retroiluminados para atingir um tamanho de pixel de cerca de 0,16 micrômetros.Focalize a borda de uma membrana DIB com uma objetiva de aumento de 10x sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP. Focalize fino a mesma borda da membrana DIB em alta magnificação com uma objetiva TIRF de óleo apocromático 100x NA 1,49, novamente sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP. Altere a configuração do filtro de GFP para o conjunto de filtros TIRF quad band, ligue o laser de 488 nanômetros e defina a intensidade do laser na lente objetiva.Para visualizar canais de íons únicos, ajuste o ângulo TIRF e o ganho da câmera EM CCD para que os canais de íons abertos na membrana DIB apareçam como pontos fluorescentes de alto contraste em um fundo escuro, e a relação sinal/fundo atinja um máximo. Certifique-se de que os pontos correspondentes ao fluxo de íons cálcio através de canais iônicos únicos permaneçam em foco e tenham uma forma redonda com alta intensidade no centro e diminuindo gradualmente em direção à periferia. Verifique se os pontos fluorescentes estão em foco para garantir que os canais iônicos se reconstituíram nas membranas DIB e estão se movendo lateralmente no plano da membrana.Finalmente, registre uma série de imagens de membrana que permitam o rastreamento adequado da posição e o monitoramento do estado aberto-fechado dos canais iônicos individuais. Para determinar o tipo de mobilidade lateral e o estado de atividade do canal, adquira trajetórias suficientemente longas e bem amostradas. A estrutura Cryo EM de Neurospora crassa TOM-CC é mostrada aqui.Mitocôndrias de uma coloração de N.crassa contendo um TOM 22 com um tag de 6-His foram solubilizadas em DDM e submetidas à cromatografia de afinidade por níquel NTA e cromatografia de troca aniônica. SDS-PAGE da estrutura cristalina isolada de TOM-CC e SDS-PAGE de E.coli OMPF purificada usados para comparação são mostrados aqui. O traço de amplitude fluorescente na trajetória correspondente do TOM-CC indica que a atividade do canal aberto-fechado do TOM-CC correlaciona-se com a mobilidade da membrana lateral do complexo.O traço de amplitude exibe três estados de permeabilidade: estado totalmente aberto correspondente a canais móveis, estado de permeabilidade intermediário e estado de canal fechado correspondente a canais não móveis. O TOM-CC no estado intermediário oscila em torno de sua posição média em cerca de 60 nanômetros mais/menos. O traço de amplitude fluorescente na trajetória correspondente do OMPF é mostrado aqui.O OMPF revela apenas um nível de intensidade em comparação ao TOM-CC, independentemente de estar em movimento ou preso. Os segmentos de trajetória correspondentes aos períodos de tempo das moléculas aprisionadas são marcados em cinza. Uma coisa importante a notar é que este método analisa proteínas de membrana única em um ambiente de membrana intacta.A dinâmica das proteínas de membrana continuará a ser um horizonte para estudos científicos num futuro próximo. Esperamos que nosso método contribua significativamente para este campo.

single-molecule-imaging-lateral-mobility-ion-channel-activity-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Este protocolo é um guia para a implementação de microscopia de reflexão de interferência em um microscópio de fluorescência padrão para imagens sem rótulo, de alto contraste e alta velocidade de microtúbulos usando ensaios de superfícies in vitro.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a rastrear canais iônicos individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia TIRF, sem necessidade de marcação fluorescente que interfere na função proteica. Este método óptico de molécula única revela a relação entre mobilidade lateral e atividade do canal.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF) (Vídeo) | JoVE Journal

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Explorar mais vídeos