Name: Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Scopri l'editing di base efficiente senza PAM utilizzando zSpRY-ABE8e per modellare malattie genetiche umane nel pesce zebra. Questo metodo computazionale consente conversioni precise adenina-guanina con bassa intermutazione.

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Ringraziamo Barbara Garbers, PhD, di Liwen Bianji (Edanz) per aver curato il testo inglese di una bozza di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di ricerca e sviluppo dell'area chiave della provincia del Guangdong (2019B030335001), dal Programma nazionale chiave di ricerca e sviluppo della Cina (2019YFE0106700), dalla National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) e dal Programma del fondo di ricerca del Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).

Questo studio è stato condotto nel rigoroso rispetto delle linee guida del Comitato per la cura e l'uso della South China Normal University.
1. Preparazione di gRNA sinteticamente modificati e mRNA zSpRY-ABE8e
<ol><li>Progettare il gRNA secondo le pubblicazioni precedenti37,38.<ol><li>Selezionare preferenzialmente NRN come sequenza PAM, poiché zSpRY-ABE8e mostra una preferenza maggiore per NRN PAM rispetto a NYN PAM (dove R è A o G e Y è C o T)18. Assicurarsi che il nucleotide adenina target si trovi nella finestra di modifica altamente attiva (dal terzo al nono nucleotide lungo il protospaziatore).</li>
	</ol></li>
	<li>Ordinare EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificato con 2′-O-metil-3′-fosforotioato (MS) ad entrambe le estremità (Figura 1). NOTA: Il gRNA EE deve essere sciolto in acqua priva di RNasi e conservato a -80 °C.</li>
	<li>Linearizzare il plasmide zSpRY-ABE8e18.<ol><li>Linearizzare 6 μg del plasmide con l'enzima XbaI (Table of Materials) in un bagno metallico a 37 °C per 3 ore.</li>
		<li>Purificare il plasmide linearizzato utilizzando il kit di purificazione del DNA (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Trascrivere l'mRNA utilizzando il kit di trascrizione in vitro (Table of Materials).<ol><li>Trascrivere l'mRNA zSpRY-ABE8e con il plasmide linearizzato come modello secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Tutte le operazioni che coinvolgono mRNA e gRNA richiedono l'uso di forniture di laboratorio prive di RNasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare il kit di purificazione dell'RNA (Table of Materials) per purificare l'mRNA secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Prima di eluire, l'etanolo deve essere essiccato per evitare citotossicità e l'mRNA deve essere conservato a -80 °C se non utilizzato immediatamente.</li>
</ol>2. Preparazione dei capillari di vetro a microiniezione
<ol><li>Impostare il sistema di estrazione a micropipette e preriscaldare per almeno 30 minuti.</li>
	<li>Eseguire un test di rampa per determinare il valore termico necessario per fondere i capillari di vetro borosilicato (con diametro esterno di 1 mm e diametro interno di 0,58 mm) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Selezionare un programma e fare clic sul numero sulla tastiera per inserire i valori dei parametri. Impostare i seguenti parametri per tirare i capillari di vetro: calore = valore del test di rampa, trazione = 50, velocità = 100, tempo = 50 e pressione = 30.</li>
	<li>Installare il tubo capillare, assicurandosi che sia nella scanalatura. Premere PULL START/STOP per eseguire il programma.</li>
	<li>Preservare i capillari tirati inserendoli in schiuma che contiene spazi vuoti, mantenendo l'ago sospeso.</li>
</ol>3. Microiniezione della miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA EE in embrioni di zebrafish
<ol><li>Allestire vasche di allevamento la notte prima dell'iniezione. Inserire un divisorio, posizionare due femmine e un maschio di zebrafish ceppo AB (3-18 mesi) in ogni vasca e coprire con il coperchio. Fare riferimento alle pubblicazioni precedenti per le distinzioni di genere39. NOTA: Per ottenere più embrioni, selezionare pesci che non si riproducono da almeno 1 settimana.</li>
	<li>La mattina successiva prima dell'iniezione, scongelare l'mRNA zSpRY-ABE8e e il gRNA EE sul ghiaccio. Mescolare l'mRNA e il gRNA a concentrazioni finali di 400 ng / μL e 200 ng / μL, rispettivamente.<ol><li>Eseguire l'intera procedura sul ghiaccio utilizzando punte e tubi privi di RNasi e maneggiare con i guanti.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurare il microiniettore pneumatico. Chiudere la valvola di pressione parziale della pompa dell'aria e aprire prima la valvola principale, svitare la bombola del gas e regolare la pressione della valvola di pressione parziale a 0,2 MPa / 29 psi.<ol><li>Accendere il microiniettore pneumatico, impostare la modalità su TIMER e regolare il valore di pressione del parametro iniziale su 20,0 psi e il valore TIMER su 0,040 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare una pinza fine per rompere con cura gli aghi dei capillari di vetro tirati sotto uno stereomicroscopio, assicurandosi che gli aghi siano tagliati ad angolo per facilitare il piercing del corion e dell'uovo. NOTA: Il punto di rottura dell'ago deve essere nel posto giusto ed essere abbastanza forte da perforare l'uovo ma abbastanza sottile da ridurre al minimo i danni all'uovo.</li>
	<li>Aggiungere la miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sulla punta di un capillare di vetro utilizzando una punta di pipetta microloader, evitando bolle nel capillare. Collegare l'ago al micromanipolatore e configurare la pressione e il valore TIMER dell'iniettore per garantire che vengano prodotti 2 nL di miscela per iniezione utilizzando un microcap.</li>
	<li>Scollegare i divisori delle vasche di riproduzione e consentire al pesce di riprodursi per 10-15 minuti. Raccogliere le uova usando un colino ed esaminare lo stadio cellulare e la qualità delle uova sotto uno stereomicroscopio. Selezionare le uova nello stato a cella singola per l'iniezione per migliorare l'efficienza di editing.</li>
	<li>Foderare le uova su una piastra di iniezione di agarosio all'1,5% e iniettare 2 nL della miscela nella cellula, non nel tuorlo, degli embrioni al microscopio per migliorare l'efficienza di editing. Conservare almeno 15 uova come gruppo di controllo.</li>
	<li>Utilizzare 1x tampone E3 per raccogliere le uova in piastre di Petri e metterle in un'incubatrice a 28 °C. Rimuovere le uova morte e cambiare il tampone di coltura ogni 12 ore fino a 48 ore dopo la fecondazione (hpf).</li>
</ol>4. Analisi dell'efficienza dell'editing di base con EditR
<ol><li>A 48 hpf, raccogliere tre pool di sei embrioni iniettati selezionati casualmente e sei embrioni di controllo selezionati casualmente in provette PCR rispettivamente. Utilizzare una pipetta per aspirare il buffer E3 residuo.</li>
	<li>Aggiungere 40 μL di 50 mM NaOH nelle provette PCR. Mettere i tubi in un bagno di metallo a 95 °C per 20 minuti, quindi vortice per 15 s.</li>
	<li>Aggiungere 4 μL di 1 M Tris· HCl (pH 8.0) in ogni tubo per neutralizzare il NaOH. Centrifugare brevemente a 2.000 x g per 10 s a temperatura ambiente per rimuovere le goccioline dalla parete del tubo. Raccogliere il surnatante in nuove provette per PCR e conservarle a -20 °C.</li>
	<li>Progettare primer appropriati a monte e a valle dei siti bersaglio del gRNA. Utilizzare 1 μL del surnatante di cui sopra come modello per le reazioni PCR di volume 50 μL. I primer utilizzati per la PCR in questo studio sono elencati nella Tabella supplementare 1.</li>
	<li>Eseguire un'elettroforesi su gel di agarosio del DNA per garantire bande corrette e specifiche, seguita dal sequenziamento Sanger come descritto in precedenza40.</li>
	<li>Analizzare i dati di sequenziamento Sanger con il programma EditR (1.0.10)41.<ol><li>Carica il file di sequenziazione (formato ab1) nella casella "Carica file .ab1".</li>
		<li>Inserisci la sequenza di gRNA di 20 bp con orientamento 5′-3′ nella casella "Enter gRNA sequence".</li>
		<li>Aprire il file di sequenziamento (formato ab1) e confermare le posizioni di base in cui inizia e finisce la sequenza di gRNA a 20 bp. Inserisci la posizione di base corrispondente nelle caselle "5′ start" e "3′ end".</li>
		<li>Fare clic su Modifica prevista per ottenere l'efficienza di modifica di base. Controllare la qualità dei dati di sequenziamento vicino alla sequenza bersaglio del gRNA per evitare picchi disordinati o indel. NOTA: In generale, i picchi disordinati possono essere efficacemente rimossi regolando la temperatura di ricottura della PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
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<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
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<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive la costruzione di un modello di malattia del pesce zebra utilizzando l'editor di base zSpRY-ABE8e. Rispetto al tradizionale percorso HDR per la sostituzione delle basi, questo protocollo può ottenere un editing di base più efficiente e ridurre il verificarsi di indel. Allo stesso tempo, questo protocollo prevede l'implementazione della strategia di knockout del gene i-Silence recentemente proposta nel pesce zebra. Nel suo insieme, zSpRY-ABE8e migliorerà l'applicazione di modelli di zebrafish ne...

Le varianti a singolo nucleotide (SNV) che causano mutazioni missenso o nonsenso sono la fonte più comune di mutazioni nel genoma umano1. Per determinare se un particolare SNV è patogeno e per far luce sulla sua patogenesi, sono necessari modelli animali precisi2. I pesci zebra sono buoni modelli di malattia umana, che presentano un alto grado di omologia fisiologica e genetica con gli esseri umani, un breve ciclo di sviluppo e una forte capacità riproduttiva, che è vantaggiosa per la ricerca sulle caratteristiche e sui meccanismi patogeni, nonché per lo screening dei farmaci3.
Il sistema CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 è stato ampiamente applicato nell'editing del genoma di varie specie, tra cui il pesce zebra4. Con la guida del gRNA, il sistema CRISPR / Cas9 può generare rotture a doppio filamento del DNA (DSB) nel sito bersaglio, che consente quindi la sostituzione a base singola attraverso la ricombinazione del sito bersaglio con modelli di DNA del donatore tramite il percorso di riparazione diretta dall'omologia (HDR). Tuttavia, l'efficienza di questo metodo di sostituzione della base è piuttosto bassa in quanto il processo di riparazione del DNA cellulare viene effettuato principalmente dalla via di giunzione finale non omologa (NHEJ), che di solito è accompagnata da mutazioni di inserzione e delezione (indel)5. Fortunatamente, la tecnologia di editing a base singola basata su CRISPR / Cas9 allevia significativamente questo problema utilizzando editor di base, che consentono un editing a base singola più efficiente senza indurre DSB. Due classi principali di editor di base, gli editor di base adenina (ABE) e gli editor di base di citosina (CBE), sono stati sviluppati per implementare l'editing di sostituzione di base per A· Da T a G· C e C·G a T· A, rispettivamente 6,7,8,9,10,11. Questi quattro tipi di sostituzioni di base coprono il 30% delle varianti patogene umane12. Entrambe le classi di editor di base, tra cui PmCDA1, sistema BE, CBE4max, ABE7.10 e ABE8e, sono state segnalate per funzionare nel pesce zebra, con BE4max e ABE8e in particolare segnalati per raggiungere un'elevata attività di editing 13,14,15,16,17,18,19.
Le proteine Cas9 di diverse specie, tra cui Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e S. canis, sono state implementate nell'editing genetico del pesce zebra, con lo Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) utilizzato più ampiamente20,21,22,23. Tuttavia, SpCas9 può riconoscere solo siti bersaglio con un motivo adiacente protospacer NGG (PAM), che limita il suo intervallo modificabile e può comportare che non venga trovata alcuna sequenza adatta vicino al sito patogeno di interesse24. Per ampliare la gamma target, una varietà di varianti di SpCas9 sono state progettate per riconoscere diversi PAM attraverso l'evoluzione diretta e la progettazione guidata dalla struttura. Tuttavia, poche varianti sono efficaci negli animali, specialmente nel pesce zebra, il che limita l'applicazione del pesce zebra nella ricerca sulle malattie correlate al SNV25,26,27,28. Recentemente, due varianti di SpCas9, SpG e SpRY, con restrizioni PAM meno rigorose (NGN per SpG e NNN per SpRY con una preferenza più elevata per NRN rispetto a NYN) sono state segnalate per mostrare un'elevata attività di editing in cellule e piante umane 29,30,31,32. Successivamente, SpG e SpRY, così come un certo numero dei loro editor di base mediati, come CBE mediati da SpRY e ABE mediati da SpRY, sono stati segnalati per lavorare nel pesce zebra, che migliorerà l'applicazione di modelli di zebrafish nello studio meccanicistico e nello screening farmacologico delle malattie correlate a SNV 18,33,34,35. Inoltre, i-Silence è stato proposto come una strategia di knockout genico efficace e accurata attraverso la conversione del codone iniziale mediata da ABE da ATG a GTG o ACG36. La combinazione della strategia i-Silence e dell'editor di base mediato da SpRY zSpRY-ABE8e fornisce un nuovo metodo per la modellazione della malattia18. Questo protocollo dimostra come eseguire l'editing genetico utilizzando zSpRY-ABE8e nel pesce zebra per costruire un modello tsr2 (M1V) utilizzando la strategia i-Silence. L'efficienza di editing e i fenotipi che appaiono nei modelli di zebrafish sono stati valutati e analizzati.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1,5% Agarosio utilizzato per fare una piastra di iniezione</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari&nbsp;</td>Kit di clonazione <td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>per clone di infusione.</td></tr><tr><td>Servizio di ottimizzazione dei codoni</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Lunghezza:32 mm, capacità:0,5 &mu; L</td></tr><tr><td>EasyEdit servizio gRNA</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>Utilizzato per rompere meedle</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller&nbsp;</td><td>Stutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Utilizzato per estrarre i capillari di vetro</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>Utilizzato per la reazione PCR</td></tr><tr><td>Scatola climatica artificiale intelligente</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Utilizzato per la coltura di embrioni di zebrafish</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Utilizzato per fissare il zebrafish durante la fotografia di</td></tr><tr><td>puntali per pipette Microloader& nbsp;</td><td>Kit Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di mutagenesi rapida Mut Express II V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Kit per mutagenesi sito-specifica</td></tr><tr><td>Microiniettore pneumatico</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>Kit FFPE RNeasy&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Kit per la purificazione</td></tr><tr><td>dell'RNA Sanger Servizio di sequenziamento</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, granulare</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH utilizzato per l'estrazione del genoma</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>Utilizzato per la fotografia del fenotipo</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio zoom serie SZ</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>Kit per trascrizione in vitro&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Mini plasmidi TIANprep</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Kit per kit di estrazione plasmidi</td></tr><tr><td>Mini kit di purificazione TIANquick TIANGEN</td><td></td><td>DP203-02</td><td>Kit per purificazione per plasmide linearizzato</td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Utilizzato per anestetizzare il pesce zebra</td></tr><tr><td>Tris (idrossimetil) aminometano</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Componente di Tris&middot; HCl utilizzato per l'estrazione del genoma</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Endonucleasi di restrizione utilizzata per la linearizzazione dei plasmidi</td></tr></tbody></table>

editing di base efficiente senza pam per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

La tecnologia CRISPR / Cas9 ha aumentato il valore del pesce zebra per modellare le malattie genetiche umane, studiare la patogenesi delle malattie e lo screening dei farmaci, ma le limitazioni del motivo adiacente protospaziatore (PAM) sono un ostacolo importante alla creazione di modelli animali accurati di malattie genetiche umane causate da varianti a singolo nucleotide (SNV). Fino ad ora, alcune varianti di SpCas9 con ampia compatibilità PAM hanno mostrato efficienza nel pesce zebra. L'applicazione dell'editor di base adenina (ABE) ottimizzato mediato da SpRY, zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificato nel pesce zebra ha consentito un'efficiente conversione della base adenina-guanina senza restrizioni PAM. Qui è descritto un protocollo per l'editing efficiente della base adenina senza limitazioni PAM nel pesce zebra usando zSpRY-ABE8e. Iniettando una miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificato in embrioni di zebrafish, è stato costruito un modello di malattia zebrafish con una mutazione precisa che simulava un sito patogeno del fattore di maturazione del ribosoma TSR2 (tsr2). Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per la creazione di modelli di malattia accurati per lo studio dei meccanismi e dei trattamenti della malattia.

È stato riportato che la mutazione di TSR2 causa anemia di Diamond Blackfan (DBA)42. Qui, è stato costruito un modello DBA zebrafish con una mutazione tsr2 (M1V) utilizzando la strategia i-Silence. L'adenina del codone iniziale del pesce zebra tsr2 è stata convertita con successo in guanina utilizzando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
L'analisi EditR dei risultati del sequenziamento Sanger ha mostrato che c'era una sovrapp...

Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.

Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di costruire una serie di modelli di zebrafish precedentemente non disponibili di varianti a singolo nucleotide rilevanti per la malattia. Le limitazioni della PAM sono il principale ostacolo alla creazione di modelli animali accurati e zSpRY-ABE8e consente un'efficiente conversione da adenina a guanina base con bassa intermutazione e restrizione PAN rilassata. Questo strumento può essere utilizzato per costruire modelli accurati di zebrafish per lo studio dei meccanismi patogenetici della malattia correlati ai marini a singolo nucleotide, nonché lo screening farmacologico per questa malattia.Per iniziare, impostare il sistema di estrazione a micropipette e preriscaldare per almeno 30 minuti. Per tirare i capillari di vetro, selezionare un programma, impostare il valore del test di rampa come calore, 50 come trazione, la velocità a 100, il tempo come 50 e la pressione come 30. Quindi, installare il tubo capillare assicurandosi che sia nella scanalatura.Premere pull start/stop" per eseguire il programma. Per preservare i capillari tirati, inserirli in schiuma contenente spazi vuoti mantenendo l'ago sospeso. Per la sperimentazione, utilizzare l'mRNA zSpRY-ABE8e descritto nel manoscritto e modificare facilmente l'sgRNA modificato con 2'O-metil fosforotioato ad entrambe le estremità.Per il disegno del gRNA, selezionare preferenzialmente NRN come sequenza PAM, poiché zSpRY-ABE8e mostra una preferenza maggiore per NRN PAM rispetto a NYN PAM. Inserisci il nucleotide adenina target nella finestra di modifica altamente attiva dal terzo al nono nucleotide lungo il protospaziatore. Allestire vasche di allevamento la notte prima dell'iniezione.Inserire un divisore, posizionando due femmine e un maschio zebrafish in ogni vasca. Posizionare un coperchio su ciascun serbatoio. La mattina seguente, utilizzando punte, tubi e guanti privi di RNasi, mescolare l'mRNA scongelato e l'EEgRNA sul ghiaccio a una concentrazione finale di 400 e 200 nanogrammi per microlitro, rispettivamente.Per configurare il microiniettore pneumatico, in primo luogo, chiudere la valvola di pressione parziale della pompa dell'aria. Quindi, aprire la valvola principale, svitare la bombola del gas e regolare la pressione della valvola di pressione parziale a 0,2 Megapascal. Ora, accendere il microiniettore e impostare la modalità su timer.Regolare la valvola di pressione dei parametri su 20 libbre per pollice quadrato e il valore del timer su 0,040 secondi. Usando una pinza sottile, rompere angolarmente gli aghi dei capillari di vetro tirati sotto un microscopio stereo. Utilizzando la punta di una pipetta microloader, aggiungere la miscela mRNA/gRNA alla punta di un capillare di vetro e collegare l'ago al micromanipolatore.Configurare il valore della pressione e del timer per produrre due nanolitri di miscela per iniezione utilizzando un microcap. Dopo aver allevato il pesce per 10-15 minuti, raccogliere le uova in un colino. Esaminare lo stadio cellulare e la qualità dell'uovo al microscopio stereo.Selezionare uova unicellulari per l'iniezione per migliorare l'efficienza di editing. Allineare le uova su una piastra di iniezione di agarosio all'1,5% e iniettare due nanolitri della miscela di RNA nella cellula degli embrioni usando un microscopio. Raccogliere le uova in piastre di Petri con E3 Buffer e incubarle a 28 gradi Celsius.Rimuovere le uova morte e cambiare il tampone di coltura ogni 12 ore per 48 ore dopo la fecondazione. Dopo 48 ore dalla fecondazione, raccogliere tre pool di sei embrioni iniettati selezionati casualmente in una provetta PCR. Una volta raccolti sei embrioni di controllo selezionati casualmente, utilizzare una pipetta per aspirare il tampone E3 residuo.Aggiungere 40 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare agli embrioni. Posizionare i tubi in un bagno di metallo a 95 gradi Celsius per 20 minuti, quindi vortice per 15 secondi. Aggiungere quattro microlitri di un molare Tris cloridrato a pH otto in ciascun tubo.Centrifugare i tubi a 2000g per 10 secondi a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per PCR. Rimuovere un microlitro di surnatante dal tubo PCR e utilizzarlo per il sequenziamento Sanger.Quindi conservare il surnatante rimanente a 20 gradi Celsius. Per analizzare i dati di sequenziamento Sanger, iniziare caricando il file di sequenziamento nella casella carica file ab1. Inserire la sequenza di gRNA di 20 coppie di basi nell'orientamento da 5' a 3' nella casella "sequenza" di invio di gRNA.Inserite la posizione di base corrispondente nelle caselle 5'start e 3'end. Ottieni l'efficienza di editing di base facendo clic su "editing predittivo" e controllando la qualità dei dati di sequenziamento. Un modello di zebrafish con anemia blackfan di diamante è stato costruito convertendo l'adenina del codone iniziale di Tsr2 in guanina.L'analisi EditR dei dati di sequenza ha dimostrato una sovrapposizione AG alla base adenina del codone di partenza Tsr2. Il fenotipo dei due embrioni di Tsr2 di un giorno mostrava occhi più piccoli rispetto agli embrioni di controllo. Un pericardio gonfio è stato osservato anche negli embrioni mutanti.Al fine di ottenere un editing di base efficiente, si prega di seguire rigorosamente il principio di progettazione delle linee guida precedentemente menzionato, che è un prerequisito per il successo dell'esperimento. Modelli accurati sono essenziali per lo studio delle malattie correlate alla variante a singolo nucleotide. Lo sviluppo di SprY-ABE8e fornisce uno strumento efficace per una modellazione accurata, che aiuta a promuovere la ricerca di meccanismi e trattamenti della malattia.

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