Name: Monitoraggio della pexofagia mediata da Stub1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri la pexofagia mediata da Stub1 nelle cellule SHSY5Y umane e NIH 3T3 murine. Questo metodo di imaging in tempo reale rivela come le perossisomi stressate da ROS vengono rimosse tramite degradazione ubiquitin-dipendente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di ricerca MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consiglio nazionale della scienza e della tecnologia di Taiwan.

1. Preparazione di cellule che esprimono proteine diKillerRed o automarcanti (SLP) nel lume dei perossisomi
<ol><li>Seminare le cellule desiderate su piatti di coltura cellulare con fondo di vetro. Per l'esperimento qui, seminare 2 x 105 cellule umane SHSY5Y in 840 μL di terreno di coltura (DMEM / F-12 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina / streptomicina) o 6 x 104 cellule NIH3T3 di topo in 840 μL di terreno di coltura (DMEM integrato con siero bovino al 10% e penicillina / streptomicina) su un piatto di coltura da 35 mm con un micropozzetto di vetro di 20 mm di diametro. NOTA: Il numero di celle seminate deve essere regolato proporzionalmente in base all'area del micropozzetto di vetro quando si utilizzano piatti con fondo di vetro di altre specifiche.</li>
	<li>Far crescere le cellule sotto il 5% di CO2/37 °C per 24 ore.</li>
	<li>Trasfettare le cellule con i plasmidi desiderati usando un reagente di trasfezione.<ol><li>Utilizzare PMP34-TagBFP per etichettare i perossisomi nelle cellule vive. Utilizzare diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL con targeting dei perossisomi (+ ligandi SLP marcati con colorante) per la generazione di ROS nel lume dei perossisomi (attraverso la produzione di ROS attivati dalla luce). In questo protocollo, utilizziamo la proteina auto-etichettante HaloTag-VKSKL21. Per monitorare la traslocazione di Stub1/Hsp70, l'accumulo di proteine ubiquitinate e la formazione di autofagosomi sui perossisomi stressati da ROS, trasfettare rispettivamente EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub o EGFP-LC3B. Per controllare la generazione di ROS nel lume perossisomiale, co-transfettare diKillerRed-VKSKL con la sonda redox fluorescente localizzata dai perossisomi roGFP2-VKSKL22.</li>
		<li>Per la trasfezione cellulare SHSY5Y, diluire i plasmidi in 55 μL di DMEM/F-12 senza siero e diluire 1 μL di reagente di trasfezione in 55 μL di DMEM/F12 privo di siero. Combinare il DNA diluito con il reagente diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere il complesso al micropozzetto da 20 mm precedentemente placcato con 100 μL di terreno di coltura per SHSY5Y senza antibiotici (DMEM/F-12 con siero bovino fetale al 10%). Agitare delicatamente il piatto avanti e indietro.</li>
		<li>Per la trasfezione cellulare NIH3T3, sostituire il mezzo sierico ridotto per il DMEM/F-12 privo di siero per diluire i plasmidi e il reagente di trasfezione. Sostituire il terreno di coltura galvanico con SHSY5Y con terreno di coltura per cellule NIH3T3 senza antibiotici (DMEM con siero bovino al 10%).</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo 2 ore di trasfezione, rimuovere il mezzo contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco. Incubare le cellule NIH3T3 o SHSY5Y a 37°C e 5% di CO2 per 24 ore. NOTA: Altre linee cellulari possono anche essere utilizzate per studiare la esofagia mediata da Stub1 (ad esempio, cellule HeLa).</li>
</ol>2. Colorazione dei perossisomi con ligandi SLP marcati con colorante (per la produzione di ROS attivati dalla luce)
<ol><li>A 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 100 μL di ligando HaloTag TMR da 200 nM o da 200 nM di legante HaloTag Janelia Fluor 646 sul micropozzetto di vetro da 20 mm. NOTA: I ligandi SLP marcati con colorante devono essere diluiti con il rispettivo terreno di coltura per ciascuna linea cellulare. La scelta di ligandi marcati con Janelia Fluor 646 libererà i canali blu, verde e rosso per l'imaging a fluorescenza a valle.</li>
	<li>Trasferire il piatto in un incubatore a 37°C, 5% CO2 . Macchia per 1 h. Dopo 1 ora, rimuovere accuratamente il terreno di colorazione e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco.</li>
</ol>3. ROS-stressing dei perossisomi su un microscopio confocale a scansione laser
<ol><li>Posizionare un piatto con fondo di vetro contenente le cellule desiderate su un microscopio confocale a scansione laser dotato di un'incubatrice da palcoscenico.</li>
	<li>Fare clic su Finestra strumento, scegliere Oculare e fare clic sul pulsante DIA (Figura 2A) per accendere la luce trasmessa. Visualizza il piatto attraverso l'oculare del microscopio e metti a fuoco le cellule ruotando la manopola di messa a fuoco.</li>
	<li>Scegliere LSM e fare clic sul pulsante Selezione colorante e rilevatore (Figura 2B). Fare doppio clic sui coloranti desiderati nella finestra pop-up per selezionare le impostazioni laser e di filtro appropriate per l'imaging delle celle (Figura 2C). Fare clic su Livex4 nel pannello Live per avviare la scansione laser veloce e avviare lo screening dei segnali di fluorescenza delle cellule (Figura 2D).</li>
	<li>Spostare lo stage utilizzando il controller del joystick e individuare le cellule medie che esprimono diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL per applicare lo stress ROS (sui perossisomi). Acquisire un'immagine della cella desiderata.</li>
	<li>Fate clic su Finestra strumento (Tool Window) e scegliete Stimolazione LSM (Figura 2E). Fare clic sul pulsante ellisse e, nella finestra dell'immagine live, utilizzare il mouse per disegnare un ROI circolare di 15 μm di diametro (Figura 2F) contenente i perossisomi desiderati acquisiti nel passaggio 3.4 a cui verrà applicata la sollecitazione ROS (vedere la Figura 3 per un esempio).</li>
	<li>Per applicare lo stress ROS, utilizzare 561 nm per le cellule con il ligando SLP marcato con diKillerRed-PTS1 o TMR e utilizzare 640 nm per le cellule colorate con il ligando SLP marcato con Janelia Fluor 646.</li>
	<li>Selezionare la lunghezza d'onda del laser per applicare la sollecitazione ROS. Immettere la percentuale laser desiderata e la durata (Figura 2G).</li>
	<li>Fare clic su Acquisisci e fare clic sul pulsante Stimolazione (Figura 2H) per avviare la scansione con luce a 561/640 nm attraverso i ROI per 30 s ciascuno. Ciò corrisponde a un'impostazione di potenza laser ~ 5% sia per 561 nm che per 640 nm sul microscopio confocale utilizzato qui. Questa operazione porterà alla produzione di ROS nei perossisomi. NOTA: è possibile selezionare ROI di diverse dimensioni. Si dovrebbe regolare proporzionalmente il tempo di illuminazione per ogni ROI in base alla sua area.</li>
	<li>Dopo 30 secondi di illuminazione laser, i perossisomi all'interno dei ROI avranno perso i loro segnali diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Questa perdita di segnale consente di distinguere i perossisomi illuminati da quelli non illuminati (danneggiati vs. sani) all'interno di una cellula.</li>
</ol>4. Monitoraggio della pexofagia nelle cellule vive mediante imaging time-lapse
<ol><li>Seguire la traslocazione di Stub1, Hsp70, Ub, p62 o LC3B con tag EGFP sui perossisomi illuminati/ROS-stressati mediante imaging time-lapse utilizzando intervalli di 10 minuti tra i fotogrammi (per esempi, vedere Figure 3-7). NOTA: i segnali EGFP-Stub1 o EGFP-Hsp70 iniziano ad apparire 10-20 minuti dopo l'illuminazione e rimangono su tutti i perossisomi danneggiati fino a ~ 40 minuti dopo l'illuminazione. I segnali EGFP-Ub appaiono 30 minuti dopo l'illuminazione e durano per 2-3 ore. La traslocazione EGFP-p62 appare 60 minuti dopo l'illuminazione e i segnali EGFP-LC3B diventano visibili ~ 3 ore dopo l'illuminazione.</li>
	<li>Quantificare i segnali EGFP sui perossisomi danneggiati (da Stub1, Ub, p62 o LC3B) utilizzando ImageJ. Eseguire la procedura seguente per utilizzare ImageJ per quantificare un'immagine a tre canali (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).<ol><li>Aprire l'immagine e applicare le selezioni Ellittiche o Selezioni a mano libera per racchiudere la regione contenente tutti i perossisomi illuminati (segnale PMP34-TagBFP positivo e segnale del ligando HaloTag sbiancato; Figura 8A).</li>
		<li>Fare clic su Duplica per selezionare il canale PMP34-TagBFP (Figura 8A). Impostare una soglia utilizzando il menu a discesa Immagine > Regola soglia > per contrassegnare i perossisomi (Figura 8B).</li>
		<li>Selezionare Analizza > Analizza particelle per determinare le regioni esatte dei perossisomi illuminati. ImageJ registra queste aree di interesse (ROI) nel gestore del ROI (Figura 8C).</li>
		<li>Fare clic su Duplica per scegliere il canale EGFP per analizzare il segnale di fluorescenza da Ub, p62 o LC3B coniugati EGFP (Figura 8D). Selezionare tutti i ROI in ROI Manager (Figura 8E).</li>
		<li>Applicare Measure nel ROI Manager per misurare i segnali EGFP sui perossisomi (Figura 8E). Trova il valore dell'area e della densità integrata (la somma di tutte le intensità di pixel) per ogni ROI nella tabella Risultati (Figura 8E).</li>
		<li>Per ottenere le intensità medie di fluorescenza dell'EGFP in diversi punti temporali dopo l'illuminazione, dividere l'intensità EGFP integrata per l'area totale dei perossisomi illuminati (aree negative del segnale PMP34-TagBFP e del ligando HaloTag). Per ottenere il segnale accumulato sui perossisomi, sottrarre l'intensità media in un punto temporale per l'intensità media al tempo = 0, quindi normalizzare l'intensità media al tempo = 0.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in ogni cellula) su un piatto di coltura
<ol><li>Eseguire la fase 1 (preparazione di cellule che esprimono diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] o SLP [SLP-VKSKL]) e la fase 2 (colorazione dei perossisomi con il ligando SLP [per la produzione di ROS attivati dalla luce]).</li>
	<li>Dopo 1 ora di colorazione del ligando marcato TMR, rimuovere il mezzo di colorazione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura contenente 30 mM 3-AT (3-ammino-1,2,4-triazolo; un inibitore della catalasi). NOTA: La catalasi è uno scavenger ROS espresso nel lume del perossisoma, quindi il trattamento 3-AT aiuta ad aumentare il danno ossidativo indotto dalla luce sui perossisomi.</li>
	<li>Posizionare il piatto di coltura sopra un LED (555-570 nm). Illuminare tutte le celle con una densità di potenza di 1,8 W/cm2 per 9 ore in un'incubatrice. NOTA: Per eseguire questo passaggio all'esterno di un'incubatrice, posizionare il piatto di coltura su una piastra riscaldante a 37 °C. Aggiungere 20 mM HEPES al mezzo contenente 3-AT e coprire il piatto di coltura con una pellicola trasparente per ridurre al minimo lo scambio di gas. HEPES è un agente tampone che mantiene il pH fisiologico nella coltura cellulare al di fuori di un incubatore di CO2 durante l'illuminazione a LED.</li>
	<li>Convalidare il successo del danno indotto da LED mediante l'imaging dei segnali EGFP-Ub, EGFP-p62 o EGFP-LC3B sui perossisomi. Utilizzando la condizione di illuminazione descritta sopra, l'82% delle cellule SHSY5Y che esprimono stabilmente HaloTag-VKSKL ha mostrato una pesofagia mediata da Stub1.</li>
	<li>Raccogliere le cellule per l'analisi biochimica a valle.</li>
</ol>

<ol><li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).</li>
<li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+%CE%B2-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li>
<li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li>
<li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransen%2C+M+%22Peroxisomes+and+their+Key+Role+in+Cellular+Signaling+and+Metabolism%22">Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism</a>. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).</li>
<li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li>
<li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li>
<li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+is+responsible+for+65%25+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li>
<li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+in+yeast+and+mammals%3A+An+update+on+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li>
<li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li>
<li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+The+selective+degradation+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).</li>
<li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+A+model+for+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).</li>
<li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li>
<li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li>
<li>Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsc70%2FStub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428(2013).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo spiega in dettaglio come innescare la pesofagia mediata da Stub1 all'interno delle colture cellulari elevando i livelli di ROS perossisomale con la luce. Poiché il protocollo si basa sulla generazione di ROS assistita da coloranti, è necessario garantire un'espressione sufficiente di diKillerRed-VKSKL o colorazione del ligando SLP marcato con colorante all'interno delle cellule di interesse. Dato che diversi tipi di cellule o cellule di diverso background genetico possono ospitare perossisomi con propri...

I perossisomi sono organelli legati a membrana singola presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche. I perossisomi sono un compartimento metabolico essenziale per effettuare la beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga, il catabolismo delle purine e la sintesi dei fosfolipidi eterici e degli acidi biliari1. L'acetil-CoA derivata dai perossisomi controlla l'omeostasi lipidica regolando la segnalazione centrale nel metabolismo2. Pertanto, non sorprende che le funzioni perossisomiali compromesse siano implicite in varie malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi, invecchiamento, tumori, obesità e diabete 3,4,5. Un processo essenziale nel mantenimento del funzionamento perossisomale è la pesofagia. La pexofagia è un processo catabolico per il turnover selettivo dei perossisomi da parte dell'autofagia. Le cellule usano la pexofagia per aiutare a controllare la quantità e la qualità dei perossisomi, garantendo così una corretta funzione perossisomiale. Uno studio recente ha dimostrato che la perdita di perossisomi causata da mutazioni nei fattori di biogenesi perossisomale PEX1 1 e 6 deriva dalla pexofagia 6 non controllata. In particolare, il 65% di tutti i pazienti con disturbo della biogenesi dei perossisomi (PBD) presenta carenze nel complesso perossisomale AAA ATPasi, composto da PEX1, PEX6 e PEX26 nelle cellule di mammifero7.
Un certo numero di metodi possono essere utilizzati per iniziare e studiare la pesofagia. Nel lievito, la pexofagia viene attivata quando i nutrienti forniti passano da fonti di carbonio dipendenti dai perossisomi a fonti di carbonio indipendenti dai perossisomi (per abbassare il numero di perossisomi cellulari)8. Ad esempio, il trasferimento di cellule di Pichia pastoris coltivate a metanolo dal mezzo di metanolo al mezzo di glucosio e al mezzo di etanolo induce micropexofagia e macropexofagia, rispettivamente 8,9,10. La micropexofagia sequestra i perossisomi raggruppati per la degradazione rimodellando il vacuolo per formare membrane di sequestro vacuolare simili a coppe e una struttura simile a un coperchio chiamata apparato di membrana micropexofagico-specifico (MIPA). Nella macropexofagia, i singoli perossisomi sono inghiottiti da strutture a doppia membrana note come pexofagosomi, seguite dalla fusione con il vacuolo per la degradazione 8,9,10. La fosforilazione dei recettori della pesofagia, come Atg36p in Saccharomyces cerevisiae e Atg30p in Pichia pastoris, è fondamentale per i recettori per reclutare il meccanismo di autofagia centrale e per facilitare il targeting perossisomale agli autofagosomi 8,11.
Nelle cellule di mammifero, la pesofagia può essere indotta dall'ubiquitinazione. La marcatura delle proteine di membrana perossisomale PMP34 o PEX3 con ubiquitina sul lato citosolico induce la pesofagia12. La sovraespressione di PEX3 induce l'ubiquitinazione dei perossisomi e l'eliminazione dei perossisomi da parte dei lisosomi13. Inoltre, la fusione di PEX5 con un EGFP C-terminale compromette l'esportazione di PEX5 monoubiquitinata e provoca la pesofagia14. D'altra parte, la pexofagia può anche essere innescata dal trattamento con H 2 O2. I perossisomi producono specie reattive dell'ossigeno (ROS); nello specifico, l'enzima perossisomale Acox1, che catalizza la fase iniziale della beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga (> 22 carbonio), produce non solo acetil-CoA ma anche ROS perossisomiali. In risposta ai livelli elevati di ROS sotto il trattamento conH 2 O2, le cellule di mammifero attivano la pexofagia per ridurre la produzione di ROS e alleviare lo stress. È stato riportato che il trattamentocon H 2 O2 guida il reclutamento di atassia-telangiectasia mutata (ATM) in perossisomi. ATM quindi fosforila PEX5 per promuovere il turnover perossisomale mediante la pesofagia15.
Poiché i perossisomi sono centri di generazione di ROS, sono anche soggetti a danni da ROS. Le lesioni perossisomiali indotte da ROS costringono le cellule ad attivare la pexofagia per avviare le vie di controllo della qualità dei perossisomi (rimozione del perossisoma danneggiato mediante autofagia). Qui, delineiamo un approccio per l'innesco on-demand di lesioni perossisomiali indotte da ROS. Il protocollo sfrutta la produzione di ROS attivati dalla luce all'interno degli organelli 16,17,18,19,20 (Figura 1). I perossisomi marcati con colorante sono illuminati, portando alla produzione di ROS all'interno del lume perossisomiale, che innesca specificamente la lesione perossisomiale. Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che i perossisomi stressati da ROS vengono rimossi attraverso una via di degradazione ubiquitina-dipendente. I perossisomi stressati da ROS reclutano l'ubiquitina E3 ligasi Stub1 per consentire il loro inghiottimento in autofagosomi per la rimozione individuale mediante pexofagia16. Si può usare questo protocollo per confrontare il destino dei perossisomi feriti e sani all'interno della stessa cellula mediante microscopia time-lapse. Il metodo può anche essere utilizzato per danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in tutte le cellule) su un piatto di coltura, consentendo l'analisi biochimica della via della pexofagia.

<table><tbody><tr><td>Piatto di coltura da 35 mm con micropozzetto in vetro di 20 mm di diametro.</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 mm fondo di vetro</td></tr><tr><td>3-ammino-1,2,4-triazolo (3-AT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>siero bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>realizzato aggiungendo il dimero tandem KillerRed con PTS1(VKSKL)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>La spina dorsale di EGFP-C1 è stata utilizzata per la clonazione di EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PCR del gene Hsp70 (HSPA1A) amplificato dal cDNA HeLa e clonato in EGFP-C1</td></tr>, <tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr>, <tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>generato inserendo il gene umano SQSTM1 (attraverso l'amplificazione PCR del cDNA della cellula HeLa) in EGFP-C1</td></tr>, <tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>generato inserendo il gene Stub1 di topo (attraverso l'amplificazione PCR del cDNA del rene di topo totale) in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>ligando HaloTag TMR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1 aggiunto e clonato nel</td></tr> microscopio confocale invertito <tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr> della spina dorsale EGFP-C1 <tr><td></td><td>Microscopio Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&nbsp; con incubatore a camera TOKAI HIT e attacco per piatto UNIV2-D35</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 nm</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>NIH3T3 cellula</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>aderente</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>media sierico ridotto</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR amplificato da HeLa cDNA e clonato intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>generato aggiungendo eroGFP (tratto dal plasmide Addgene 20131) con la sequenza di aminoacidi VKSKL e clonato nella cellula EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>aderente</td></tr></tbody></table>

monitoraggio della pexofagia mediata da stub1

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Le cellule di mammifero possono trasformare i perossisomi attraverso la pesofagia mediata da Stub1. Il percorso consente potenzialmente il controllo cellulare della quantità e della qualità dei perossisomi. Durante questo processo, la proteina da shock termico 70 e l'ubiquitina E3 ligasi, Stub1, traslocano sui perossisomi per essere girati per iniziare la pexofagia. L'attività della ligasi Stub1 consente l'accumulo di ubiquitina e di altri moduli correlati all'autofagia su perossisomi mirati. L'elevazione dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume perossisomale può attivare la pesofagia mediata da Stub1. Si può, quindi, utilizzare la generazione di ROS assistita da coloranti per innescare e monitorare questo percorso. Questo articolo delinea le procedure per l'utilizzo di due classi di coloranti, proteine fluorescenti e fluorofori sintetici, per avviare la pesofagia all'interno di colture cellulari di mammifero. Questi protocolli basati sulla generazione di ROS assistiti da coloranti non solo possono essere utilizzati per colpire tutti i perossisomi all'interno di una popolazione cellulare a livello globale, ma possono anche consentire la manipolazione di singoli perossisomi all'interno di singole cellule. Descriviamo anche come la pexofagia mediata da Stub1 può essere seguita usando la microscopia a cellule vive.

Lo schema di induzione della pesofagia mediata da Stub1 mostrato qui sfrutta la generazione di ROS assistita da coloranti all'interno del lume del perossisoma. Questa operazione richiede intensità luminose minime. I perossisomi contenenti proteine fluorescenti o coloranti possono quindi essere illuminati utilizzando microscopi confocali a scansione laser standard. L'illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all'interno dei singoli perossisomi, come indicato dal reporter fluorescente roGFP...

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'attivazione e il monitoraggio della pesofagia mediata da Stub1 in cellule vive.

Monitoraggio della pexofagia mediata da Stub1

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

I perossisomi effettuano la beta ossidazione e sono soggetti a danni da ROS. Questo metodo permette di studiare come le cellule trattano i perossisomi stressati da ROS. Questo protocollo non viene utilizzato solo per colpire globalmente tutti i perossisomi all'interno di una popolazione cellulare, ma può anche consentire la manipolazione dei singoli perossisomi all'interno di singole cellule.La generazione di ROS assistita da coloranti può anche essere utilizzata per colpire gli organelli al di fuori dei perossisomi per sondare come le cellule affrontano le lesioni da organello. Per iniziare, seminare due volte 10 alla quinta cellula umana SHSY5Y o sei volte 10 alla quarta cellula NIH H3T3 del topo in 840 microlitri di terreno di coltura su piatti di coltura da 35 millimetri con fondo di vetro con un micropozzetto di vetro di 20 millimetri di diametro. Coltiva le cellule sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 24 ore.Quindi, trasfettare le cellule con i plasmidi desiderati usando un reagente di trasfezione o una trasfezione cellulare SHSY5Y. Diluire plasmidi in 55 microlitri di DMEM/F-12 senza siero e diluire un microlitro di reagente di trasfezione in 55 microlitri di DMEM/F-12 senza siero. Combinare il DNA diluito con il reagente diluito.Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il complesso al micropozzetto da 20 millimetri precedentemente placcato con 100 microlitri di terreno di coltura contenente cellule SHSY5Y senza antibiotici. Agitare delicatamente il piatto avanti e indietro.Eseguire la trasfezione cellulare NIH 3T3 come dimostrato in precedenza, ma sostituire il mezzo sierico ridotto invece di DMEM/F-12 privo di siero per la diluizione del plasmide e il reagente di trasfezione. Dopo due ore di trasfezione, rimuovere il mezzo contenente il reagente di trasfezione e aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco. Incubare le cellule NIH 3T3 o SHSY5Y a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 24 ore.Per la produzione di ROS attivati dalla luce, a 24 ore dalla trasfezione rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 10 microlitri di ligando HaloTag TMR nanomolare o 200 ligando nanomolare Janelia Fluor 646 HaloTag sul micropozzetto di vetro da 20 millimetri. Trasferire il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e lasciarlo per un'ora a macchiare le cellule. Dopo un'ora, rimuovere accuratamente il mezzo di colorazione e aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco.Posizionare un piatto con fondo di vetro contenente le cellule desiderate su un microscopio confocale a scansione laser dotato di un'incubatrice da palcoscenico. Nel software, fare clic su Finestra strumenti, scegliere Ocular e fare clic sul pulsante DIA per accendere la luce trasmessa. Visualizza il piatto attraverso l'oculare del microscopio e metti a fuoco le cellule ruotando la manopola di messa a fuoco.Scegliere LSM e fare clic sul pulsante Dye Detector Select. Fare doppio clic sui coloranti desiderati nella finestra pop-up per selezionare le impostazioni laser e di filtro appropriate per l'imaging delle cellule. Fare clic su Live4x nel pannello Live per avviare la scansione laser veloce per avviare lo screening dei segnali fluorescenti delle cellule.Spostare lo stage utilizzando il controller del joystick e individuare le cellule medie che esprimono diKillerRed VKSKL o SLP-VKSKL per applicare lo stress ROS sui perossisomi. Acquisire un'immagine della cella desiderata. Fare clic su Finestra strumento e scegliere Stimolazione LSM.Quindi fai clic sul pulsante ellisse e nella finestra Live Image usa il mouse per disegnare un ROI di 15 micrometri di diametro contenente i perossisomi desiderati a cui verrà applicata la sollecitazione ROS. Per applicare lo stress ROS, utilizzare 561 nanometri per le cellule con il ligando SLP marcato con diKillerRed VKSKL o TMR e utilizzare 640 nanometri per le cellule colorate con il ligando SLP marcato con Janelia Fluor 646. Selezionare la lunghezza d'onda del laser per applicare la sollecitazione ROS.Inserisci la percentuale laser desiderata e la durata. Per la produzione di ROS nei perossisomi, fare clic su Acquisisci e quindi sul pulsante Stimolazione per avviare la scansione con 561 o 640 nanometri di luce attraverso i ROI per 30 secondi ciascuno. Questa stimolazione corrisponde a circa il 5% delle impostazioni di potenza del laser per 561 e 640 nanometri.Dopo 30 secondi di illuminazione laser, i perossisomi all'interno dei ROI perdono i loro segnali diKillerRed VKSKL, TMR o Janelia Fluor 646. Questa perdita di segnale consente di distinguere i perossisomi illuminati e non illuminati all'interno della cellula. Per monitorare le cellule vive dei pexofagei, seguire la traslocazione di Stub1, Hsp70, ubiquitina, p62 o LC3B con tag EGFP sui perossisomi illuminati o sollecitati da ROS mediante imaging time lapse utilizzando intervalli di 10 minuti tra i fotogrammi.L'illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all'interno dei singoli perossisomi come indicato dal reporter fluorescente roGFP2-VKSKL. L'immagine diKillerRed VKSKL è stata scattata dopo che tutte le misurazioni roGFP2-VKSKL sono state effettuate per indicare la posizione dei perossisomi danneggiati. I dati mostrano anche che i perossisomi non illuminati non sono interessati, indicando la precisione della metodologia.Questa metodologia è stata utilizzata per monitorare la esofagia mediata da Stub1. Durante questo processo, Hsp70, Stub1, proteine ubiquitinate, adattatori di autofagia p62 e LC3B appaiono successivamente nei perossisomi stressati da ROS per guidare la pesofagia. Utilizzando la stessa strategia, è stato possibile danneggiare contemporaneamente tutti i perossisomi su un piatto di coltura per la caratterizzazione biochimica della pesofagia mediata da Stub1.Prima dell'illuminazione a LED, la fluorescenza EGFP-ubiquitina era omogenea nel citoplasma e non colocalizzava con i perossisomi. Dopo nove ore di illuminazione a LED, i segnali EGFP-ubiquitina si sono accumulati su tutti i perossisomi nelle cellule cresciute in un piatto confocale. Utilizzando questo protocollo, abbiamo scoperto che i perossisomi stressati da ROS vengono rimossi attraverso una via di degradazione ubiquitina-dipendente.I perossisomi stressati da ROS reclutano l'ubiquitina E3 ligasi Stub1 per consentire la loro rimozione mediante pesofagia.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo per monitorare l'attività ubiquitina-proteasoma in cellule viventi è descritto. Un degron-destabilizzato GFP-(GFP-dgn) e di una stalla GFP-dgnFS proteina di fusione vengono generati e trasdotto nella cella utilizzando un vettore lentivirale espressione. Questa tecnica permette di generare una linea cellulare stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS esprimendo in cui ubiquitina-proteasoma attività può essere facilmente valutata usando epifluorescenza o citometria a flusso.

Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine ​​Reporter

Qui viene presentato un metodo comodo e potente per studiare l'autofagia in Penicillium chrysogenum utilizzando tamponi di fame (miscele di agarosio e acqua di rubinetto in un vetrino da microscopio contenente una cavità centrale).

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

Qui, descriviamo in dettaglio un approccio di microscopia video time-lapse per misurare il reclutamento temporale di EYFP-Parkin durante la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati. Questo processo dinamico di rimozione dei mitocondri danneggiati da EYFP-Parkin-dipendente può essere utilizzato come indicatore della salute cellulare in diverse condizioni sperimentali.

Time-Lapse Video Microscopia per la valutazione di EYFP-Parkin aggregazione come marcatore per cellulare Mitophagy

Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Gli endosomi di riciclaggio fanno parte della rete tubulare endosomiale. Qui presentiamo un metodo per quantificare le dinamiche del riciclaggio degli endosomi utilizzando GFP-STX13 come marcatore di organelli.

Il test basato sulla microscopia per studiare e analizzare gli endosomi di riciclaggio utilizzando il traffico di SNARE

Esplorare la mitofagia attraverso la microscopia elettronica, i sensori genetici e l'immunofluorescenza richiede attrezzature costose, personale qualificato e un investimento di tempo significativo. Qui, dimostriamo l'efficacia di un kit di coloranti a fluorescenza commerciale nel quantificare il processo mitofagico sia in Caenorhabditis elegans che in una linea cellulare di cancro al fegato.

Rilevazione della mitofagia in Caenorhabditis elegans e cellule di mammifero utilizzando coloranti organelli-specifici

La lipofagia è una forma selettiva di autofagia che comporta la degradazione delle goccioline lipidiche. Le disfunzioni in questo processo sono associate allo sviluppo del cancro. Tuttavia, i meccanismi precisi non sono ancora del tutto compresi. Questo protocollo descrive approcci di imaging quantitativo per comprendere meglio l'interazione tra autofagia, metabolismo lipidico e progressione del cancro.

Esplorare la regolazione del catabolismo delle goccioline lipidiche attraverso la lipofagia

Qui, presentiamo la metodologia per valutare in modo conciso i livelli di LC3-II del marcatore autofagosomico nelle vescicole extracellulari (EV) mediante immunoblotting. L'analisi dei livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, nella formazione di autolisosomi e nella formazione di omegasomi suggerisce il nuovo ruolo di STX6 nel rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

Le sonde PeroxiSPY sono utilizzate per rilevare i perossisomi nelle cellule dei mammiferi. Qui dimostriamo come utilizzare le sonde per colorare i perossisomi in cellule vive e fisse.

Colorazione con perossisoma nelle cellule di mammiferi utilizzando sonde specifiche per perossisomi

Scopri la pexofagia mediata da Stub1 nelle cellule SHSY5Y umane e NIH 3T3 murine. Questo metodo di imaging in tempo reale rivela come le perossisomi stressate da ROS vengono rimosse tramite degradazione ubiquitin-dipendente.

Monitoraggio della pexofagia mediata da Stub1

Esplora altri video