Analisi della calcificazione vascolare extracellulare vescicolo-mediata mediante modelli in vitro e in vivo

Questo protocollo fornisce un metodo che può essere utilizzato per aiutare a valutare e, in futuro, aiutare a sviluppare trattamenti per la calcificazione vascolare, che è il predittore più significativo delle malattie cardiovascolari. La capacità di isolare le EV ci consente di studiare ulteriormente i meccanismi che portano alla calcificazione vascolare e il cambiamento fenotipico delle cellule muscolari lisce vascolari. Questa tecnica fornisce informazioni sui primi meccanismi molecolari della calcificazione mediata dalle cellule della muscolatura liscia vascolare.

La comprensione di questo consente di studiare le opzioni terapeutiche per il meccanismo compreso. Qualsiasi EV di interesse può essere studiato utilizzando questo metodo. Non è esclusivo delle cellule muscolari lisce vascolari, degli osteoblasti o della calcificazione vascolare.

Dopo aver eutanasia il topo, sollevare la pelle usando una pinzetta e fare un'incisione lungo la linea mediana. Rimuovere la pelle in eccesso o il grasso. Quindi rimuovere gli organi riproduttivi, la vescica e il grasso al di fuori della linea mediana.

Quindi spostare gli organi gastrointestinali sul lato destro e seguire l'intestino nella linea mediana. Una volta trovato, sollevare la linea mediana e asportare il tratto gastrointestinale fino allo stomaco. Asportare i reni sollevandoli dalla linea mediana.

Tagliare il più vicino possibile al rene. Rimuovere il fegato sollevando i lobi e tagliando via dalla linea mediana. Quindi perfondere il cuore e l'aorta iniettando PBS freddo nel ventricolo destro usando una siringa da 10 millilitri.

Aspetta che i polmoni si gonfino e diventi bianco. Rimuovere i polmoni e qualsiasi diaframma in eccesso o gabbia toracica. Per rimuovere l'osso, aprire un paio di forbici larghe e posizionarle nella regione inferiore del mouse sopra la coda.

Tagliare verso il basso, sollevare la colonna vertebrale dalla pelle e rimuovere il grasso dai lati della linea mediana. Una volta che la pelle è staccata, asportare la colonna vertebrale e gli organi intatti tagliando proprio sopra il cuore. Posizionare la colonna vertebrale e gli organi intatti in un becher di PBS nel secchiello del ghiaccio se si trasporta su uno stereoscopio.

Dopo aver spostato la colonna vertebrale e gli organi nel piatto di dissezione, riempirlo con PBS ghiacciato e fissare la colonna vertebrale e la gabbia toracica usando gli aghi. Sotto il microscopio a dissezione, sollevare il cuore con attenzione usando una pinzetta e iniziare a tagliare sopra la colonna vertebrale e sotto l'aorta. Continuare fino a raggiungere la parte inferiore della colonna vertebrale.

Rimuovere la colonna vertebrale dal piatto di dissezione e fissare il cuore e qualsiasi grasso estraneo o muscolo. Partendo dall'area appena sotto il cuore, identificare l'esofago, la vena cava e l'aorta. Rimuovere l'esofago e la vena cava per avere un campo visivo chiaro dell'aorta.

Usando la pinza e le forbici da microdissezione, iniziare a sollevare il tessuto adiposo e tagliare il più vicino possibile all'aorta. Continuare questo lungo la linea mediale fino a quando tutta l'aorta e le arterie femorali sono esposte. Al cuore, rimuovere tutto il tessuto adiposo esponendo i tre rami all'arco aortico.

Rimuovere la radice aortica dal ventricolo sinistro inserendo le forbici di micro-dissezione nel ventricolo sinistro e tagliando il muscolo che circonda l'aorta. Una volta che l'aorta è isolata e pulita, visualizzare l'aorta utilizzando uno scanner nel vicino infrarosso per visualizzare la calcificazione vascolare. Utilizzando lo script MATLAB personalizzato, quantificare il segnale totale del tracciante di calcio normalizzato nell'area totale dell'aorta scansionata.

Indirizza il MATLAB verso la posizione dei file TIF dalla scansione nel vicino infrarosso delle aorte, apri i singoli file ed estrai i valori di intensità dei pixel dai file TIF. Selezionare l'aorta con la maggiore calcificazione come scala massima sull'immagine mappata a colori. Quando il comando, Quanti campioni sono nell'immagine, appare sulla finestra, inserisci il numero di aorte nell'immagine corrente e seleziona ciascuna aorta una per una.

Una volta selezionata un'aorta, MATLAB creerà immagini binarie con una maschera dell'area totale e dell'area calcificata dell'aorta. I valori di queste immagini mascherate vengono quindi utilizzati per determinare l'area calcificata totale, l'area totale dell'aorta, l'area percentuale positiva per la calcificazione e l'intensità media dell'area calcificata. Immediatamente dopo la scansione delle aorte, raggruppare da due a tre aorte per produrre una concentrazione proteica sufficiente.

Incubare da due a tre aorte raggruppate in 1,5 millilitri di soluzione digestiva per due ore a 37 gradi Celsius. Raccogliere la soluzione e centrifugare a 1.000 g per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Quindi, per rimuovere le microvescicole, centrifugare nuovamente il surnatante per 30 minuti a 33.000 g.

Raccogliere e valutare il surnatante per il potenziale di calcificazione. Dopo aver rimosso i detriti cellulari dal mezzo raccolto condizionato mediante centrifugazione, ruotare il surnatante raccolto a 33.000 g per 30 minuti. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo.

Quindi aggiungere l'1% di 300 millimolari di sodio diidrogeno fosfato ai campioni di vescicole extracellulari e mescolare la soluzione mediante pipettaggio. Trasferire 200 microlitri della soluzione di miscela in una piastra a 96 pozzetti e incubare la piastra a 96 pozzetti nel lettore di micropiastre a 37 gradi Celsius. Impostare il lettore di piastre per registrare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 340 nanometri ogni minuto.

Pipettare 300 microlitri della soluzione di collagene in ciascun pozzetto di un vetro a otto pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 300 microlitri di DMEM come controllo nei pozzetti. Aggiungere 300 microlitri dei campioni di mezzo vescicola extracellulare raccolti in precedenza ai pozzetti rimanenti e incubare per sei giorni, come dimostrato in precedenza.

Il 10 ° giorno, pipettare 2,5 microlitri della miscela OsteoSense e DMEM in ciascun pozzetto e incubare per 24 ore. Alla fine dell'incubazione, visualizzare gli idrogel con filtri per la fluorescenza OsteoSense attraverso il fondo di una camera di vetro di copertura utilizzando un microscopio invertito o dall'alto con un obiettivo a lunga distanza di lavoro. Valutare il numero di calcificazioni e la dimensione della calcificazione e le immagini raccolte utilizzando le opzioni di analisi delle particelle disponibili in ImageJ.

Quindi passare a Immagine, selezionare Regola e fare clic su Soglia per binarizzare le immagini, in modo che solo il segnale OsteoSense appaia bianco. Quindi utilizzare l'analisi e fare clic sul comando Analizza particelle per ottenere informazioni per ogni calcificazione nell'immagine. Utilizzare gli stessi parametri di soglia per coerenza per ogni immagine analizzata.

L'imaging dello scanner ottico nel vicino infrarosso delle aorte sezionate ha mostrato un segnale OsteoSense più elevato in tutta l'aorta di un topo con malattia renale cronica rispetto alle due aorte dei topi di controllo. Il mezzo condizionato ottenuto da cellule muscolari lisce vascolari coltivate in un mezzo pro-calcifico ha mostrato un'assorbanza più elevata a 340 nanometri rispetto al mezzo di controllo. L'aumento dell'assorbanza si è verificato 1,5 volte più velocemente nel campione pro-calcifico rispetto a un campione di controllo.

Il mezzo condizionato da cellule coltivate in condizioni procalcifiche conteneva depositi minerali. Quando si micro-seziona l'aorta, è importante tagliare attentamente il grasso che circonda l'aorta. Vuoi la maggior parte possibile dell'aorta da analizzare, ma questo può essere piuttosto noioso.

Una volta isolati gli EV, potrebbero essere completati ulteriori test, come un test di attività della fosfatasi alcalina o un corpo immunologico. Questi test mostrerebbero ulteriormente i meccanismi e le proteine presenti nelle EV.