Name: Definizione del modello di sindrome del midollo centrale nel topo C57BL/6J (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Scopri un protocollo chirurgico per simulare la sindrome del midollo centrale nel topo C57BL/6J. Questo metodo migliora la ripetibilità e riduce i danni operativi, facilitando lo studio dei meccanismi di lesione spinale.

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Questo studio è stato supportato dal National Key Research and Development Project of Stem Cell and Transformation Research (2019YFA0112100) e dallo State Key Program of National Natural Science of China (81930070).

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per l'etica e il benessere degli animali da laboratorio del Cheeloo College of Medicine dell'Università di Shandong (numero di approvazione: 22021). Sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, revisionato nel 1996). Tutti i topi utilizzati in questo studio erano topi femmina C57BL/6J di 9-10 settimane acquistati dalla Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Cina). Un totale di 9 topi coinvolti in questo studio sono stati ugualmente randomizzati ai gruppi di controllo, lieve e grave. A 7, 28 e 70 giorni dopo l'infortunio, un topo di ogni gruppo è stato sacrificato.
1. Laminectomia C6 ed esposizione del midollo spinale
NOTA: L'esposizione è stata eseguita al microscopio. Il sanguinamento può essere evitato prestando attenzione a due aspetti: (i) Tutti i vasi sanguigni devono essere evitati. (ii) I muscoli devono essere separati nei punti di origine e di terminazione del muscolo.
<ol><li>Preparare gli strumenti chirurgici e lo SCICP. NOTA: La struttura di SCICP è stata riportata in un precedente studio11. La differenza rispetto allo studio precedente è che il presente protocollo realizza la lesione del midollo spinale per compressione. Due pesi diversi (10,4 g e 20,8 g) di questa piattaforma possono produrre una compressione rispettivamente di 5 g/mm2 e 10 g/mm2 (Figura 1). L'esposizione del midollo spinale e le fasi di compressione sono mostrate nella Figura 2.</li>
	<li>Somministrare isoflurano al topo per inalazione utilizzando un cono nasale (induzione: 3%-5%, mantenimento: 1,5%-2%).</li>
	<li>Dopo che l'anestesia ha avuto effetto, esplora un piccolo rigonfiamento sulla linea mediana dietro il collo dei topi, che è il processo spinoso della seconda vertebra toracica (T2).</li>
	<li>Radere i peli intorno a questo rigonfiamento. Disinfettare la pelle con tre applicazioni alternate di una soluzione di iodoforo seguita da antisettici cutanei al 75% di etanolo.</li>
	<li>Posizionare il mouse prono sul tavolo operatorio. Applicare un unguento per gli occhi per proteggere gli occhi.</li>
	<li>Stendere un cuscinetto di 3-4 mm di spessore sotto il torace per consentire una curva arcuata del rachide cervicale, facilitando l'esposizione dello spazio interlamina e una via aerea non ostruita durante l'operazione. Iniettare buprenorfina come analgesia preoperatoria (0,05-0,1 mg/kg, SQ).</li>
	<li>Eseguire un'incisione longitudinale di 1-1,5 cm con un bisturi sterile centrato sul processo spinoso della 2avertebra toracica per esporre lo strato fasciale (Figura 2A).</li>
	<li>Rimuovere una porzione di tessuto adiposo al di sopra del T2 con microforbici sterili per trovare il processo spinoso del T2.</li>
	<li>Separare i muscoli trapezoidali e romboidali bilaterali da C5-T2 lungo la linea mediana con delle microforbici (Figura 2B).</li>
	<li>Separare i muscoli sulla lamina delle vertebre C5-T2 con microforbici e ritrarre lo strato muscolare ai lati con microdivaricatori sterili (Figura 2C).</li>
	<li>Tagliare i muscoli multifidi e spinali cervicali sulla superficie delle vertebre.</li>
	<li>Localizzare T2 in base al punto più alto dei processi spinosi. Sondare i processi spinosi successivamente verso l'estremità rostrale da T2 per localizzare C6 (Figura 3).</li>
	<li>Sollevare la lamina C6 con una pinza, tagliare la lamina e il midollo spinale è esposto (Figura 2D).</li>
</ol>2. Lesione da compressione del midollo spinale cervicale
<ol><li>Clamp le faccette articolari C6-7 con lo stabilizzatore vertebrale e bloccarlo (Figura 2E).</li>
	<li>Puntare la punta del peso sterile verso il midollo spinale esposto e assicurarsi che la parte inferiore piatta della punta sia posizionata parallelamente alla superficie dorsale del midollo spinale (Figura 2F).</li>
	<li>Regolare la manica in modo che il peso comprima il midollo spinale. Interrompere la regolazione quando il peso mantiene una posizione relativa costante con il midollo spinale (Figura 2G). NOTA: Non rendere questo processo troppo violento o rapido nel caso in cui il peso eserciti una forza di contusione sul midollo spinale.</li>
	<li>Rimuovere il peso e lo stabilizzatore vertebrale dopo una compressione di 5 minuti.</li>
	<li>Osservare le alterazioni del colore del midollo spinale dopo la compressione al microscopio (Figura 2H).</li>
	<li>Risciacquare con PBS sterile e utilizzare l'aspirazione per pulire il sito dell'operazione.</li>
	<li>Suturare i muscoli e la pelle a strati utilizzando una sutura non assorbibile in polipropilene (misura: 6-0).</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica, posizionare il mouse su un tappetino caldo fino a quando il mouse non ripristina la piena coscienza, quindi riportare il mouse nella gabbia del mouse.</li>
	<li>Iniettare buprenorfina per analgesia (0,05-0,1 mg/kg, SQ) ogni 8-12 ore per 3 giorni.</li>
</ol>3. Analisi istologica
<ol><li>Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo all'1,25% (0,02 ml/g di peso corporeo) nei giorni 7, 28 o 70 dopo l'infortunio. Infondere per via transcardiaca il topo con 60 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 20 mL di paraformaldeide11 al 4%.</li>
	<li>Sezionare il midollo spinale a 0,5 cm dal centro della lesione da entrambi i lati con micro forbici e preservare la sezione lunga 1 cm.</li>
	<li>Immergere la sezione conservata del midollo spinale in saccarosio al 30% a 4 °C per 48 ore.</li>
	<li>Incorporare i tessuti con OCT, tagliare i tessuti in sezioni spesse 6 μm con un criotomo e raccogliere le sezioni su un vetrino.</li>
	<li>Colorazione con ematossilina ed eosina<ol><li>Risciacquare le sezioni da 6 μm con 1x PBS per 5 minuti 3 volte per rimuovere l'OCT residuo.</li>
		<li>Immergere le sezioni nell'ematossilina per 90 s. Lavare le sezioni sotto l'acqua corrente per 3 min.</li>
		<li>Immergere le sezioni in eosina per 4 min. Immergere in alcol al 95% per 30 secondi per rimuovere l'eosina in eccesso.</li>
		<li>Infine, disidratare i vetrini con alcol (alcol al 95% e alcol al 100% due volte, in successione) per 30 secondi e mettere i vetrini in un bagno di xilene per la pulizia per 2 minuti. Quindi, sigillare le sezioni con un vetro di copertura e gel di resina.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione blu di Prussia<ol><li>Immergere i vetrini per 20 minuti in una miscela uguale di ferrocianuro di potassio (10%) e acido cloridrico (10%).</li>
		<li>Risciacquare 3 volte con acqua distillata e contromacchiare per 5 minuti con Nuclear Fast Red.</li>
		<li>Risciacquare tre volte con acqua distillata, seguito da un risciacquo con alcol al 95% e due risciacqui con alcol al 100% per 5 minuti.</li>
		<li>Pulire le sezioni in xilene due volte per 3 minuti ciascuna e poi sigillare con gel di resina12.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione a immunofluorescenza<ol><li>Incubare i vetrini con i seguenti anticorpi primari per 1 ora a 37 °C: molecola 1 (Iba-1) di coniglio anti-ionizzata per legare il calcio (1:500), che è stata up-regolata nella microglia dopo lesione nervosa; proteina acida fibrillare anti-gliale di topo (GFAP) (1:300), che è espressa negli astrociti del sistema nervoso centrale; coniglio anti-neurofilamento-200 (NF-200) (1:2000), che è espresso nel neurofilamento.</li>
		<li>Incubare con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente (RT): Alexa Fluor488 capra anti-topo e Alexa Fluor594 capra anti-coniglio (1:1.000).</li>
		<li>Scattare fotografie e analizzarle ulteriormente con un microscopio a fluorescenza13.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Risonanza magnetica per immagini
<ol><li>Anestetizzare il topo a 7 giorni dall'infortunio con anestesia con isoflurano (1%-2% isoflurano, 20%-30% O2 ) somministrata attraverso una mini maschera.</li>
	<li>Scansionare il midollo spinale cervicale con orientamento sagittale. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'imaging MRI: sequenza spin-echo (SE) in modo multislice e interleaved con TR/TE = 2500/12 ms, matrice di acquisizione = matrice 256 x 128 sul campo visivo (FOV) = 12 x 8 mm2, spessore della fetta = 1 mm e numero di eccitazioni (NEX) = 2. NOTA: Mantenere la frequenza respiratoria del mouse a 10-15/min durante la scansione per eliminare gli artefatti dell'immagine correlati alla respirazione14.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+222+Patients+With+Severe+CSCI%3A+An+8-Year+Epidemiologic+Survey+in+Western+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).</li>
<li>Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+timing+of+surgery+in+the+outcome+of+spinal+cord+injury+without+radiographic+abnormality+%28SCIWORA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA).</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223(2020).</li>
<li>Brooks, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cord+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Central cord syndrome.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 28 (1), 41-47 (2017).</li>
<li>Avila, M. J., Hurlbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cord+syndrome+redefined%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Central cord syndrome redefined.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 32 (3), 353-363 (2021).</li>
<li>Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+bilateral+cervical+contusion-compression+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).</li>
<li>López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motor+compensations+with+permanent%2C+focal+loss+of+forelimb+force+after+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).</li>
<li>Allen, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phrenic+motor+neuron+survival+below+cervical+spinal+cord+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection.</a> Experimental Neurology. 346, 113832(2021).</li>
<li>Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+cervical+contusion+spinal+cord+injury%3A+A+mouse+model+to+evaluate+sensorimotor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function.</a> Experimental Neurology. 331, 113381(2020).</li>
<li>Ropper, A. E., Ropper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+spinal+cord+compression%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute spinal cord compression.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (14), 1358-1369 (2017).</li>
<li>Sun, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+progressive+compression+model+of+thoracic+spinal+cord+injury+in+mice%3A+function+assessment+and+pathological+changes+in+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord.</a> Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).</li>
<li>Elzat, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+mouse+contusion+spinal+cord+injury+model+based+on+a+minimally+invasive+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), 64538(2022).</li>
<li>Lu, J., Xu, F., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+PVT1+regulates+ferroptosis+through+miR-214-mediated+TFR1+and+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53.</a> Life Sciences. 260, 118305(2020).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+downregulation+of+%CE%B1-synuclein+reduces+neuroinflammation+and+promotes+functional+recovery+in+rats+with+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283(2019).</li>
<li>Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).</li>
<li>Yilihamu, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+central+cord+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of central cord syndrome.</a> Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).</li>
<li>Chikuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+vs+delayed+surgical+treatment+on+motor+recovery+in+incomplete+cervical+spinal+cord+injury+with+preexisting+cervical+stenosis%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial.</a> JAMA Network Open. 4 (11), e2133604(2021).</li>
<li>Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histopathological+analysis+of+the+human+cervical+spinal+cord+in+patients+with+acute+traumatic+central+cord+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome.</a> Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).</li>
<li>Menezes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells+recruit+resident+pericytes+and+induce+blood+vessels+maturation+to+repair+experimental+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19604(2020).</li>
<li>Hutson, T. H., Di Giovanni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+in+spinal+cord+injury%3A+focus+on+neuroplasticity+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration.</a> Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).</li>
<li>El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+respiratory+function+following+contusion+injury+of+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord.</a> Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).</li>
<li>El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+single+phrenic+axon+recordings+to+assess+diaphragm+recovery+after+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).</li>
<li>Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+hypoxia+and+respiratory+recovery+in+preclinical+rodent+models+of+incomplete+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 113751(2021).</li>
<li>Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+plasticity+following+spinal+cord+injury%3A+perspectives+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man.</a> Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).</li>
<li>Forgione, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+contusion-compression+model+of+incomplete+traumatic+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tra i numerosi tipi di lesione del midollo spinale, la CCS è uno dei tipi di lesione potenzialmente più curabili 3,4. A causa della mancanza di modelli di ricerca di laboratorio, la ricerca sulla CCS degli anni '50 si è concentrata su studi clinici e indagini di dissezione cadaverica 3,16,17. Il presente studio mostra l'utilizzo di strumenti compatibili e procedure minimamente invasive per stabilire il modello CCS dei topi. Da un punto di vista tecnico, questa piattaforma ha una forte operabilità e una buona riproducibilità. Dato che i risultati dell'esperimento dimostrano la validità, la nostra tecnica per stabilire il modello più vicino allo standard che gli studi precedenti hanno definito per CCS4.
Precedenti studi sulle lesioni da compressione hanno impiegato principalmente clip per aneurisma, palloncini e pinze calibrate 9,10,18. Inoltre, la maggior parte delle lesioni si è verificata a livello del midollo spinale toracico18. Il midollo spinale a livello C6 è stato scelto come segmento danneggiato in questo studio per studiare le caratteristiche della CCS. Vale la pena sottolineare che anche il tasso di sopravvivenza del modello CCS è un fattore essenziale per garantire la coerenza sperimentale. Il presente studio riporta che causano lesioni da compressione bilaterale al midollo spinale cervicale del topo, mentre lesioni traumatiche del midollo spinale di alto livello, in particolare lesioni bilaterali, potrebbero essere fatali per gli animali da esperimento se troppo gravi. Secondo El-Bohy, è più probabile che il midollo spinale C4/5 influenzi il tratto bulbospinale discendente e i motoneuroni respiratori, il che porta gli animali da esperimento alla depressione respiratoria e alla morte 18,19,20,21,22,23., In questo studio, i topi con diversi gradi di compressione sul midollo spinale cervicale C6 hanno caratteristiche di lesione significativamente differenziate suggerite da esami istologici. Sebbene ci fossero significative differenze comportamentali e istologiche nel modello di clampaggio del midollo spinale cervicale del topo riportato da Forgione, era necessaria l'interruzione dei peduncoli, dei processi articolari, delle lamine e persino delle radici nervose per bloccare il midollo spinale con le pinze modificate, che avevano un'influenza significativa sulla stabilità delle strutture cervicali24. Un altro studio sulle lesioni cervicali ha riportato l'utilizzo del processo trasverso come sito di fissazione5. Anche se i processi articolari sono stati impediti dal danno, la rottura del tessuto muscolare eccessivo potrebbe anche portare a un impatto sulla stabilità del midollo spinale. Nel presente studio, solo la 6alamina cervicale è stata resecata per mantenere la stabilità del midollo spinale cervicale, con le articolazioni articolari adiacenti preservate e danni muscolari eccessivi evitati. Allo stesso tempo, la compressione dall'alto del midollo spinale previene i danni alle radici nervose.
I risultati di HE suggeriscono che l'area di danno al midollo spinale cervicale dei topi in ciascun gruppo era principalmente nella materia grigia vicino al midollo centrale, che caratterizzava la CCS, con differenze significative nella portata della lesione tra i diversi gruppi. In particolare, le sezioni patologiche che abbiamo mostrato potrebbero aver alleviato la manifestazione della lesione perché i campioni sono stati raccolti pochi giorni dopo l'infortunio. L'immunofluorescenza (NF-200) ha mostrato meno danni ai tratti neurali nella regione della sostanza bianca del midollo spinale, il che ha anche confermato che il danno nella CCS era principalmente concentrato intorno al midollo centrale. Il risultato dell'immunofluorescenza è stato aggravato da precedenti risultati istologici di patologia. Studi precedenti hanno dimostrato che la CCS porta all'edema vicino al midollo centrale, portando all'ematoma e, infine, alla disfunzione nella porzione mediale del tratto corticospinale laterale3. L'emorragia è stata segnalata come una componente tipica della CCS, ma è stata osservata raramente nei successivi studi di imaging e autopsia17. In questo studio, i risultati dell'HE a 7 giorni dopo l'infortunio hanno suggerito segni di edema tissutale in tutti i gruppi; Tuttavia, non sono stati trovati globuli rossi residui nell'area della lesione. Pertanto, il blu di Prussia è stato utilizzato per esaminare l'area della lesione per l'emorragia e i risultati corrispondevano all'emosiderosi osservata nell'area della lesione del gruppo con lesioni gravi a 7 giorni dopo l'infortunio, mentre il gruppo con lesioni lievi non lo ha fatto. Le immagini della risonanza magnetica T2 hanno mostrato che sia le lesioni lievi che quelle gravi avevano aree a basso segnale nell'area danneggiata della lesione a 7 giorni dopo l'infortunio. indicando qui la deposizione di lisato di reticolociti. Questi risultati forniscono prove circostanziali che la discrepanza tra i risultati precedentemente riportati è probabilmente dovuta al fatto che il test di risonanza magnetica è potenzialmente più sensibile del test istologico14, oltre alla gravità della lesione, che può anche influenzare la quantità di emorragia nell'area della lesione. Anche la GFAP è stata ampiamente espressa nell'area danneggiata. Allo stesso tempo, l'espressione di Iba-1 è stata osservata anche in aree intatte, suggerendo la persistenza di una risposta infiammatoria, coerente con i risultati della risonanza magnetica, dove un anello di segnale iperintenso intorno all'area del segnale ipointenso nella lesione suggerisce la presenza di una risposta infiammatoria. In definitiva, sulla base dei risultati del presente studio, l'area di lesione nel modello si è concentrata sulla materia grigia intorno al midollo centrale, che è generalmente coerente con le descrizioni precedentemente riportate13. Sfortunatamente, non abbiamo eseguito la risonanza magnetica ripetutamente in tutti gli animali da esperimento per mostrare come il sito della lesione cambia dinamicamente nel tempo. I futuri ricercatori possono includere questo aspetto nel loro lavoro per una migliore indagine sulla CCS. Inoltre, l'immunomarcatura con marcatori neuronali come NeuN, che definiscono la materia grigia, può essere inclusa nello studio.
In conclusione, le caratteristiche dei risultati sulla patologia e sulle scansioni MRI hanno strette somiglianze con quelle descritte per la CCS in studi precedenti4. L'attuale protocollo, che modella in modo fattibile la CCS, consente ulteriori ricerche e comprensione della CCS.

Negli ultimi anni si è assistito a un costante aumento dell'incidenza di lesioni del midollo spinale (SCI), con un maggior numero di lesioni nelle persone anziane causate da tauma1 meno violenta. Queste lesioni coinvolgono più frequentemente il rachide cervicale e più spesso portano a una disfunzione neurologica incompleta2.
Nel ventunesimo secolo, la CCS è il tipo più diffuso di lesione midollare incompleta, rappresentando più della metà di tutte le lesioni. Rispetto alla lesione midollare incompleta convenzionale, la CCS è caratterizzata da una compromissione sproporzionatamente maggiore degli arti superiori rispetto a quelli inferiori3. È caratterizzata da debolezza prevalentemente degli arti superiori con disfunzione sensoriale e vescicale meno significativa. Si ritiene che la CCS sia causata da emorragia ed edema post-traumatico della regione centrale o, come recentemente proposto, dalla degenerazione walleriana da compressione del midollo spinale nella stenosi del canale spinale. La gestione della CCS manca di evidenze di alto livello per guidare, il che richiede una comprensione completa della sua fisiopatologia4. Tuttavia, non sono stati segnalati modelli di CCS. Modelli animali adatti sono essenziali per la comprensione della fisiopatologia, che possono fornire una base di ricerca per studi clinici e preclinici 5,6,7,8,9,10.
In questo studio, viene stabilito un modello di CCS nei topi con una piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale (SCICP) e un piano operativo minimamente invasivo, che consente ulteriori ricerche e comprensione della CCS. Il modello si è dimostrato valido nel corso del processo di ricerca mediante analisi istologica, di risonanza magnetica (MRI) e di immunofluorescenza.

<table><tbody><tr><td>Soluzione fissativa al 4%</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr> <tr><td>Anticorpo polipeptidico pesante anti-neurofilamento</td> al 4% <td>Abcam</td><td>ab8135</td><td>Rapporto di diluizione (1:2000)</td></tr><tr><td>Soluzione colorante con eosina (solubile in acqua)</td><td>Biosharp</td><td>BL727B</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Fuyu etanolo</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-X800</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice Surgelata</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFAP (GA5) Mouse mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling TECHNOLOGY#</td><td>3670</td><td>Rapporto di diluizione (1:600)</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 488</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>A32723TR</td><td>Rapporto di diluizione (1:1000)</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 594</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>A32740</td><td>Rapporto di diluizione (1:1000)</td></tr><tr><td>Ematossilina Soluzione colorante</td><td>Biosharp</td><td>BL702A</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>Jinan Pengyue Animale sperimentaleCompany&nbsp;</td><td>C57BL/6J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per microchirurgia&nbsp;</td><td>Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd</td><td>Tutti gli strumenti chirurgici sono</td><td>forbici oftalmiche su misura, micro pinze per zanzare, pinze per microchirurgia, micro forbici</td></tr><tr><td>Siero di pecora normale per il blocco (soluzione di lavoro)</td> <td>Zhong Shan Jin Qiao</td><td>ZLI-9022</td><td>soluzione di lavoro</td></tr><tr><td>O.C.T. Composto</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tamponata con fosfato (PBS)&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH 7.2&ndash; 7.4</td></tr><tr><td>Kit per la colorazione del ferro blu di Prussia (con eosina)</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td></td></tr><tr><td>RWD Stazione di anestesia per inalazione da laboratorio</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R550</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging microCT in vivo per piccoli animali</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td>Quantum GX2</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale</td><td>Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd</td><td>Su misura (standard di Feng)</td> <td>https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq& alg_id= 0& slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId& components_ style_layout =1& reft=1659409105184& spm= g.930111970_f.81386274& alias= 367x5ovgn69q18g& from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba& sf=qq_sm& is_share= 1& shopAutoEnter=1& share_cmpt =native_wechat& is_silence_auth=1</td></tr><tr><td>Microscopio chirurgico&nbsp;</td><td>Zumax&nbsp; Fornitore verificato - Medical Co., Ltd.</td><td>zumax, OMS2355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Soluzione salina+Tween tamponata (TBST)</td><td>Solarbio</td><td>T1082</td> Rapporto <td>di diluizione (1:19)</td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td> <td>xilene</td> Fuyu</tr></tbody></table>

definizione del modello di sindrome del midollo centrale nel topo c57bl/6j

Establishment of Central Cord Syndrome Model in C57BL/6J Mouse

I modelli animali di sindrome del midollo centrale (CCS) potrebbero apportare notevoli benefici alla ricerca preclinica. I percorsi anatomici identificabili possono fornire approcci di esposizione minimamente invasivi e ridurre le lesioni extra agli animali da esperimento durante il funzionamento, consentendo il mantenimento di una morfologia anatomica coerente e stabile durante gli esperimenti per ridurre al minimo le differenze comportamentali e istologiche tra gli individui per migliorare la riproducibilità degli esperimenti. In questo studio, il midollo spinale di livello C6 è stato esposto utilizzando una piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale (SCICP) e la combinazione con una tecnica minimamente invasiva. Con l'assistenza di uno stabilizzatore vertebrale, abbiamo fissato le vertebre e compresso il midollo spinale di topi C57BL/6J con pesi da 5 g/mm2 e 10 g/mm2 con SCICP per indurre diversi gradi di lesione del midollo spinale C6. In linea con la precedente descrizione della CCS, i risultati rivelano che la lesione in questo modello è concentrata nella materia grigia intorno al midollo centrale, consentendo ulteriori ricerche sulla CCS. Infine, i risultati istologici sono forniti come riferimento per i lettori.

La sezione sagittale di HE suggerisce che, anche se l'area danneggiata nella sostanza grigia era più ampia nel gruppo grave, era presente una continuità sulla sostanza bianca. Inoltre, la differenza nell'area della materia grigia danneggiata tra i gruppi gravi e lievi supporta la ragionevolezza dell'impostazione del gruppo nel protocollo (Figura 4).
Le sezioni coronali di HE mostrano che la lesione esiste principalmente nella sostanza grigia in entrambi i gruppi. Nel gruppo grave, la struttura della sostanza bianca che circonda la sostanza grigia aveva maggiori probabilità di essere influenzata, ma il contorno della sostanza bianca era ancora mantenuto (Figura 5). L'immunofluorescenza NF-200 suggerisce che, anche se la sostanza bianca che circonda la materia grigia è stata colpita nel gruppo grave, la sostanza bianca era ancora relativamente intatta. Questi risultati sono coerenti con le caratteristiche descritte per la CCS nel precedente studio4 (Figura 6).
Non sono stati trovati globuli rossi nelle sezioni sagittali di HE a 7 giorni dopo la lesione sia nel gruppo lieve che in quello grave. La colorazione blu di Prussia non ha rivelato emosiderosi nel gruppo lieve ma nel gruppo grave. Questi risultati indicano che l'incentivo di un'emorragia può richiedere un grado di danno relativamente grave (Figura 7).
L'immunofluorescenza ha rivelato aree di elevata espressione di GFAP e Iba-1 sia in lesioni lievi che gravi, suggerendo una risposta infiammatoria e la formazione di una cicatrice gliale nella lesione. Inoltre, il gruppo grave ha mostrato un'area di lesione più ampia rispetto al gruppo lieve (Figura 8).
La risonanza magnetica è un metodo relativamente minimamente invasivo per osservare il midollo spinale. I risultati suggeriscono che sia nel gruppo lieve che in quello grave, c'è un cambiamento di segnale ipointenso nella lesione con un contorno di segnale elevato. Il gruppo grave ha mostrato un'area di segnale ipointenso significativamente più ampia (Figura 9). Il segnale ipointenso suggerisce un precipitato dal lisato reticolocitario in quest'area e il segnale iperintenso circostante suggerisce una risposta infiammatoria. Abbiamo condotto diversi test comportamentali nel nostro studio precedente. Ad esempio, il test della forza di presa negli arti anteriori rivela una differenza significativa15.
<img alt="Pesi e manicotto per l'impostazione del reometro; utilizzato negli esperimenti di misurazione della viscosità." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Il manicotto e i pesi di SCICP. La superficie della punta è stata progettata per essere di 1,3 mm x 1,6 mm in base all'area esposta del midollo spinale misurata dopo la laminectomia C6. Il peso è rivestito in PTFE, che riduce efficacemente l'attrito tra la parete interna del manicotto e il peso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Sequenza della procedura chirurgica, passaggi A-H, dissezione tissutale, incisione, pinze, configurazione sperimentale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Esposizione e compressione del midollo spinale. (A) Incisione longitudinale della pelle; (B) Separare i muscoli rostralmente dal processo spinoso T2; (C) Separare i muscoli sopra le lamine; (D) laminectomia C6; (E) Fissaggio del corpo vertebrale; (F) Determinazione del luogo di compressione; (G) Compressione del midollo spinale; (H) Nessun danno significativo alla sostanza bianca sopra il midollo spinale dopo la compressione del midollo spinale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma anatomico dello scheletro che mostra la sesta vertebra cervicale e il processo spinoso T2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Anatomia dello scheletro cervicale del topo. Il sito indicato dalla freccia è il processo spinoso T2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Pannello di vetrini istologici, tessuti a vari stadi di infezione, da lieve a grave, barre graduate da 1 mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Le sezioni sagittali colorate con HE. (A) Sezione sagittale del midollo spinale cervicale. (B,C) Il gruppo Grave ha avuto danni più gravi rispetto al gruppo Lieve, ma entrambi si sono concentrati sulla materia grigia intorno al midollo centrale. Le immagini a 7, 28 e 70 dpi non suggeriscono alcuna differenza significativa nell'espressione della lesione nello stesso gruppo di lesioni in periodi diversi e che la continuità della sostanza bianca nel midollo spinale superiore e inferiore viene mantenuta. Barra della scala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Confronto istologico tissutale, 28 dpi; controllo, lieve e grave degenerazione nervosa; immagine al microscopio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Lesioni del midollo spinale cervicale con sezioni coronali colorate con HE. (A-C) La lesione colpisce principalmente la materia grigia che circonda il midollo centrale, come si vede nei pannelli B e C. Il gruppo con lesioni gravi soffre di una gamma più ampia di danni rispetto al gruppo con lesioni lievi, che ha maggiori probabilità di influenzare la sostanza bianca. Barra graduata: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Microscopia del midollo spinale, colorazione NF-200; Sezioni trasversali: di controllo, lieve, grave; Analisi a 28 dpi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Immunofluorescenza coronale NF-200 dopo lesione. Risposta NF-200 senza differenze significative al contorno della sostanza bianca. Barra graduata: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Confronto istologico; controllo, lieve, grave danno tissutale a 7 dpi; immagini di diapositive; Scala da 400 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7: Colorazione blu di Prussia. (A-C) L'emosiderosi è stata osservata nel gruppo grave ma non nel gruppo lieve. Barra graduata: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Microscopia a immunofluorescenza che mostra le espressioni dei marcatori Iba1 e GFAP con immagini unite." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: GFAP sagittale e immunofluorescenza Iba-1 dopo lesione. (A-C) All'aumentare del grado di lesione, aumenta l'area di risposta GFAP e Iba-1. Barra della scala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Analisi MRI della curvatura spinale confrontando casi di controllo, lievi e gravi a 7 dpi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65028/65028fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figura 9: Risonanza magnetica sagittale dopo lesione del midollo spinale cervicale (immagini pesate in T2). La regione della lesione è stata osservata come un segnale ipointenso nei gruppi con lesioni lievi e gravi, con un'area significativamente più ampia di segnale ipointenso nel gruppo con lesioni gravi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65028/65028fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'attuale protocollo che simula la sindrome del midollo centrale (CCS) nei topi ha migliorato la ripetibilità e ridotto al minimo i danni operativi agli animali da esperimento, evitando di interrompere eccessivamente la struttura anatomica. La strategia in questo studio è vantaggiosa perché consente la ricerca sui meccanismi di lesione producendo risultati coerenti.

Definizione del modello di sindrome del midollo centrale nel topo C57BL/6J

Animal models of central cord syndrome (CCS) could substantially benefit preclinical research. Identifiable anatomical pathways can give minimally ...

I modelli animali di sindrome del midollo centrale potrebbero successivamente beneficiare della ricerca preclinica. La strategia in questo studio è vantaggiosa perché ha permesso di studiare i meccanismi di lesione producendo risultati coerenti. L'attuale protocollo di simulazione della sindrome del midollo centrale nei topi ha migliorato la ripetibilità e ridotto al minimo il danno operativo nei confronti degli animali da esperimento.Evitando la rottura della loro struttura anatomica. Inizia organizzando gli strumenti chirurgici e la piattaforma coassiale per la lesione del midollo spinale. Una volta che il topo è stato adeguatamente anestetizzato, identifica la piccola sporgenza lungo la linea mediana dietro il collo dell'animale, che è il processo spinoso della seconda vertebra toracica, o T2. Radere i peli che circondano il processo spinoso T2 dietro il collo e disinfettare la pelle con tre cicli alternati di soluzione Iota 4 ed etanolo al 75%.Quindi, posizionare il mouse in posizione prona sul tavolo operatorio. Applicare un unguento per gli occhi per proteggere gli occhi. Posizionare un cuscinetto di 3-4 millimetri di spessore sotto il torace dell'animale per facilitare l'inarcamento della curva del rachide cervicale, che consente l'esposizione dello spazio interlaminare e anche un passaggio d'aria senza ostacoli durante l'intervento chirurgico.Successivamente, mentre lavori al microscopio, usa un bisturi per fare un'incisione longitudinale da 1 a 1,5 centimetri centrata sul processo spinoso T2 ed esponi lo strato fasciale. Con l'aiuto di micro forbici, rimuovere una porzione di tessuto adiposo al di sopra di T2 per esporre chiaramente il processo spinoso T2. Usando le microforbici, separa i muscoli trapezio bilaterale e romboide da C5 a T2 lungo la linea mediana.Quindi, separare i muscoli sulla lamina delle vertebre da C5 a T2 e utilizzare micro divaricatori per ritrarre lo strato muscolare ai lati. Tagliare i muscoli multifidi e spinali cervicali presenti sulla superficie delle vertebre. Localizzare la vertebra T2 identificando il punto più alto dei processi spinosi.Quindi, continuare a sondare i processi spinosi successivamente da T2, spostandosi verso l'estremità rostrale, fino a quando non si trova la sesta vertebra cervicale o C6. Usando una pinza, sollevare la lamina C6 per esporre il midollo spinale prima di tagliare la lamina. Clamp le faccette articolari da C6 a C7 con lo stabilizzatore vertebrale e bloccarlo.Allineare la punta del peso con il midollo spinale esposto, assicurandosi che la parte inferiore della punta sia parallela alla superficie dorsale del midollo spinale. Regolare la manica in modo che il peso comprima il midollo spinale. Interrompere la regolazione quando il peso mantiene una posizione relativa costante con il midollo spinale.Rimuovere il peso e lo stabilizzatore vertebrale dopo aver lasciato una compressione di cinque minuti. Al microscopio, osservare eventuali cambiamenti di colore del midollo spinale derivanti dalla compressione. Risciacquare il sito dell'operazione con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato.Successivamente, utilizzare l'aspirazione per pulire l'area. Suturare i muscoli e la pelle a strati utilizzando una sutura 6-0 in polipropilene non assorbibile. Dopo aver disinfettato l'area chirurgica, posizionare il mouse su un tappetino caldo fino a quando non riprende piena coscienza prima di rimetterlo nella sua gabbia.La colorazione con ematossilina ed eosina o H&E della sezione sagittale del midollo spinale ha suggerito che l'area danneggiata nella materia grigia era più ampia nel gruppo con lesioni gravi rispetto a quella nel gruppo con lesioni lievi. Le sezioni coronali di HE hanno mostrato che in entrambi i gruppi, la lesione esisteva principalmente nella materia grigia. Nel gruppo grave, sebbene la struttura della sostanza bianca che circonda la sostanza grigia fosse più colpita, il suo contorno è stato comunque mantenuto.La colorazione immunofluorescente ha anche rivelato che, sebbene la sostanza bianca che circonda la materia grigia fosse colpita nel gruppo grave, era ancora relativamente intatta. Non sono stati trovati globuli rossi nelle sezioni sagittali di HE a sette giorni dopo la lesione, sia nel gruppo lieve che in quello grave. La colorazione blu di Prussia ha rivelato l'emosiderosi solo nel gruppo grave.L'immunofluorescenza ha rivelato aree di elevata espressione di GFAP e Iba1 sia in lesioni lievi che gravi, suggerendo una risposta infiammatoria e la formazione di una cicatrice gliale. Inoltre, il gruppo grave ha mostrato un'area di lesione più ampia rispetto al gruppo lieve. La risonanza magnetica ha suggerito che in entrambi i gruppi c'era un cambiamento di segnale ipo intenso nella lesione con un contorno di segnale elevato.Il gruppo grave ha mostrato un'area di segnale ipo intenso significativamente più ampia. La rimozione dei tessuti molli davanti e dietro la lamina facilita il più possibile il rilassamento della lamina e il danneggiamento comprovato della campata tagliata durante il taglio parallelo. L'attuale volume di fase del protocollo modella la sindrome del midollo centrale e consente un'ulteriore comprensione ed esplorazione del segnale.

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