Assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo su chip per la bioingegneria

OLA è una piattaforma microfluidica versatile utile alla comunità della biologia sintetica. in particolare, per bioingegnerizzare le cellule artificiali. I liposomi basati su OLA possono aiutarci a comprendere i principi di auto-organizzazione in biologia e costruire assemblaggi che imitano le cellule.

OLA produce liposomi monodispersi, unilaminari, delle dimensioni di cellule in modo ad alta produttività e con un'eccellente efficienza di incapsulamento. Richiede volumi di campione molto piccoli, nell'ordine di 50 microlitri, e i liposomi formati sono immediatamente disponibili per ulteriori sperimentazioni su chip. L'OLA è utile per studiare le reazioni biologiche all'interno di microconfinamenti, la dinamica delle vescicole e i condensati biomolecolari e le loro interazioni con le membrane.

L'OLA è stato anche applicato come piattaforma ad alto rendimento per lo screening dei farmaci, ad esempio, per testare la permeabilità e l'attività membranica degli antimicrobici. La funzionalizzazione superficiale, che è il trattamento fotovoltaico, è un passaggio critico per il protocollo e deve essere eseguita con attenzione per evitare che la soluzione fotovoltaica entri nell'aquea interna e nei canali organici portatori di lipidi. Inoltre, il canale di post-produzione dovrebbe essere abbastanza lungo da consentire la separazione delle tasche di ottanolo per formare liposomi.

Ketan Ganar, uno studente di dottorato del mio laboratorio, aiuterà Chang Chen a dimostrare la procedura. Per iniziare, prendi un wafer di silicio pulito da quattro pollici di diametro e puliscilo ulteriormente usando aria pressurizzata per rimuovere eventuali particelle di polvere. Montare il wafer su un rivestimento a rotazione e erogare delicatamente circa cinque millilitri di un fotoresist negativo al centro del wafer.

Per ottenere uno strato fotoresist spesso 10 micrometri, impostare le impostazioni dello spin coat a 500 RPM per 30 secondi con un'accelerazione di 100 RRP al secondo per la diffusione iniziale, seguita da una rotazione di 60 secondi a 3.000 RPM con un'accelerazione di 500 RPM al secondo. Quindi, girare rivestire il wafer. Cuocere il wafer su una piastra riscaldante per due minuti a 65 gradi Celsius, e poi per cinque minuti a 95 gradi Celsius.

Una volta che il wafer si raffredda, montare il wafer nella camera di stampa della macchina di litografia ottica destra diretta e inserire il gruppo liposomico assistito da ottanolo o il design OLA, nel software. Una volta stampato il disegno, cuocere il wafer a 65 gradi Celsius per un minuto, seguito da 95 gradi Celsius per tre minuti. Per lavare via il fotoresist non polimerizzato, immergere il wafer in un becher di vetro contenente la soluzione di sviluppo fino a quando il fotoresist non polimerizzato non viene completamente rimosso.

Cuocere duramente il wafer a 150 gradi Celsius per 30 minuti per assicurarsi che il disegno stampato sia saldamente fissato alla superficie del wafer e non si stacchi nel processo di fabbricazione a valle. Per preparare il dispositivo microfluidico, posizionare il wafer master su un pezzo quadrato di alluminio e avvolgere il foglio di alluminio attorno al wafer, formando una struttura ben simile. Versare delicatamente la miscela PDMS sul wafer master.

Incubare l'assemblaggio in forno a 70 gradi Celsius per almeno due ore. Togliere la cialda master dal forno e lasciarla raffreddare. Per rimuovere il polidimetilsilossano solidificato, o blocco PDMS, rimuovere il foglio di alluminio e quindi staccare con cura il blocco PDMS dal bordo del wafer.

Prendere un vetrino di vetro trasparente, versare circa 0,5 millilitri di PDMS sul centro del vetrino e distribuirlo sul vetrino inclinando delicatamente il vetrino, assicurando una copertura totale del vetrino con il PDMS. Montare il vetrino sul rivestimento a rotazione. Assicurarsi che sia posizionato centralmente in modo che il centro della slitta si sovrapponga al centro dell'albero di pressione.

Quindi ruotare il vetrino a 500 RPM per 15 secondi con un incremento di 100 RPM al secondo e 1.000 RPM per 30 secondi con un incremento di 500 RPM al secondo. Posizionare il vetrino rivestito PDM con il lato rivestito rivolto verso l'alto su una piattaforma rialzata come un blocco di PDMS in una capsula di Petri coperta. Cuocere a 70 gradi Celsius per due ore.

Posizionare il blocco PDMS con i canali incisi rivolti verso l'alto e il vetrino rivestito PDM con il lato rivestito rivolto verso l'alto nella camera a vuoto dell'aspirapolvere. Accendere il vuoto ed esporre il contenuto al plasma dell'aria ad una frequenza radio di 12 megahertz per 15 secondi per attivare le superfici. Il plasma di ossigeno può essere visto sotto forma di una tonalità rosata.

Immediatamente dopo il trattamento al plasma, posizionare il vetrino rivestito PDMS su una superficie pulita con il lato PDMS rivolto verso l'alto. Posizionare delicatamente il blocco PDMS con il motivo microfluidico ora rivolto verso il vetrino rivestito PDMS, consentendo loro di incollarsi. Cuocere i dispositivi incollati a 70 gradi Celsius per due ore.

Erogare 200 microlitri di alcool polivinilico al 5%, o soluzione OVA, in un tubo da 1,5 millilitri e collegarlo al supporto del serbatoio microfluidico. Inserire il tubo in modo tale che un'estremità sia immersa nella soluzione PVA e l'altra estremità sia collegata all'ingresso del canale acquoso esterno del dispositivo microfluidico. Aumentare la pressione della fase acquosa esterna a 100 millibar per far fluire la soluzione PVA nei canali acquosi esterni.

Aumentare le pressioni delle fasi organiche interne acquose e che trasportano lipidi a 120 millibar per impedire il riflusso della soluzione di PVA all'interno di questi canali. Far scorrere la soluzione PVA in questo modo per circa cinque minuti, garantendo la completa funzionalizzazione del canale di uscita. Aumentare la pressione nei canali acquosi organici e interni che trasportano lipidi a due bar per rimuovere la soluzione di PVA e staccare immediatamente il tubo dall'ingresso acquoso esterno.

Contemporaneamente, utilizzare un tubo collegato a un canale a pressione negativa per rimuovere il PVA in eccesso dal canale di uscita. Cuocere il dispositivo a 120 gradi Celsius per 15 minuti e lasciarlo raffreddare prima dell'uso. Il dispositivo può essere conservato in condizioni ambientali per almeno un mese.

Erogare le soluzioni in tre tubi da 1,5 millilitri e assemblarli. Collegarli al chip microfluidico trattato con PVA e applicare una pressione positiva sui tre canali, circa 100 millibar sui canali organici interni acquosi e portatori di lipidi e circa 200 millibar sul canale acquoso esterno. Una volta che tutte e tre le fasi iniziano a co-fluire alla giunzione, assicurarsi che inizi la produzione di doppia emulsione e regolare la pressione in base alla sua qualità.

Mentre le goccioline della doppia emulsione fluiscono, l'ottanolo tutte le tasche diventano sempre più prominenti e alla fine vengono pizzicate, formando liposomi. Qui viene mostrata un'immagine a campo chiaro della rapida generazione di goccioline di doppia emulsione. Il canale lipidico fluorescente mostra la formazione di un ottanolo in tutte le tasche a causa della parziale de-bagnatura.

Il canale acquoso interno mostra l'incapsulamento della proteina fluorescente gialla. La deumidificazione della tasca ottanolica nel canale di uscita che forma un liposoma è mostrata in questa figura. Questa immagine rappresenta lo schema della transizione pH-dipendente della soluzione omogenea di polilisina e ATP incapsulata all'interno del liposoma a coacervati di ATP polilisina separati in fase.

L'ambiente acido iniziale nel liposoma rende la carica molecolare di ATP neutra, inibendo la coacervazione. Quando il pH all'interno dei liposomi si equilibra con l'aumento del pH applicato esternamente, l'ATP guadagna una carica negativa, innescando la coacervazione. La distribuzione spaziale della polilisina e della membrana e le immagini time lapse della formazione di coacervati di ATP polilisina all'interno dei liposomi sono mostrati in questa figura.

L'edizione esterna di un tampone basico aumenta il livello di pH all'interno dei liposomi nel corso di minuti e avvia la coacervazione. T uguale a zero minuti si riferisce al tempo appena prima del verificarsi del primo evento di coacervazione. Durante la dimostrazione della procedura, è fondamentale regolare pazientemente la pressione del canale per generare una produzione costante di doppia emulsione.

L'OLA e le sue variazioni sono state impiegate in diversi studi, ad esempio la crescita e la divisione dei liposomi comprendendo la dinamica dei condensati biomolecolari, l'espressione delle proteine senza cellule e l'incapsulamento dei batteri. Quindi, in contussione, crediamo che OLA sia una piattaforma versatile per la biologia sintetica.