Istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana

Con organoidi della ghiandola lacrimale, si può esaminare come alcuni geni controllano l'omeostasi della ghiandola lacrimale. Inoltre, gli organoidi possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Il principale vantaggio della tecnologia organoide della ghiandola lacrimale derivata dalle cellule staminali adulte è che consente la crescita e lo studio di cellule epiteliali della ghiandola lacrimale sane e non trasformate.

Questi organoidi potrebbero eventualmente essere usati per trattare i pazienti con malattia dell'occhio secco. Inizia preparando il mezzo e il materiale necessari per l'esperimento, seguito dalla combinazione di tutti i componenti del mezzo di digestione prima dell'esperimento. Pre-bagnare i bisturi in questo mezzo per evitare che i pezzi di tessuto si attacchino a loro.

Recuperare il tessuto della ghiandola lacrimale del topo dal mezzo, posizionarlo nella capsula di Petri e tritarlo usando bisturi pre-bagnati. Una volta che i pezzi di tessuto sono inferiori a 0,5 millimetri cubici, raschiarli dalla capsula di Petri con il bisturi e trasferirli in un tubo da 15 millilitri contenente il mezzo di digestione. Per una biopsia umana molto piccola, posizionarla direttamente nel mezzo di digestione senza tritare.

Incubare il tubo da 15 millilitri con pezzi di tessuto per un massimo di 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, restringere la punta di una pipetta Pasteur in una fiamma e pre-bagnarla nel mezzo di base. Per facilitare il processo di dissociazione, pipettare la miscela tritata su e giù ogni cinque minuti con la pipetta Pasteur pre-bagnata e ristretta.

Quando molte cellule singole e piccoli grumi sono visibili al microscopio, interrompere la dissociazione aggiungendo 10 millilitri del mezzo di base. Dopo aver girato a 400 g per cinque minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri del mezzo di base per ripetere il lavaggio e pellet lungo le cellule. Rimuovere i grandi pezzi di tessuto non digeriti e le restanti fibre di collagene filtrando la miscela tritata attraverso un colino da 70 micrometri.

Girare l'eluato a 400g per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di matrice extracellulare fredda, o ECM, per una singola ghiandola lacrimale di topo e 50 microlitri di ECM fredda per una biopsia umana, senza creare le bolle. Seminare fino a 100 microlitri di cellule per pozzetto di una piastra di sospensione a 12 pozzetti usando un P200 per produrre circa 20 microlitri di goccioline nel pozzetto.

Posizionare la piastra capovolta in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti per consentire la solidificazione ECM. Una volta che l'ECM è solidificato, aggiungere circa un millilitro di mezzo di espansione del mouse a temperatura ambiente per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Preparare appena un millilitro di mezzo di differenziazione umana contenente singoli componenti che inducono la secrezione da parte degli organoidi della ghiandola lacrimale.

In un microscopio time-lapse a campo chiaro automatizzato, impostare le posizioni da visualizzare nella lastra, l'intervallo di tempo di cinque minuti e la durata di quattro ore. Assicurati che un'intera goccia ECM sia visibile in ogni posizione. Prima di iniziare a visualizzare l'immagine, rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti da riprendere senza spostare la piastra dal microscopio e sostituirlo con il mezzo di differenziazione umana appena preparato e ben sospeso contenente composti, tra cui forskolina e noradrenalina.

Come controllo negativo, includere un pozzo con mezzo di differenziazione rinfrescato. Fare clic sul pulsante Esegui sul microscopio e analizzare i risultati dopo quattro ore. Dopo aver dissociato gli organoidi come menzionato nel testo, scartare il surnatante.

Risospendere le cellule in 80 microlitri del tampone di elettroporazione. In un tubo da 1,5 millilitri, preparare i plasmidi necessari per l'esperimento. Aggiungere i plasmidi alle cellule e mescolare bene pipettando su e giù.

Impostare l'elettroporatore con i parametri per l'impulso di poring e l'impulso di trasferimento. Posizionare le cellule con i plasmidi in una cuvetta di elettroporazione. Misurare immediatamente la resistenza, che dovrebbe essere compresa tra 0,3 ampere e 0,55 ampere, ed elettropolare immediatamente.

Una volta fatto, trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 400 microlitri di tampone per elettroporazione integrato con un inibitore della Rho-chinasi. Lasciare che le cellule si riprendano a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, pellettare le cellule a 500 g per cinque minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, placcare le cellule in 200 microlitri di ECM. Dopo la solidificazione, aggiungere il mezzo di espansione del mouse. Per la preparazione degli organoidi, dividere gli organoidi della ghiandola lacrimale umana circa tre giorni prima del giorno del trapianto.

Per estrarre gli organoidi dall'ECM, aggiungere dispase al terreno di coltura per raggiungere una concentrazione finale di 0,125 unità per millilitro e risospendere completamente le goccioline ECM per interromperle usando un P1000. Riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Risospendere gli organoidi in 10 millilitri di terreno base per lavare l'enzima.

Dopo aver pellettato le cellule a 400g per cinque minuti, risospenderle in 50 microlitri di mezzo di espansione umano freddo integrato con ECM al 5%. Posizionare la sospensione organoide sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto. Per il trapianto ortotopico nei topi, aspirare la sospensione organoide in un ago da insulina.

Quando il topo dorme, posizionalo rapidamente su un fianco con la ghiandola lacrimal principale accessibile. Iniettare cinque microlitri della sospensione organoide direttamente attraverso la pelle nella ghiandola lacrimale. Consentire al topo di recuperare e valutare quotidianamente la presenza di qualsiasi disagio correlato al trapianto, specialmente negli occhi.

In seguito alla dissezione della ghiandola lacrimale del topo, la digestione enzimatica e meccanica ha generato piccoli frammenti di tessuto, compresi gli acini e i dotti. Nella riuscita derivazione organoide della ghiandola lacrimale del topo, dopo sette giorni sono stati trovati organoidi cistici di circa 500 micrometri di diametro. Gli organoidi della ghiandola lacrimale umana sono cresciuti come cisti entro tre o quattro giorni e hanno raggiunto una dimensione adulta in 10-14 giorni dopo l'isolamento dei tessuti.

Dopo cinque giorni e sette giorni, rispettivamente, nel mezzo di differenziazione, gli organoidi della ghiandola lacrimale del topo e dell'uomo sono diventati più densi. L'applicazione dell'attivatore ciclico AMP forskolin o del neurotrasmettitore noradrenalina ha provocato gonfiore organoide in meno di tre ore. Nell'elettroporazione di successo, sono cresciuti organoidi resistenti all'igromicina.

I cloni organoidi in crescita più grandi di 300 micrometri sono stati raccolti prima della loro differenziazione. L'amplificazione PCR del locus Pax6 bersagliato dall'RNA guida ha prodotto una banda di 367 coppie di basi per tutti i cloni selezionati. Un clone omozigote della ghiandola lacrimale di topo knockout su sei sequenziati è stato ottenuto utilizzando l'RNA guida mirato a Pax6.

Alcuni cloni sono cresciuti bene, ma alcuni cloni organoidi sono stati persi dopo la raccolta o hanno iniziato a differenziarsi. Dei 10 cloni organoidi scelti, sette sono cresciuti bene. L'attecchimento organoide è stato confermato un mese dopo l'iniezione degli organoidi nella ghiandola lacrimale del topo mediante colorazione per un marcatore specifico umano, l'antigene nucleolare umano.

Una cosa a cui prestare attenzione è non digerire eccessivamente il tessuto, né gli organoidi. Altrimenti, le cellule potrebbero morire e questo ridurrebbe il tasso di insediamento degli organoidi. Gli organoidi delle ghiandole lacrimali possono essere analizzati mediante istologia.

In questo modo, si può ottenere informazioni sulla loro composizione cellulare.