Name: Istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri come stabilire, mantenere e differenziare organoidi di ghiandola lacrimale di topo e umani. Questo metodo consente di studiare l'omeostasi e applicazioni in medicina rigenerativa.

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Ringraziamo Yorick Post per lo sviluppo iniziale del protocollo. Questo lavoro è stato in parte supportato da un premio del Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) e della Mark Foundation for Cancer Research al team SPECIFICANCER.

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
<li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

Hans Clevers è il capo della ricerca farmaceutica e dello sviluppo precoce presso Roche, Basilea, e detiene diversi brevetti relativi alla tecnologia degli organoidi.

Questo protocollo descrive la creazione e l'uso di organoidi della ghiandola lacrimale per saggi funzionali, modelli di mutazione e trapianto. Quando si stabiliscono organoidi di ghiandola lacrimale di topo e umana, la dissociazione dei tessuti è cruciale. Se il tessuto non è sufficientemente digerito, la resa organoide sarà bassa. Se il tessuto è sovra-digerito, le cellule moriranno e non cresceranno come organoidi. Ogni tessuto deve essere digerito con un enzima specifico per un tempo specifico per garantire una crescita organoide ottimale14,17,18. La ghiandola lacrimale è un tessuto piuttosto morbido per il quale una digestione della collagenasi di 5-10 minuti combinata con la dissociazione meccanica basata sul pipettaggio è sufficiente per isolare piccoli pezzi di tessuto. Se è necessario ottenere singole cellule per applicazioni come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, la dissociazione può essere effettuata più a lungo fino al raggiungimento dello stadio di singola cellula, ma la dissociazione deve essere interrotta non appena si ottengono singole cellule per limitare qualsiasi diminuzione della vitalità. Poiché la dissociazione tissutale è così cruciale, l'eccessiva digestione è la ragione più probabile per il fallimento dell'istituzione organoide della ghiandola lacrimale.
Il mantenimento appropriato degli organoidi della ghiandola lacrimale è importante per il loro uso. Il mantenimento a lungo termine è un segno distintivo degli organoidi delle ghiandole lacrimali derivati da cellule staminali adulte, rispetto agli organoidi indotti derivati da cellule staminali pluripotenti 7,17. Per ottenere una manutenzione a lungo termine, è necessario eseguire una regolare scissione degli organoidi e cambiamenti del mezzo. Senza questo, gli organoidi iniziano a differenziarsi e sviluppare un ridotto potenziale delle cellule staminali, che ostacola il loro mantenimento a lungo termine7. Anche in questa fase, l'eccessiva digestione può uccidere le cellule staminali e compromettere il mantenimento degli organoidi. Per una manutenzione regolare, non è richiesta la dissociazione degli organoidi in singole cellule. Tuttavia, per generare linee organoidi knock-out clonali, è fondamentale iniziare con singole cellule. In caso contrario, gli organoidi saranno costituiti da un mosaico di cellule con diversi background genetici, rendendo impossibile analizzare l'effetto di una singola mutazione definita. Qui, descriviamo l'uso di un editor di base C > T per generare codoni di stop. Questo editor del genoma si basa sulla presenza di codoni di arginina, glutammina o triptofano entro 12-18 basi da un NGG PAM. Quando queste condizioni non sono soddisfatte nella progettazione di un gRNA, è possibile utilizzare editor di base Cas9 o C >T convenzionali con PAM alternativi 7,18. Tuttavia, il Cas9 convenzionale introduce rotture a doppio filamento che provocano indels in caso di riparazione11. Poiché entrambi gli alleli possono ospitare indels diversi, la genotipizzazione del clone richiede ulteriore cautela. La deconvoluzione delle modifiche introdotte deve essere eseguita per garantire che entrambi gli alleli contengano indels out-of-frame e, quindi, che i cloni organoidi siano eliminati per il gene bersaglio19. Il vantaggio degli editor di base C > T risiede nel fatto che possono essere utilizzati per modellare mutazioni puntiformi che non necessariamente si traducono in codoni di stop. Ad esempio, possono essere utilizzati per modellare specifiche mutazioni di Pax6 riscontrate in pazienti con aniridia per studiare il loro impatto sulla fisiologia della ghiandola lacrimale20.
La ghiandola lacrimale secerne la parte acquosa del film lacrimale1. La secrezione lacrimale può essere ricapitolata negli organoidi umani dopo differenziazione mediata dal ritiro del fattore di crescita e dall'inibizione di NOTCH. In queste condizioni, gli organoidi subiscono una differenziazione terminale e non possono essere ulteriormente mantenuti. Tuttavia, gli organoidi differenziati della ghiandola lacrimale possono guidare lo sviluppo di farmaci che inducono la lacrimazione nel contesto della malattia dell'occhio secco, potenzialmente in screening ad alto rendimento. Il test di lacerazione presentato in questo protocollo è quello che attualmente dà il più grande cambiamento nella dimensione dell'organoide in un breve lasso di tempo, il che rende più facile quantificare nel contesto di uno screening farmacologico 7,9,17.
La terapia con cellule staminali è molto promettente per la rigenerazione della ghiandola lacrimale nella malattia dell'occhio secco21. Gli organoidi della ghiandola lacrimale derivati dalle cellule staminali adulte potrebbero essere un materiale di partenza per tali applicazioni. Il protocollo qui presentato si traduce nell'attecchimento organoide della ghiandola lacrimale umana, principalmente come cisti. Un basso attecchimento di organoidi può verificarsi a causa di organoidi iniettati nel sito sbagliato. L'addestramento della procedura di iniezione con un colorante consente il monitoraggio del sito di iniezione e, in definitiva, migliora la precisione dell'iniezione. In alternativa, l'epidermide del topo può essere incisa per avere accesso diretto alla ghiandola lacrimale, come fatto nei ratti prima dei22 anni. Questo metodo richiede più tempo, ma potrebbe essere più accurato. D'altra parte, con il presente protocollo, gli organoidi non si sono integrati funzionalmente nella ghiandola lacrimale del topo. Risultati simili sono stati osservati per l'attecchimento della ghiandola lacrimale derivato da iPSC22. Il metodo di trapianto potrebbe essere ulteriormente migliorato ferendo in anticipo la ghiandola lacrimale, utilizzando un modello murino di occhio secco e / o iniettando gli organoidi come singole cellule o piccoli grumi. Tuttavia, gli organoidi delle ghiandole lacrimali derivati dalle cellule staminali adulte e il relativo toolkit possono essere la base di future applicazioni nella ricerca sulle ghiandole lacrimali e nella medicina rigenerativa.

La ghiandola lacrimale è l'epitelio ghiandolare responsabile della produzione della maggior parte dello strato acquoso del film lacrimale1. Lo strato acquoso del film lacrimale non contiene solo acqua per lubrificare la superficie oculare, ma anche un ampio repertorio di componenti antimicrobici che proteggono la superficie oculare dalle infezioni2. Quando la ghiandola lacrimale è danneggiata o infiammata, si verifica la malattia dell'occhio secco, che si traduce in disagio per i pazienti e può eventualmente portare alla perdita della vista3. Nel corso degli anni, i sistemi modello per studiare la ghiandola lacrimale, in particolare la ghiandola umana, sono stati limitati 4,5,6. Ciò ha contribuito a una lacuna di conoscenza per quanto riguarda la funzione della ghiandola lacrimale in condizioni fisiologiche e patologiche.
Recentemente, sono stati sviluppati modelli in vitro per studiare la ghiandola lacrimale in un piatto 7,8,9. Questi organoidi della ghiandola lacrimale derivano da cellule staminali adulte cresciute come strutture tridimensionali in una matrice extracellulare integrata con un cocktail di fattori di crescita che sostiene le loro capacità rigenerative in vitro7. Il vantaggio degli organoidi derivati dalle cellule staminali adulte (ASC) è che possono essere mantenuti per un tempo molto lungo ricapitolando le caratteristiche del tessuto sano. Questo tipo di organoide consiste esclusivamente di cellule epiteliali, a differenza degli organoidi derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che possono anche contenere cellule stromali, per esempio. A differenza degli organoidi derivati dalle cellule staminali pluripotenti (PSC), gli organoidi ASC sono stabiliti direttamente dal tessuto adulto e non richiedono alcuna modifica genetica per essere espansi. Gli organoidi ASC esprimono caratteristiche adulte10.
Questo protocollo contiene una cassetta degli attrezzi per derivare organoidi della ghiandola lacrimale dal topo e dal tessuto primario umano. Il protocollo descrive come migliorare ulteriormente la funzionalità degli organoidi con un semplice prelievo del fattore di crescita e come provocare gli organoidi a secernere liquido lacrimale eseguendo un test di gonfiore. Questo protocollo include inoltre un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione per ingegnerizzare geneticamente organoidi di topo utilizzando editor di base derivati da CRISPR. A differenza del Cas9 convenzionale, l'uso di editor di basi consente la modifica di singole basi nel genoma senza generare una rottura a doppio filamento11,12. Infine, viene descritto il trapianto ortotopico di organoidi della ghiandola lacrimale umana in topi immunodeficienti e la successiva valutazione istologica dell'attecchimento. Questo toolkit organoide della ghiandola lacrimale può essere utilizzato nella ricerca sulla rigenerazione e la funzione della ghiandola lacrimale e per la modellazione di malattie genetiche e infiammatorie.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidina tetracloridrato idrato (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9 , ATTENZIONE, la soluzione da 6 g/L può essere conservata aliquotata a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>5x tampone GoTaq Flexi verde</td><td>Promega</td><td>M891A</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Negozio a -20 C, stock a 30 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Piastre di agar contenenti Ampicillina</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td><td>VWR prodotti chimici</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Conservare a -20 &deg; C, 50x</td></tr><tr><td>BD Ago da insulina Micro-Fine 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da banco DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>MP biomedicals</td><td>160069</td><td>Conservare a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX MDS450805</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cassette</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>Mezzo di crioconservazione, attenersi alle istruzioni</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS: 5949-29-1</td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9407</td><td>Aliquote a 20 mg/mL, 20x, conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Provette coniche 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche 50 mL</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di membrana basale Cultrex (BME), fattore di crescita ridotto, tipo 2 - matrice extracellulare</td><td>R& D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>Negozio a -20 &deg; C, tenere a 4 gradi C per un massimo di 1 mese</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>Negozio a -20 &deg; C, stock a 10 mM, 1000x</td></tr><tr><td>Idrogeno fosfato anidro disodico</td><td>VWR prodotti chimici</td><td>28026.292</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Di-sodioidrogenofosfato diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS:10028-24-7</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>Aliquote a 50 U/mL, conservare a -20 &deg; C fino all'uso, 400x</td></tr><tr><td>bisturi monouso sterile N&deg; 10</td><td>Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio DM4000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>Mescolare tutti e 4 i nucleotidi insieme, conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>Filtri facili 70 & micro; m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP mouse</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206; 5000</td><td>ATTENZIONE, Utilizzare per preparare altre diluizioni di etanolo</td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>ATTENZIONE</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Microscrope in campo chiaro per immagini dal vivo</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Conservare a -20 &deg; C, stock a 100 mg/mL in terreno di base, 100x</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH, Fiji sviluppatori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>CAS: 50-00-0, ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>Conservare a -20 &deg; C, stock a 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>VWR prodotti chimici</td><td>10047105</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Conservare a 4 gradi C, 100x</td></tr><tr><td>Histocore H e C, Macchina per l'inclusione dei tessuti</td><td>Leica</td> Piastra riscaldante Meidax <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo antigene nucleolare umano</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0, ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 30%</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS: 7722-84-1, ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Igromicina B-gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>Stock a 100 mg/&micro; L, 1000x</td></tr><tr>Plasmide <td></td><td></td><td>contenente cassetta di resistenza all'igromicina</td><td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>Conservare a -20 &deg; </td></tr><tr><td>C Microtomo RM2235</td><td>Kit</td> di isolamento del DNA Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento del DNA Miniprep</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>K210003</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Conservare a -20 &deg; C, stock a 500 mM,</td></tr><tr><td>elettroporatore NEPA21</td> 400x <td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Negozio a -20 &deg; C, stock a 1M, 100x</td></tr><tr><td>NOD Scid Gamma (NSG) topi</td><td>Hubrecht Institute colonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noggin condizionato mezzo</td><td>U-Protein Express</td><td>Negozio di ordini personalizzati</td><td>a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Noradrenaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7257</td><td>Negozio a -20 C, stock a 100 mM</td></tr><tr><td>Set</td><td>di memmert</td><td></td><td>da forno a 58 &deg; C</td></tr><tr><td>Pipette P20, P200 e P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>VWR prodotti chimici</td><td>10048502</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur, tappo di vetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Pertex</td><td>Klinipath</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X, conservare a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Prostaglandina E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>Conservare a -20 &deg; C, stock a 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>piastra di Petri, 10 cm</td><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>tampone Q5</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract Soluzione di estrazione del DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>Aliquote del negozio a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>R-spondina 3 mezzo condizionato</td><td>U-Protein Express</td><td>Ordine personalizzato</td><td>Negozio a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTTTTTCGTCCTTTCCAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>Adesivo, macinato</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS: 26628-22-8, ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS: 6132-04-3</td></tr><tr><td>Standard Forward Primer: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Efficienza di subclonazione cellule competenti DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari in sospensione (24 pozzetti)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 pozzetti</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari in sospensione (12 pozzetti)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12 pozzetti</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TAE tampone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>Stock a 50x, diluire a 1x con acqua ultrapura</td></tr><tr><td>Plasmide</td><td></td><td></td> contenente trasposisi <td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>conservare a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7, ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Conservare a -20 &deg; C, stock a 10 mM, 1000x</td></tr></tbody></table>

istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

La ghiandola lacrimale è un organo essenziale per l'omeostasi della superficie oculare. Producendo la parte acquosa del film lacrimale, protegge l'occhio dallo stress da essiccazione e insulti esterni. Poco si sa sulla (patofisiologia della ghiandola lacrimale) a causa della mancanza di adeguati modelli in vitro . La tecnologia degli organoidi si è dimostrata un'utile piattaforma sperimentale per più organi. Qui, condividiamo un protocollo per stabilire e mantenere organoidi di ghiandola lacrimale di topo e umana a partire dalle biopsie delle ghiandole lacrimali. Modificando le condizioni di coltura, miglioriamo la funzionalità organoide della ghiandola lacrimale. La funzionalità organoide può essere sondata attraverso un test "piangente", che comporta l'esposizione degli organoidi della ghiandola lacrimale a neurotrasmettitori selezionati per innescare il rilascio lacrimale nel loro lume. Spieghiamo come immaginare e quantificare questo fenomeno. Per studiare il ruolo dei geni di interesse nell'omeostasi della ghiandola lacrimale, questi possono essere geneticamente modificati. Descriviamo accuratamente come modificare geneticamente gli organoidi della ghiandola lacrimale usando editor di base, dalla progettazione dell'RNA guida alla genotipizzazione del clone organoide. Infine, mostriamo come sondare il potenziale rigenerativo degli organoidi della ghiandola lacrimale umana mediante impianto ortotopico nel topo. Insieme, questo set di strumenti completo fornisce risorse per utilizzare organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana per studiare la (patofisiologia) della ghiandola lacrimale.

In seguito alla dissezione della ghiandola lacrimale di topo (Figura 2A), la digestione enzimatica e meccanica ha generato piccoli frammenti di tessuto, tra i quali si potevano distinguere gli acini e i dotti (Figura 2B). I restanti grandi pezzi di tessuto destabilizzerebbero l'ECM, il che ridurrebbe la crescita iniziale degli organoidi. La derivazione dell'organoide della ghiandola lacrimale di topo ha avuto successo quando organoidi cistici di ~ 500 μm di diametro sono stati trovati dopo ~ 7 giorni, lo stadio in cui gli organoidi erano pronti per essere divisi (Figura 2C). Anche se la derivazione complessiva degli organoidi ha successo, alcuni organoidi possono iniziare a crescere prima di fermarsi alla fine. Gli organoidi della ghiandola lacrimale umana sono cresciuti come cisti entro 3-4 giorni e hanno raggiunto dimensioni adulte in 10-14 giorni dopo l'isolamento dei tessuti (Figura 2D). Sia per i topi che per gli esseri umani, la derivazione degli organoidi a volte falliva, con nessun o pochi organoidi che crescevano; Ciò è stato generalmente causato da un'eccessiva digestione del tessuto. Gli organoidi della ghiandola lacrimale del topo potrebbero essere fatti passare almeno 40 volte e gli organoidi umani almeno 20 volte. Il passaging è stato fatto in media ogni 7-10 giorni, a seconda della crescita organoide.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figura 2: Costituzione di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana. (A) Fotografie delle diverse fasi della dissezione della ghiandola lacrimale del topo. La freccia punta alla ghiandola lacrimale sotto la sua membrana protettiva. (B) Immagini in campo chiaro delle cellule della ghiandola lacrimale del topo subito dopo la digestione dei tessuti, con inserti che mostrano un acino e un condotto. (C) Immagini in campo chiaro di una derivazione organoide della ghiandola lacrimale di topo riuscita e non riuscita. (D) Immagini in campo chiaro dell'escrescenza di organoidi umani nel corso di 14 giorni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Gli organoidi della ghiandola lacrimale contengono una grande percentuale di cellule staminali quando coltivate nel mezzo di espansione. Per aumentare il loro livello di differenziazione, abbiamo impostato un topo e un mezzo di differenziazione umano con un contenuto di fattori di crescita ridotto. Dopo 5 giorni e 7 giorni, rispettivamente, nel mezzo di differenziazione, gli organoidi della ghiandola lacrimale del topo e dell'uomo sono diventati più densi (Figura 3A-B). Questo cambiamento morfologico è correlato con un aumento delle proprietà funzionali. L'applicazione dell'attivatore ciclico AMP forskolin o del neurotrasmettitore noradrenalina ha provocato gonfiore organoide (cioè secrezione acquosa apicale) in meno di 3 ore (Figura 3C). Quando il gonfiore ha richiesto più di 3-4 ore, questo ha suggerito che gli organoidi non erano abbastanza differenziati e / o non esprimevano marcatori funzionali, come i recettori per i neurotrasmettitori.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figura 3: Differenziazione degli organoidi delle ghiandole lacrimali di topo e umane e saggio di gonfiore funzionale negli organoidi umani. (A) Immagini in campo chiaro di organoidi della ghiandola lacrimale di topo coltivati in terreno di espansione per 7 giorni e in terreno di differenziazione per 5 giorni dopo 2 giorni in mezzo di espansione. (B) Immagini in campo chiaro di organoidi umani della ghiandola lacrimale coltivati in terreno di espansione per 11 giorni e in terreno di differenziazione per 9 giorni dopo 2 giorni in terreno di dilatazione. (C) Immagini in campo chiaro di organoidi differenziati della ghiandola lacrimale umana esposti a un nuovo mezzo di differenziazione (controllo), a 1 μM di forskolina e a 100 μM di noradrenalina nel corso di 3 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Per eliminare Pax6 negli organoidi della ghiandola lacrimale di topo, un plasmide contenente il gRNA scelto per Pax6 è stato generato mediante PCR e legatura (Figura 4A). Questo plasmide contenente gRNA è stato elettropolato insieme ai plasmidi Piggy-Bac (plasmidi contenenti trasposoni e trasposasi di resistenza all'igromicina) e all'editor di base C &gt; T Cas9 negli organoidi della ghiandola lacrimale di topo dissociati in singole cellule. Dopo 3 giorni, quando gli organoidi si erano ripresi, sono stati esposti all'igromicina per selezionare i cloni che avevano incorporato la cassetta di resistenza all'igromicina. Nelle elettroporazioni di successo, sono cresciuti organoidi resistenti all'igromicina (Figura 4B). Sono stati raccolti i cloni organoidi in crescita che erano più grandi di ~ 300 μm, idealmente prima che iniziassero a differenziarsi spontaneamente (Figura 4C). Il DNA è stato estratto da una parte dell'organoide mantenendo il resto in coltura. L'amplificazione PCR del locus Pax6 bersaglio del gRNA ha prodotto una banda di 367 bp per ciascuno dei cloni scelti (Figura 4D). Dopo aver sequenziato il locus amplificato, sono stati mantenuti cloni che erano omozigosi C &gt; T modificati (n = 1). D'altra parte, i cloni che non sono stati modificati (n = 4), modificati in modo eterozige o modificati erroneamente (n = 1) sono stati scartati (Figura 4E). Complessivamente, utilizzando questo gRNA mirato a Pax6, è stato ottenuto un clone omozigote della ghiandola lacrimale di topo knock-out su sei sequenziati. Alcuni cloni sono cresciuti bene, ma alcuni cloni organoidi sono andati persi dopo la raccolta o hanno iniziato a differenziarsi (Figura 4F). Dei 10 cloni organoidi scelti, 7 sono cresciuti bene.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figura 4: Knock-out mediato dall'editing di base di Pax6 negli organoidi della ghiandola lacrimale di topo. (A) Traccia di sequenziamento Sanger di pFYF1320 dopo corretta integrazione del gRNA che ha come bersaglio il locus Pax6. (B) Immagini in campo chiaro di organoidi della ghiandola lacrimale di topo 5 giorni dopo l'esposizione all'igromicina dopo elettroporazione. Gli organoidi sono stati coltivati in mezzo di espansione del topo. A sinistra c'è un esempio di elettroporazione fallita, con nessun clone resistente all'igromicina che cresce. Sulla destra c'è un esempio di elettroporazione riuscita, con diversi cloni organoidi resistenti all'igromicina sopravvissuti. (C) Immagini in campo chiaro di cloni che dovrebbero essere scelti e cloni che non dovrebbero essere scelti. (D) Gel di agarosio che mostra l'amplificazione del locus Pax6 bersaglio con il gRNA. In verde, viene evidenziata la banda della dimensione prevista di 367 bp. (E) Traccia di sequenziamento Sanger di tre cloni organoidi resistenti all'igromicina. Il clone superiore non è stato modificato. Il clone centrale è un'edizione C &gt; T omozigote e, quindi, un knock-out omozigote. Il clone inferiore presenta due mutazioni puntiformi eterozigoti ed è un knock-out eterozigote o un clone misto ed è stato modificato erroneamente. (F) Immagini in campo chiaro dei cloni organoidi scelti con vari livelli di escrescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Infine, per eseguire il trapianto ortotopico di organoidi della ghiandola lacrimale umana nei topi, sono stati utilizzati organoidi che sono stati divisi con 3 giorni di anticipo (&lt; 100 μm di diametro). L'attecchimento organoide è stato confermato 1 mese dopo l'iniezione degli organoidi nella ghiandola lacrimale del topo mediante colorazione per un marcatore specifico umano, l'antigene nucleolare umano (Figura 5). L'assenza di colorazione punteggiata da tutte le sezioni della ghiandola lacrimale del topo significava una mancanza di attecchimento organoide umano.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figura 5: Trapianto di organoidi della ghiandola lacrimale umana nella ghiandola lacrimale del topo. Colorazione delle ghiandole lacrimali di topo trapiantate per il marcatore nucleolare umano per monitorare l'attecchimento 1 mese dopo il trapianto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Composizione dei mezzi e dei buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Questo protocollo descrive come stabilire, mantenere, modificare geneticamente, differenziare, caratterizzare funzionalmente e trapiantare organoidi della ghiandola lacrimale derivati da topi primari e tessuti umani.

Istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Con organoidi della ghiandola lacrimale, si può esaminare come alcuni geni controllano l'omeostasi della ghiandola lacrimale. Inoltre, gli organoidi possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Il principale vantaggio della tecnologia organoide della ghiandola lacrimale derivata dalle cellule staminali adulte è che consente la crescita e lo studio di cellule epiteliali della ghiandola lacrimale sane e non trasformate.Questi organoidi potrebbero eventualmente essere usati per trattare i pazienti con malattia dell'occhio secco. Inizia preparando il mezzo e il materiale necessari per l'esperimento, seguito dalla combinazione di tutti i componenti del mezzo di digestione prima dell'esperimento. Pre-bagnare i bisturi in questo mezzo per evitare che i pezzi di tessuto si attacchino a loro.Recuperare il tessuto della ghiandola lacrimale del topo dal mezzo, posizionarlo nella capsula di Petri e tritarlo usando bisturi pre-bagnati. Una volta che i pezzi di tessuto sono inferiori a 0,5 millimetri cubici, raschiarli dalla capsula di Petri con il bisturi e trasferirli in un tubo da 15 millilitri contenente il mezzo di digestione. Per una biopsia umana molto piccola, posizionarla direttamente nel mezzo di digestione senza tritare.Incubare il tubo da 15 millilitri con pezzi di tessuto per un massimo di 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, restringere la punta di una pipetta Pasteur in una fiamma e pre-bagnarla nel mezzo di base. Per facilitare il processo di dissociazione, pipettare la miscela tritata su e giù ogni cinque minuti con la pipetta Pasteur pre-bagnata e ristretta.Quando molte cellule singole e piccoli grumi sono visibili al microscopio, interrompere la dissociazione aggiungendo 10 millilitri del mezzo di base. Dopo aver girato a 400 g per cinque minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri del mezzo di base per ripetere il lavaggio e pellet lungo le cellule. Rimuovere i grandi pezzi di tessuto non digeriti e le restanti fibre di collagene filtrando la miscela tritata attraverso un colino da 70 micrometri.Girare l'eluato a 400g per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di matrice extracellulare fredda, o ECM, per una singola ghiandola lacrimale di topo e 50 microlitri di ECM fredda per una biopsia umana, senza creare le bolle. Seminare fino a 100 microlitri di cellule per pozzetto di una piastra di sospensione a 12 pozzetti usando un P200 per produrre circa 20 microlitri di goccioline nel pozzetto.Posizionare la piastra capovolta in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti per consentire la solidificazione ECM. Una volta che l'ECM è solidificato, aggiungere circa un millilitro di mezzo di espansione del mouse a temperatura ambiente per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Preparare appena un millilitro di mezzo di differenziazione umana contenente singoli componenti che inducono la secrezione da parte degli organoidi della ghiandola lacrimale.In un microscopio time-lapse a campo chiaro automatizzato, impostare le posizioni da visualizzare nella lastra, l'intervallo di tempo di cinque minuti e la durata di quattro ore. Assicurati che un'intera goccia ECM sia visibile in ogni posizione. Prima di iniziare a visualizzare l'immagine, rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti da riprendere senza spostare la piastra dal microscopio e sostituirlo con il mezzo di differenziazione umana appena preparato e ben sospeso contenente composti, tra cui forskolina e noradrenalina.Come controllo negativo, includere un pozzo con mezzo di differenziazione rinfrescato. Fare clic sul pulsante Esegui sul microscopio e analizzare i risultati dopo quattro ore. Dopo aver dissociato gli organoidi come menzionato nel testo, scartare il surnatante.Risospendere le cellule in 80 microlitri del tampone di elettroporazione. In un tubo da 1,5 millilitri, preparare i plasmidi necessari per l'esperimento. Aggiungere i plasmidi alle cellule e mescolare bene pipettando su e giù.Impostare l'elettroporatore con i parametri per l'impulso di poring e l'impulso di trasferimento. Posizionare le cellule con i plasmidi in una cuvetta di elettroporazione. Misurare immediatamente la resistenza, che dovrebbe essere compresa tra 0,3 ampere e 0,55 ampere, ed elettropolare immediatamente.Una volta fatto, trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 400 microlitri di tampone per elettroporazione integrato con un inibitore della Rho-chinasi. Lasciare che le cellule si riprendano a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, pellettare le cellule a 500 g per cinque minuti.Dopo aver scartato il surnatante, placcare le cellule in 200 microlitri di ECM. Dopo la solidificazione, aggiungere il mezzo di espansione del mouse. Per la preparazione degli organoidi, dividere gli organoidi della ghiandola lacrimale umana circa tre giorni prima del giorno del trapianto.Per estrarre gli organoidi dall'ECM, aggiungere dispase al terreno di coltura per raggiungere una concentrazione finale di 0,125 unità per millilitro e risospendere completamente le goccioline ECM per interromperle usando un P1000. Riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Risospendere gli organoidi in 10 millilitri di terreno base per lavare l'enzima.Dopo aver pellettato le cellule a 400g per cinque minuti, risospenderle in 50 microlitri di mezzo di espansione umano freddo integrato con ECM al 5%. Posizionare la sospensione organoide sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto. Per il trapianto ortotopico nei topi, aspirare la sospensione organoide in un ago da insulina.Quando il topo dorme, posizionalo rapidamente su un fianco con la ghiandola lacrimal principale accessibile. Iniettare cinque microlitri della sospensione organoide direttamente attraverso la pelle nella ghiandola lacrimale. Consentire al topo di recuperare e valutare quotidianamente la presenza di qualsiasi disagio correlato al trapianto, specialmente negli occhi.In seguito alla dissezione della ghiandola lacrimale del topo, la digestione enzimatica e meccanica ha generato piccoli frammenti di tessuto, compresi gli acini e i dotti. Nella riuscita derivazione organoide della ghiandola lacrimale del topo, dopo sette giorni sono stati trovati organoidi cistici di circa 500 micrometri di diametro. Gli organoidi della ghiandola lacrimale umana sono cresciuti come cisti entro tre o quattro giorni e hanno raggiunto una dimensione adulta in 10-14 giorni dopo l'isolamento dei tessuti.Dopo cinque giorni e sette giorni, rispettivamente, nel mezzo di differenziazione, gli organoidi della ghiandola lacrimale del topo e dell'uomo sono diventati più densi. L'applicazione dell'attivatore ciclico AMP forskolin o del neurotrasmettitore noradrenalina ha provocato gonfiore organoide in meno di tre ore. Nell'elettroporazione di successo, sono cresciuti organoidi resistenti all'igromicina.I cloni organoidi in crescita più grandi di 300 micrometri sono stati raccolti prima della loro differenziazione. L'amplificazione PCR del locus Pax6 bersagliato dall'RNA guida ha prodotto una banda di 367 coppie di basi per tutti i cloni selezionati. Un clone omozigote della ghiandola lacrimale di topo knockout su sei sequenziati è stato ottenuto utilizzando l'RNA guida mirato a Pax6.Alcuni cloni sono cresciuti bene, ma alcuni cloni organoidi sono stati persi dopo la raccolta o hanno iniziato a differenziarsi. Dei 10 cloni organoidi scelti, sette sono cresciuti bene. L'attecchimento organoide è stato confermato un mese dopo l'iniezione degli organoidi nella ghiandola lacrimale del topo mediante colorazione per un marcatore specifico umano, l'antigene nucleolare umano.Una cosa a cui prestare attenzione è non digerire eccessivamente il tessuto, né gli organoidi. Altrimenti, le cellule potrebbero morire e questo ridurrebbe il tasso di insediamento degli organoidi. Gli organoidi delle ghiandole lacrimali possono essere analizzati mediante istologia.In questo modo, si può ottenere informazioni sulla loro composizione cellulare.

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Biologia

La ghiandola lacrimale (LG) è un organo di ramificazione che produce i componenti acquose di lacrime necessarie per il mantenimento della visione e la salute oculare. Qui si descrive murino LG dissezione ed ex vivo le tecniche di coltura di decifrare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di LG.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l'induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.

Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Qui, presentiamo un metodo per stabilire un modello murino di occhio secco con carenza acquosa asportando le ghiandole lacrimali extraorbitali e infraorbitali e valutare i cambiamenti nella superficie oculare nell'occhio secco con deficit acquoso.

Istituzione di un modello murino di carenza acquosa di occhio secco

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

Questo protocollo dimostra come mantenere sani, indifferenziate staminali embrionali umane (ES) cellule.

Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in...

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Scopri come stabilire, mantenere e differenziare organoidi di ghiandola lacrimale di topo e umani. Questo metodo consente di studiare l'omeostasi e applicazioni in medicina rigenerativa.

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