Name: Sviluppo di un tracciante PET del peptide D marcato con 68gallio per limaging dellespressione programmata del ligando di morte 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Scopri l'imaging PET non invasivo con peptide D marcato al Gallio-68 per visualizzare l'espressione di PDL-1 nell'organismo. Questo metodo migliora la selezione dei pazienti per terapie immunologiche mirate.

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo dell'Istituto centrale di ricerca senza scopo di lucro dell'Accademia cinese delle scienze mediche (n. 2022-RC350-04) e dal Fondo per l'innovazione CAMS per le scienze mediche (n. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 e 2022-I2M-2-002).

Le procedure sperimentali sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina di Nanchino o dal National Institutes of Quantum Science and Technology. Gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti rigorosamente in conformità con le linee guida istituzionali del Comitato per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Sintesi peptidica
<ol><li>Gonfiare 100 mg di resina di 4-metilbenzidrilammina (MBHA) (capacità di carico di 0,37 mmol/g) in 1 mL di N-metil-2-pirrolidone (NMP) per 30 minuti sotto un leggero gorgogliamento di N2 .</li>
	<li>Preparare un tampone fresco costituito da amminoacidi protetti da Fmoc (5,0 equivalenti), HCTU (4,9 equivalenti) e DIPEA (10,0 equivalenti) in 1 mL di NMP e aggiungere alla resina (100 mg). Lasciare procedere la reazione di accoppiamento per 1,5-2 h.</li>
	<li>Preparare il tampone di protezione costituito dal 50% (vol/vol) di morfolina in NMP. Lavare la resina (100 mg) 2 x 30 min con 1 mL di tampone di deprotezione ad ogni lavaggio per rimuovere il gruppo Fmoc sul gruppo amminico. Lavare la resina con diclorometano (DCM; 1 mL) per 1 minuto, rimuovere il DCM e rilavare la resina con NMP (1 mL) per un altro 1 minuto. Successivamente, rimuovere l'NMP e lavare nuovamente la resina con DCM per 1 minuto. NOTA: Tutte le procedure di lavaggio vengono eseguite in condizioni di lieve gorgogliamento di N2 . Le procedure di cui sopra vengono ripetute fino all'ultimo amminoacido.</li>
	<li>Per aggiungere acido 1,4,7,10-tetraazciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA) al peptide, pre-attivare il DOTA con N-(3-dimetilamminopropil)-N-etilcarbodiimmide cloridrato (EDC· HCl) e N-idrossisuccinimide (NHS). Incubare il buffer di riserva di DOTA/EDC· HCl/NHS con un rapporto molare di 1:1:1 in dimetilsolfossido (DMSO) per 3 ore, con una concentrazione finale di DOTA di 1 M. Successivamente, aggiungere il tampone madre (1 mL) alla resina (100 mg) e lasciare che la reazione proceda per 2 ore con un leggero gorgogliamento di N2 . NOTA: L'acido 1,4,7-triazciclononano-1,4,7-triacetico (NOTA) può essere utilizzato anche come chelante per la complessazione a 68Ga. Le stesse procedure possono essere utilizzate per l'accoppiamento NOTA.</li>
	<li>Risciacquare accuratamente la resina dall'alto utilizzando DCM e applicare contemporaneamente un vuoto per rimuovere la soluzione di reazione residua. Risciacquare la resina 3 volte con DCM (1,5 mL), quindi risciacquare con MeOH (1,5 mL) per restringere la resina. Mettere la resina sotto azoto per una notte, o sotto vuoto alto per almeno 4 ore, fino a quando la resina non diventa asciutta.</li>
	<li>Mettere la resina essiccata contenente peptide DPA in un contenitore di polipropilene da 2 ml con tappo a vite. Aggiungere il cocktail di scissione appropriato (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O in volume; 1 mL/100 mg di resina) e sigillare ermeticamente il contenitore con un tappo a vite. Agitare delicatamente la reazione su un agitatore orbitale in cappa aspirante a 20-25 °C per 2 ore. ATTENZIONE: Preparare l'acido trifluoroacetico (TFA) in una cappa aspirante indossando indumenti protettivi, a causa della sua natura altamente corrosiva.</li>
	<li>Rimuovere la maggior parte del TFA mediante evaporazione sotto azoto nella cappa aspirante. Precipitare i peptidi aggiungendo etere dietilico (~1,5 mL/100 mg di resina).</li>
	<li>Agitare la miscela per triturare i peptidi e centrifugare a temperatura ambiente (10.000 × g, 5 min). Versare con cautela il solvente fuori dal contenitore. Ripetere i passaggi 1.7-1.8.</li>
	<li>Asciugare all'aria il residuo nel contenitore aperto per 10 minuti. Aggiungere acetonitrile acquoso al 50% (vol/vol) e vorticare per 1-2 s per sciogliere i prodotti (1 mL/100 mg di resina).</li>
	<li>Rimuovere la resina filtrando la miscela, quindi lavare la resina 2 volte utilizzando 0,2 mL di acetonitrile acquoso al 50% (vol/vol). Miscelare i filtrati per la purificazione con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Utilizzare le seguenti condizioni HPLC. Colonna: YMC-Triat-C18 (diametro interno 4,6 mm, 150 mm, 5 mm); gradiente di solvente: acqua A-deionizzata solvente; solvente B-acetonitrile (0,1% TFA); tempo di flusso: 20 min, con acetonitrile dal 10% al 90%; portata: 1 mL/min.</li>
	<li>Congelare gli eluenti HPLC raccolti per una notte a -80 °C e liofilizzare (-50 °C e <1 pa). Per la radiomarcatura, sciogliere il peptide solido in tampone acetato di sodio (100 mM, pH 5,0) a una concentrazione finale di 1 mg/mL come tampone madre.</li>
</ol>2. Radiomarcatura a 68Ga
NOTA 68Ga è stato generato internamente presso il Nanjing First Hospital (Nanchino, Cina) utilizzando un generatore da 68Ge/68Ga.
<ol><li>Pipettare 5 μL di tampone di riserva in un contenitore di polipropilene da 1,5 mL con tappo a vite. Aggiungere 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) al contenitore.</li>
	<li>Agitare il composto per 5 s. Misurare il pH utilizzando le strisce reattive per il pH. Regolare il pH a 4-4,5 con NaOH (0,1 M). NOTA: Un pH appropriato è fondamentale per la complessazione tra 68Ga e DOTA.</li>
	<li>Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 5-10 min. Sottoporre la miscela di reazione a radio-HPLC per l'analisi della resa di radiomarcatura nelle seguenti condizioni: colonna: YMC-Triat-C18 (4,6 mm i.d., 150 mm, 5 mm); gradiente di solvente: acqua A-deionizzata solvente; solvente B-acetonitrile (0,1% TFA); tempo di flusso: 20 min, con acetonitrile dal 10% al 90%; portata: 1 mL/min. NOTA: La cromatografia radio-su strato sottile (TLC) può essere utilizzata come approccio alternativo per esaminare la resa della radiomarcatura. Il tampone di eluizione TLC suggerito è 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.</li>
</ol>3. Test di stabilità del tracciante
<ol><li>Test di stabilità del tracciante in PBS<ol><li>Aggiungere [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, in NaOAc) al PBS (990 μL). Incubare a 37 °C per 1, 2 e 4 ore con leggera agitazione.</li>
		<li>Raccogliere 200 μL di soluzione in ogni punto temporale. Iniettarlo nel radio-HPLC per l'analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Stabilità del tracciante nel siero di topo<ol><li>Aggiungere [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, in NaOAc) al siero di topo (90 μL, appena preparato). Incubare a 37 °C per 1, 2 e 4 ore con leggera agitazione.</li>
		<li>Raccogliere 20 μL di soluzione in ogni punto temporale. Aggiungere MeCN e acqua (100 μL, 1:1, v/v).</li>
		<li>Centrifugare la miscela per 10 minuti (5.000 × g, 25 °C). Analizzare il surnatante utilizzando la radio-HPLC.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dell'espressione di PD-L1 mediante citometria a flusso
<ol><li>Preparare il terreno di coltura integrando il terreno RPMI-1640 con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina (vol/vol). Risospendere le cellule U87MG nel terreno di coltura e seminare in piastre da 12 pozzetti a una densità di 105 cellule/pozzetto. Mettere le cellule in un incubatore (5% CO2, 37 °C) e coltivare per almeno 24 ore senza disturbare.</li>
	<li>Lavare le cellule con 0,5 mL di PBS e aggiungere 250 μL di tripsina-EDTA (0,25%). Rimettere le cellule nell'incubatrice (5% CO2, 37 °C) per 2 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura per arrestare la dissociazione cellulare. Aggiungere il terreno alle cellule per staccarle dalle piastre pipettando su e giù e raccoglierle in provette da 1,5 ml. Centrifugare le cellule per 5 minuti (100 × g).</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Centrifugare le cellule per 5 minuti (100 × g). Ripeti questo passaggio ancora una volta.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo PD-L1 coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) con albumina sierica bovina (BSA) al 3% a 20 nmol/L. Aggiungere alle cellule e incubare a 4 °C per 1 ora.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 minuti (100 × g), quindi lavarle due volte con PBS freddo. Analizza le cellule PD-L1-positive utilizzando un citometro a flusso e un software di analisi.</li>
</ol>5. Immunocitochimica
<ol><li>Seminare le cellule U87MG in piastre di coltura cellulare con fondo di vetro (35 mm) a una densità di 2,5 × 105 cellule per pozzetto. Quando viene raggiunto il 60% di confluenza, aspirare il terreno di coltura e aggiungere 1 mL di PBS. Agitare delicatamente più volte e aspirare. Eseguire la fase di lavaggio 3 volte.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di paraformaldeide al 4% nelle stoviglie. Porre le celle a temperatura ambiente e fissare per 30 min.</li>
	<li>Lavare le celle 3 volte con PBS. Aggiungere 1 mL di BSA al 3% (wt/vol, in PBS) e bloccare le celle fisse per 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il 3% di BSA e incubare direttamente le cellule con l'anticorpo primario anti-PD-L1 (mAb,1:100, diluito in BSA al 3%) per una notte a 4 °C. NOTA: Dopo aver bloccato le celle con BSA, non lavare con PBS.</li>
	<li>Lavare le celle 3 volte con tampone BSA al 3%. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario anti-IgG Fc coniugato con FITC (1:500, diluito in PBS) per 1 ora.</li>
	<li>Lavare le celle 3 volte con PBS. Aggiungere 0,5 mL di DAPI (1 μg/mL) alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare le cellule colorate 3 volte con PBS e osservarle con il microscopio a fluorescenza confocale.</li>
</ol>6. Esperimento di assorbimento e inibizione cellulare
<ol><li>Esperimento di captazione cellulare<ol><li>Coltivare le cellule U87MG in piastre da 12 pozzetti fino a raggiungere l'80% di confluenza. Rimuovere il terreno e lavare le celle con 0,5 mL di PBS.</li>
		<li>Diluire il [68Ga]DPA in terreno fresco a una concentrazione di 74 KBq/mL. Aggiungere 0,5 mL del tampone [68Ga]DPA diluito a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Incubare le cellule con [68Ga]DPA a 37 °C per durate diverse (10, 30, 40 e 120 min). Aspirare il terreno con una pipetta. Lavare le celle con PBS (0,5 ml) tre volte.</li>
		<li>Aggiungere una soluzione di NaOH (0,5 M, 300 μL per pozzetto) per lisare le cellule. Dopo 30 secondi, raccogliere i lisati di cellule viscose in provette da 1,5 mL.</li>
		<li>Lavare due volte la piastra con 0,4 ml di PBS. Raccogliere la soluzione di lavaggio nella provetta da 1,5 mL di cui sopra.</li>
		<li>Avviare il computer incorporato del contatore gamma automatico; Metti i tubi nel ripiano incorporato. Dopo aver caricato tutti i campioni sul trasportatore, premere il pulsante START. I risultati vengono calcolati nel software interno. La lettura registra i conteggi al minuto correlati al decadimento (CPM) di ciascuna provetta.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio di legame competitivo<ol><li>Coltivare le cellule U87MG in piastre da 12 pozzetti fino a raggiungere l'80% di confluenza. Rimuovere il terreno e lavare le celle con 0,5 mL di PBS.</li>
		<li>Diluire [68Ga]DPA in terreno fresco ad una concentrazione di 74 KBq/mL. Sciogliere una quantità appropriata di composti BMS202 in DMSO al 10% per ottenere una concentrazione di 10 mM (400 μL).</li>
		<li>Diluire 4 μL di 10 mM BMS202 in 396 μL di PBS per ottenere una concentrazione di 100 μM. Ripetere questo passaggio per ottenere varie concentrazioni di BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM e 1 pM).</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL del tampone [68Ga]DPA diluito a ciascun pozzetto (0,37 MBq per pozzetto). Aggiungere 5 μL delle soluzioni BMS202 a ciascun pozzetto (tre pozzetti per ogni concentrazione). Incubare le cellule in un incubatore cellulare a 37 °C per 120 min.</li>
		<li>Aspirare il terreno con una pipetta. Lavare le celle con 3 x 0,5 mL di PBS.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di NaOH (0,5 M, 300 μL per pozzetto) per lisare le cellule. Dopo 30 secondi, raccogliere i lisati di cellule viscose in provette da 1,5 mL. Lavare la piastra con 2 x 0.4 mL di PBS.</li>
		<li>Raccogliere la soluzione di lavaggio nella provetta da 1,5 mL di cui sopra. Metti le provette nel ripiano integrato del contatore gamma automatico.</li>
		<li>Seguire le stesse procedure del passaggio 6.1.6.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Imaging PET
NOTA: Eseguire l'imaging PET di piccoli animali, utilizzando un micro scanner PET che fornisce 159 sezioni assiali trasversali distanziate di 0,796 mm (da centro a centro), con un campo visivo orizzontale di 10 cm e un campo visivo assiale di 12,7 cm. Tutti i dati raccolti in modalità elenco sono organizzati in sinogrammi tridimensionali. Il Fourier viene poi riassemblato in sinogrammi bidimensionali (frame × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
<ol><li>In questo studio, utilizzare topi nudi maschi di 5-8 settimane di età pari a 5-8 settimane. Raccogliere le cellule U87MG seguendo i passaggi 4.1-4.4 e aspirare le cellule in una siringa da 0,5 mL. Iniettare per via sottocutanea le cellule nei topi (1 × 106 cellule per tumore, due tumori per topo). Monitorare la crescita del tumore dopo l'iniezione fino a quando il volume del tumore è di 100-300 mm3.</li>
	<li>Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano all'1%-2% (v/v) (1 ml/min). Accendere il dispositivo di riscaldamento e mantenere la cuccia dell'animale in PET a 37 °C.</li>
	<li>Mettere i topi anestetizzati nella giusta posizione sul letto della macchina PET. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. ATTENZIONE: Tenere i mouse in posizione prona per evitare la morte durante la scansione. Durante l'intero processo di imaging, somministrare il flusso di isoflurano (1,0 ml/min) attraverso il naso utilizzando una provetta preinstallata.</li>
	<li>Regolare la posizione della cuccia dell'animale tramite il pannello di controllo. Iniettare i traccianti (10-17 MBq/100-200 μL) per via endovenosa attraverso un catetere della vena caudale preinstallato.</li>
	<li>Creare un flusso di lavoro di scansione in un computer host utilizzando il software di riferimento (vedere Tabella dei materiali) Creare una cartella di studio e impostare il protocollo di acquisizione in base al protocollo del produttore. Esegui scansioni dinamiche (60 minuti per ogni mouse) su tutti i mouse in modalità elenco 3D.</li>
	<li>Definire un protocollo dell'istogramma e un protocollo di ricostruzione seguendo il protocollo del produttore. Utilizza il filtro di Hanning con un cutoff di Nyquist di 0,5 cicli/pixel per ricostruire immagini dinamiche PET (25-30 min e 55-60 min) attraverso la retroproiezione filtrata. Genera immagini MIP (Maximum Intensity Projection) per tutti i mouse.</li>
	<li>Combinare i protocolli in un flusso di lavoro ed eseguire il flusso di lavoro. Analizza le immagini tridimensionali risultanti utilizzando il software, seguendo il protocollo del produttore. NOTA: Utilizzare il software di simulazione per selezionare i volumi di interesse. La radioattività viene corretta per il decadimento in base al tempo di iniezione e presentata come percentuale della dose totale di iniezione/per grammo di tessuto (% ID/g).</li>
</ol>8. Biodistribuzione ex vivo
<ol><li>Somministrare [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) ai topi nudi BALB/C portatori di U87MG attraverso l'iniezione della vena caudale. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano all'1%-2% (v/v) (1 ml/min), quindi sacrificare tre topi tramite lussazione cervicale dopo l'iniezione per 5, 30, 60 e 120 min. NOTA: Gli individui che dimostrano questa procedura devono essere addestrati nelle abilità tecniche della lussazione cervicale per garantire che la perdita di coscienza sia rapidamente indotta. Ciò garantirà che le procedure di eutanasia in questo esperimento siano tutte eseguite in modo umano.</li>
	<li>Dopo che la morte è stata confermata, apri la parete toracica dei topi. Poi, aprite il cuore. Utilizzare una siringa da 1 ml per prelevare il sangue; spremere il sangue dalla siringa in una provetta per il dosaggio radioimmunologico (RIA) (13 mm di diametro) per il contatore gamma.</li>
	<li>Asportare gli organi principali e i tumori e posizionarli in provette RIA (13 mm di diametro) per il contatore gamma. Gli organi principali includono il sangue totale, il cuore, il timo, il fegato, la milza, le ossa, lo stomaco, i reni, i muscoli, i linfonodi intestinali, l'intestino tenue, il pancreas, i testicoli, il cervello e i polmoni. Pesare tutti gli organi.</li>
	<li>Misurare la radioattività all'interno degli organi raccolti utilizzando un contatore autogamma e correggere i valori in decadimento. Calcolare la percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto umido (% ID/g).</li>
</ol>9. Immunoistochimica
<ol><li>Raccogliere i tessuti di glioma e lavarli 3 volte con PBS. Mettere i fazzoletti freschi in paraformaldeide al 4% e fissare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Incorporare i tessuti fissati in paraffina e sezionarli a uno spessore di 10 μm. Mettere le sezioni in un'incubatrice (60 °C) e incubare per 2 ore. Decerare e idratare le sezioni incubando per 10 minuti ciascuna nei seguenti mezzi: xilene (due volte), alcol assoluto, alcol 95%, alcol 90%, alcol 80%, alcol 75%.</li>
	<li>Immergere le sezioni in citrato di sodio 0,01 M e riscaldarle a 92-95 °C. Mantenere la temperatura per 40 minuti per ottenere il recupero dell'antigene.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di soluzione di H2O2 (3%) alle sezioni e inattivare le endoperossidasi per 10 minuti a temperatura ambiente. Bloccare i siti non specifici mediante trattamento con BSA al 3% per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le sezioni con anticorpo primario anti-PD-L1 (mAb, 1:100, diluito in BSA al 3%) per una notte a 4 °C. NOTA: Dopo il blocco con BSA, non lavare con PBS.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3 volte con PBS. Incubare le sezioni con l'anticorpo secondario anticoniglio di capra marcato con HRP (1:500, diluito in PBS) a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	<li>Lavare le celle 3 volte con PBS. Aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro di 3,3-diamminobenzidina (DAB) (soluzione A: soluzione B: soluzione C = 1:1:18) alle sezioni e incubare per 5 minuti al buio.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3 volte con PBS. Aggiungere 500 μL di soluzione di ematossilina (100%) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni con acqua per 30 secondi. Mettere le sezioni in soluzione di differenziazione (alcol al 75%:HCL = 99:1) per 30 s. Lavare le sezioni con acqua per 1 min.</li>
	<li>Disidratare i campioni incubando in sequenza con alcol al 75%, alcol all'80%, alcol al 90%, alcol al 95%, alcol assoluto e xilene (due volte) (10 minuti ciascuno). Montare tutte le sezioni con resina neutra e osservarle al microscopio ottico.</li>
</ol>

Non vengono dichiarati interessi concorrenti.

I passaggi critici descritti in questo metodo includono l'etichettatura efficiente di 68Ga in DPA e la scelta di una finestra temporale adatta per l'imaging PET, che deve corrispondere perfettamente al modello farmacodinamico di DPA nel tumore.
A differenza dell'IHC, l'imaging PET consente di rilevare in tempo reale l'espressione di PD-L1 in tutto il corpo in modo non invasivo, consentendo la visualizzazione di ciascuna area positiva in un tumore eterogeneo <...

La scoperta delle proteine del checkpoint immunitario è stata una svolta nella terapia dei tumori e ha portato a importanti progressi nello sviluppo della terapia di blocco del checkpoint immunitario1. La proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1) e il ligando di morte programmata 1 (PD-L1) sono potenziali bersagli farmacologici con diversi anticorpi approvati dalla Food and Drug Administration (FDA). PD-1 è espresso dalle cellule immunitarie infiltranti il tumore, come le cellule T CD4+, CD8+ e le cellule T regolatorie. PD-L1 è uno dei ligandi di PD-1, che è sovraespresso in una varietà di cellule tumorali 2,3. L'interazione tra PD-1 e PD-L1 inattiva PD-1, sopprimendo così la risposta immunitaria antitumorale4. Questi risultati suggeriscono che l'inibizione di PD-L1 può migliorare l'effetto di uccisione delle cellule immunitarie ed eliminare le cellule tumorali5. Attualmente, l'immunoistochimica cromogenica (IHC) è l'approccio più comunemente utilizzato per identificare i pazienti che hanno maggiori probabilità di rispondere alla terapia con checkpoint immunitario 6,7. Tuttavia, a causa dell'espressione eterogenea di PD-L1 nelle cellule tumorali, i risultati IHC delle biopsie non possono fornire informazioni accurate sull'espressione di PD-L1 nei pazienti8. Studi precedenti hanno riportato che solo il 20%-40% dei pazienti ottiene benefici a lungo termine dalla terapia di blocco del checkpoint immunitario 1,9,10. C'è, quindi, un urgente bisogno di sviluppare un nuovo metodo per aggirare i risultati falsi negativi causati dall'espressione eterogenea di queste proteine del checkpoint immunitario.
La tecnologia di imaging molecolare, come la tomografia a emissione di positroni (PET), consente la visualizzazione in tempo reale dell'intero corpo in modo non invasivo e quindi può superare il metodo IHC convenzionale 11,12,13. Gli anticorpi, i peptidi e le piccole molecole radiomarcati sono traccianti promettenti per il monitoraggio dell'espressione di PD-L1 nei pazienti oncologici 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. La FDA ha approvato tre anticorpi monoclonali terapeutici PD-L1: avelumab, atezolizumab e durvalumab26. I traccianti immuno-PET basati su questi anticorpi sono stati ben documentati 27,28,29,30,31,32. Gli studi clinici di fase iniziale hanno rivelato un valore limitato per l'applicazione clinica, a causa della farmacocinetica sfavorevole30. Rispetto agli anticorpi, i peptidi mostrano una più rapida clearance del sangue e degli organi dagli organi sani e possono essere facilmente modificati chimicamente33. Sono stati riportati peptidi multipli con elevate affinità per PD-1/PD-L12; WL12 è un peptide segnalato che mostra un legame specifico con PD-L134. È stato riportato che i traccianti radiomarcati, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 e [18F]FPyWL12, mostrano un'elevata capacità di targeting del tumore specifico in vivo, che consente la raccolta di immagini di alta qualità dell'espressione di PD-L1 nei tumori 26,35,36,37. Inoltre, la prima valutazione nell'uomo di WL12 radiomarcato ha dimostrato che [68Ga]WL12 (chelato da NOTA) ha un potenziale sicuro ed efficiente per l'imaging clinico del tumore38. A causa della sua elevata idrofobicità e dell'elevato assorbimento nel fegato sano, WL12 ha un uso clinico limitato. Altri peptidi radiomarcanti, come TPP1 e SETSKSF, che si legano specificamente a PD-L1, hanno anche mostrato potenziale stabilità e specificità per visualizzare l'espressione di PD-L1 in tutto il corpo39,40. Tuttavia, i peptidi non modificati sono facilmente degradati dalle proteasi e vengono rapidamente metabolizzati dal rene. I peptidi destrorotti (D) sono stati ampiamente utilizzati come mediatori efficaci, a causa della scarsa stabilità dei peptidi (L) mancini 41,42,43. I peptidi D sono iperresistenti alla degradazione proteolitica e hanno un'emivita metabolica notevolmente prolungata. Rispetto alle loro controparti L, i peptidi D mostrano per lo più capacità di legame specifiche 44,45,46.
Questo studio ha progettato un nuovo metodo per rilevare l'espressione di PD-L1, basato sull'imaging PET di un D-peptide mirato a PD-L1 marcato con 68Ga, antagonista del D-dodecapeptide (DPA), in un modello murino portatore di tumore47. La stabilità di [68Ga]DPA è stata studiata per la prima volta in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e siero di topo, dopodiché è stata testata l'affinità di legame di [68Ga]DPA nei tumori che sovraesprimono PD-L1. Successivamente, l'imaging PET è stato eseguito in modelli di xenotrapianto di glioblastoma per confermare se [68Ga]DPA fosse un tracciante PET ideale per monitorare l'espressione di PD-L1 nei tumori. La combinazione di imaging PET e DPA non solo fornisce un nuovo approccio per superare le sfide associate all'espressione eterogenea di PD-L1, ma pone anche le basi per lo sviluppo di radiotraccianti a base di peptide D.

<table><tbody><tr><td>Acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA)</td><td>Merck</td><td>60239-18-1</td><td>68Ga&nbsp; chelazione</td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidina (DAB) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7304-1SET</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>monoclonale anti-PD-L1</td> per immunoistochimica <td>Wuhan Proteintech</td><td>17952-1-ap</td><td>Immunoistochimica: anticorpo primario</td></tr><tr><td>BMS202</td><td>Selleck</td><td>1675203-84-5</td><td>Saggio di legame competitivo: inibitore</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>V900933</td><td>Immunofluorescente: bloccante&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td>Immunofluorescente: colorazione del nucleo</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Merck</td><td>34856</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>DIPEA</td><td>Merck</td><td>3439</td><td>Accoppiamento peptidico</td></tr><tr><td>EDC&middot; HCl</td><td>Merck</td><td>E6383</td><td>Attivazione di DOTA</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099</td><td>Coltura cellulare: integratore</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG Fc umano coniugato con FITC Biolegend</td><td></td><td>409310</td><td>Immunofluorescente: anticorpo secondario</td></tr><tr><td>anticorpo coniugato con FITC anticorpo PD-L1</td><td>Biolegend</td><td>393606</td><td>Citometria a flusso: anticorpo diretto</td></tr><tr><td>HCTU</td><td>Energy Chemical</td><td>E070004-25g</td><td>Accoppiamento peptidico</td></tr><tr><td>HRP marcato capra anticorpo anti-coniglio</td><td>Servicebio</td><td>GB23303</td><td>Immunoistochimica: anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Idrossisuccinimide (NHS)Merck</td><td></td><td></td> <td>130672 Attivazione di DOTA</td></tr><tr><td>MeCN</td><td>Merck</td><td>PHR1551</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Morfolina</td><td>Merck</td><td>8.06127</td><td>Fmoc- deprotezione</td></tr><tr><td>NMP</td><td>Merck</td><td>8.06072</td><td></td></tr><tr><td>Solevent Paraformaldeide</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>Fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Coltura cellulare: tampone</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Coltura cellulare: supplemento</td></tr><tr><td>Provetta RIA</td><td>PolyLab</td><td>P10301A</td><td>Come contenitore per campioni di tessuto</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Coltura cellulare: terreno basico</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Merck</td><td>1.06264</td><td>Sale per tampone</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Coltura cellulare: agente di dissociazione</td></tr><tr><td>U87MG linea cellulare</td><td>Procell Life Science & Tecnologia Co</td><td>CL-0238</td><td>Modello di cella</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>68Ge/68Ga</td><td>generatore Isotope Technologies Munich, ITM</td><td>Non applicabile</td><td>Generazione di [68Ga]</td></tr><tr><td>Contatore autogamma</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>Wizard2</td><td>Rilevamento della radioattività</td></tr><tr><td>Microscopia confocale a fluorescenza</td><td>Keyence</td><td></td><td>Osservazione dei risultati dell'immunofluorescenza</td></tr><tr><td></td><td>Citometro a flusso Becton Dickinson, BD</td><td>LSRII</td><td>Monitoraggio delle cellule PD-L1 positive</td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)</td><td>SHIMAZU</td><td>LC-20AT&nbsp;</td><td>Purificazione del peptide DPA</td></tr><tr><td>Scanner PET</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td>Sistema multimodale Inveon</td><td>Imaging PET</td></tr><tr><td>Microscopia ottica Nikon</td><td>&nbsp;</td><td>Eclipse E100</td><td>Osservazione dei risultati dell'immunoistochimica</td></tr><tr><td>Sintetizzatore di peptidi in fase solida</td><td>Promega Vac-Man Collettore a vuoto da laboratorio</td><td>LOT#11101</td><td>Sintesi del peptide DPA-DOTA</td></tr><tr><td>Software</td>ASIPro <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Siemens Medical Solutions</td><td>Non applicabile</td><td>Analisi dei risultati della PET-CT</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson, BD</td><td>FlowJo 7.6.1</td><td>Analisi dei risultati del citometro a flusso</td></tr><tr><td>Inveon Acquisition Workplace (IAW)</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td>Non applicabile</td><td>Gestione della mecchina PET</td></tr><tr><td>Prism Graphpad</td><td></td><td>Prism 8.0</td><td>Analisi dei dati&nbsp;</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un tracciante pet del peptide d marcato con 68gallio per l'imaging dell'espressione programmata del ligando di morte 1

Development of a 68Gallium-Labeled D-Peptide PET Tracer for Imaging Programmed Death-Ligand 1 Expression

Lo sviluppo di una terapia di blocco del checkpoint immunitario basata sulla proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1)/ligando di morte programmata 1 (PD-L1) ha rivoluzionato le terapie antitumorali negli ultimi anni. Tuttavia, solo una frazione dei pazienti risponde agli inibitori di PD-1/PD-L1, a causa dell'espressione eterogenea di PD-L1 nelle cellule tumorali. Questa eterogeneità rappresenta una sfida per la rilevazione precisa delle cellule tumorali mediante l'approccio immunoistochimico (IHC) comunemente usato. Questa situazione richiede metodi migliori per stratificare i pazienti che trarranno beneficio dalla terapia di blocco del checkpoint immunitario, per migliorare l'efficacia del trattamento. La tomografia a emissione di positroni (PET) consente la visualizzazione in tempo reale dell'espressione di PD-L1 in tutto il corpo in modo non invasivo. Pertanto, è necessario lo sviluppo di traccianti radiomarcati per rilevare la distribuzione di PD-L1 nei tumori attraverso l'imaging PET.
Rispetto alle loro controparti L, i peptidi destrorotatori (D) hanno proprietà come la resistenza proteolitica e un'emivita metabolica notevolmente prolungata. Questo studio ha progettato un nuovo metodo per rilevare l'espressione di PD-L1 basato sull'imaging PET di 68D-peptidi mirati a PD-L1 marcati con Ga, un antagonista del D-dodecapeptide (DPA), in topi portatori di tumore. I risultati hanno mostrato che il [68Ga]DPA può legarsi specificamente ai tumori che sovraesprimono PD-L1 in vivo e hanno mostrato una stabilità favorevole e un'eccellente capacità di imaging, suggerendo che [68Ga]DPA-PET è un approccio promettente per la valutazione dello stato di PD-L1 nei tumori.

[68Ga]Radiomarcatura e stabilità DPA Il peptide modello, DPA, è un efficace antagonista di PD-L1. DOTA-DPA è stato ottenuto con una purezza del &gt;95% e una resa del 68%. La massa di DOTA-DPA è osservata sperimentalmente a 1.073,3 ([M+2H]2+). 68Il gallio è considerato un radionuclide adatto per marcare i peptidi per l'imaging PET, e quindi è stato scelto per questo studio. Per radiomarcare DPA con 68Ga (emivita: 68 min), è ...

Questo studio ha sviluppato un metodo non invasivo e in tempo reale per valutare la distribuzione del ligando di morte programmato 1 in tutto il corpo, basato sull'imaging tomografico a emissione di positroni dell'antagonista D-dodecapeptide [68Ga]. Questa tecnica presenta vantaggi rispetto all'immunoistochimica convenzionale e migliora l'efficienza nell'identificazione dei pazienti appropriati che trarranno beneficio dalla terapia di blocco del checkpoint immunitario.

Sviluppo di un tracciante PET del peptide D marcato con 68gallio per l'imaging dell'espressione programmata del ligando di morte 1

The development of immune checkpoint blockade therapy based on programmed cell death-protein 1 (PD-1)/programmed death-ligand 1 (PD-L1) has revolutionized ...

Questo metodo utilizza il peptide D DPA, marcato con Gallio-68. Il tracciante radio Gallio-68 per marcare il DPA consente la visualizzazione in tempo reale dell'espressione di PDL-1 in tutto il corpo in modo non invasivo. L'uso del peptide D conferisce al radiotracciante un'iper-resistenza alla degradazione proteolitica e prolunga notevolmente la loro emivita metabolica.In particolare, la tecnica può essere applicata per valutare diverse patologie, subordinate alla scoperta di bersagli specifici e allo sviluppo di traccianti radio con una buona cinetica di telefonata. La tecnica può essere applicata anche al trattamento di tumori PDL-1 positivi mentre si marca DPA con altri radionucleotidi, come il lutezio-177 e l'attinio-225. A dimostrare la procedura sarà Wu Jiang, un ricercatore del mio laboratorio.Per la radiomarcatura dell'antagonista del peptide d-dodecapeptide, o DPA, pipettare cinque microlitri del tampone madre preparato contenente DPA in un contenitore di polipropilene da 1,5 millilitri con tappo a vite e aggiungere 400 microlitri di tricloruro di gallio 68 nel contenitore. Agitare la miscela per cinque secondi. Misurare il pH della miscela utilizzando strisce reattive per pH e regolare il pH da 4 a 4,5 con idrossido di sodio molare 0,1.Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Quindi, seguendo le condizioni menzionate nel testo, sottoporre la miscela di reazione a radioHPLC per analizzare la resa della radiomarcatura. Per testare la stabilità del tracciante nel PBS, aggiungere 10 microlitri di DPA marcato con gallio-68 in soluzione di acetato di sodio a 990 microlitri di PBS.Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per una, due e quattro ore, con leggera agitazione. Raccogliere 200 microlitri di soluzione in ogni punto temporale e analizzarla via radio HPLC. Per testare la stabilità del tracciante nel siero di topo, aggiungere 10 microlitri di DPA marcato con gallio-68 in soluzione di acetato di sodio a 90 microlitri di siero di topo appena preparato e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per una, due e quattro ore con leggera agitazione.Quindi raccogliere 20 microlitri della soluzione in ogni suddetto punto temporale e aggiungere 100 microlitri di miscela di acqua aceto nitrilica nell'aliquota raccolta. Centrifugare la miscela a 5.000 g per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Analizzare il surnatante utilizzando la radioHPLC.Coltivare le cellule U-87 MG in piastre da 12 pozzetti fino a raggiungere l'80% di confluenza. Quindi rimuovere il terreno e lavare le celle con 0,5 millilitri di PBS. Diluire il DPA marcato con gallio-68 in terreno fresco a una concentrazione di 74 kilobecquerel per millilitro.Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone DPA diluito marcato con gallio-68 a ciascun pozzetto. Incubare le cellule con DPA marcato con gallio-68 a 37 gradi Celsius per la durata di 10, 30, 40 e 120 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno utilizzando una pipetta e lavare le cellule con 0,5 millilitri di PBS tre volte.Successivamente, aggiungere 300 microlitri di soluzione molare di idrossido di sodio 0,5 per pozzetto per lisare le cellule. Dopo 30 secondi, raccogliere i lisati di cellule viscose in provette da 1,5 millilitri. Lavare la piastra aggiungendo due volte 0.4 millilitri di PBS per pozzetto e raccogliere la soluzione di lavaggio nei provette da 1.5 millilitri menzionati.Avviare il computer incorporato del contatore gamma automatico e inserire le provette nel ripiano incorporato. Dopo aver caricato tutti i campioni sul trasportatore, premere il pulsante di avvio. I risultati vengono calcolati nel software interno, mentre la lettura registra i conteggi correlati al decadimento al minuto, o CPM, di ciascuna provetta.Raccogliere le cellule U-87 MG seguendo il protocollo menzionato nel testo e aspirare le cellule in una siringa da 0,5 millilitri. Successivamente, prendi i topi BALB/c Nude e inietta le cellule per via sottocutanea, mantenendo un conteggio di due tumori per topo. Monitorare la crescita del tumore dopo l'iniezione fino a quando il volume del tumore non è compreso tra 100 e 300 millimetri cubi.Per eseguire l'imaging PET, iniettare i traccianti per via endovenosa attraverso un catetere della vena caudale preinstallato. Creare un flusso di lavoro di scansione in un computer host utilizzando il software di riferimento, quindi creare una cartella di studio e impostare il protocollo di acquisizione secondo le linee guida del produttore. Esegui scansioni dinamiche su ciascun mouse per 60 minuti in modalità elenco 3D.Successivamente, definire un protocollo di istogramma e un protocollo di ricostruzione, seguendo le istruzioni del produttore. Usa il filtro di Hanning con un cutoff di Nyquist di 0,5 cicli per pixel per ricostruire immagini dinamiche PET per 25-30 minuti e da 55 a 60 minuti attraverso la retroproiezione filtrata. Genera immagini di proiezione a massima intensità, o MIP, per tutti i mouse.Somministrare DPA marcato con gallio-68 ai topi Nude U-87 MG portatori di BALB/c attraverso l'iniezione della vena caudale. Dopo l'eutanasia, sezionare la parete toracica dell'animale e aprire il cuore. Utilizzando una siringa da un millilitro, prelevare il sangue e spremere il sangue dalla siringa in una provetta per il dosaggio radioimmunologico, o RIA, che misura 13 millimetri di diametro per il contatore gamma.Asportare gli organi principali e i tumori e metterli in tubi RIA simili per il contatore gamma. Pesa tutti gli organi principali menzionati nel testo. Misurare la radioattività all'interno degli organi raccolti utilizzando un contatore gamma automatico e correggere i valori di decadimento.Calcolare la percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto umido. Il DPA marcato con gallio-68 ha mostrato un'elevata impurità di resa radiochimica. Era altamente stabile sia nel PBS che nel siero di topo, non mostrando alcuna decomposizione del gallio-68 o idrolisi peptidica dopo l'incubazione di quattro ore.Circa il 60% delle cellule U-87 MG è risultato essere programmato per la morte del ligando uno, o PDL-1 positivo mediante citometria a flusso, e la colorazione immunofluorescente ha confermato una forte espressione di PDL-1 nelle cellule U-87 MG. Le cellule U-87 MG hanno mostrato un assorbimento dipendente dal tempo di DPA marcato con gallio-68, che si è ridotto significativamente dopo l'utilizzo di un inibitore PDL-1, BMS-202, come agente bloccante. L'affinità di legame stimata per BMS-202 era di 43,8 nanomoli per litro quando il DPA marcato con gallio-68 è stato utilizzato come concorrente.Le immagini PET di tutto il corpo hanno rivelato un elevato accumulo di DPA marcato con gallio-68 nel tumore dopo 30 e 60 minuti di iniezione. Un esperimento parallelo ha dimostrato un piccolo accumulo di DPA marcato con gallio-68 nei tumori Bon-1 di controllo negativo a 60 minuti dopo l'iniezione. Inoltre, la colorazione immunoistochimica ha rivelato che le cellule U-87 MG presentavano una considerevole espressione di PDL-1, ma non il tumore Bon-1.La colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato una morfologia cellulare simile tra i due tessuti tumorali. Lo studio di biodistribuzione ex-vivo ha mostrato una rapida eliminazione della radioattività e del sangue nella maggior parte degli organi analizzati, tra cui cuore, fegato, polmone e muscoli. Il rene ha accumulato la più alta quantità di radioattività, mentre il tumore ha mostrato il secondo più alto assorbimento di traccianti in tutti i punti temporali.Il fatto che la struttura del peptide D sia diversa utilizzando un metodo efficiente per marcare il DPA con il gallio-68 è il passo più importante. Questa tecnica ha aperto la strada allo sfruttamento del test PET come radiofarmaci efficaci per gestire diversi tumori, sia come traccianti PET che come agenti radiodiagnostici.

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Di micro-onde one-pot di Sintesi N-Succinimidile-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

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La cicloaddizione di Diels-Alder per la domanda di elettroni inversi bioortogonali è stata sfruttata per creare una strategia di imaging PET premirata efficace e modulare per il cancro. In questo protocollo, le fasi di questa metodologia sono descritte nel contesto di un sistema modello che impiega l'anticorpo mirato al cancro del colon-retto huA33 e un radioligando marcato con 64Cu.

Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

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Indagini su GA (III) Complesso di EOB-DTPA e la sua<sup&gt; 68</sup&gt; Ga marcata radioattivamente analogico

Seguendo la preparazione di un anticorpo monoclonale 64 Cu-modificata legandosi ad un recettore delle cellule T transgenico murino, cellule T sono radiomarcato in vivo, analizzati per la vitalità, funzionalità, stabilità etichettatura e apoptosi e adoptively trasferite in topi con una cannula ipersensibilità di tipo ritardato reazione per l'imaging non invasiva mediante tomografia a emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT).

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

L'integrina di3 α βvè un tipo di proteina di adesione che è altamente espresso sulle cellule endoteliali attivate che subiscono l'angiogenesi. Quindi, valutando l'integrità dell'integrina è di grande interesse in oncologia. Qui, presentiamo un metodo per preparare 68Ga-etichetta radiopeptides e un metodo per valutarne l'efficacia biologica.

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