Quantificazione e caratterizzazione dell'intero genoma dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria

L'epidemiologia basata sulle acque reflue è attualmente utilizzata per integrare le strategie di controllo del COVID-19 in tutto il mondo, rilevando l'RNA virale nei campioni di acque reflue e identificando potenziali focolai. Questa tecnica fornisce un'istantanea a livello di popolazione della prevalenza di COVID-19 nella nostra comunità, che include casi asintomatici. Anche il campionamento dell'aria è un'importante aggiunta a questo protocollo.

La diagnostica clinica è ancora il modo più accurato per gestire le epidemie e le pandemie. Tuttavia, questa tecnica è ancora utile come complemento. Questo metodo ha molti passaggi e punti critici.

Una dimostrazione visiva è essenziale, in quanto consentirà ai laboratori che non hanno molta familiarità con la biologia molecolare di replicare la procedura. Per iniziare, raccogliere un litro di un campione di acque reflue composite delle 24 ore. Aggiungere 20 microlitri di mengovirus in 70 millilitri del campione.

Dopo aver centrifugato il campione a 700 G per 10 minuti, concentrare il surnatante risultante utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga con un cutoff di 10 kilodalton mediante centrifugazione. Eluire il concentrato centrifugando a 700 G per 40 minuti e invertendo la posizione del dispositivo di ultrafiltrazione. Utilizzare il concentrato risultante per l'estrazione dell'RNA.

Per raccogliere i campioni d'aria, posizionare un cono sterile nel campionatore d'aria prima di iniziare la raccolta. Una volta terminato il campionamento, estrarre l'RNA dal PBS lavato del cono utilizzando un kit di estrazione dell'RNA virale commerciale o un metodo interno. Preparare la miscela master di reazione per ciascun bersaglio, mengovirus, SARS-CoV-2, geni N1 e N2 in una cappa pulita nella sala di preparazione dei reagenti.

Miscelare la miscela primer-sonda e l'enzima invertendo cinque volte o pulsando a vortice. Conservando le provette per microcentrifuga in un rack freddo, erogare 15 microlitri della miscela in provette PCR a strisce o in una piastra PCR a 96 pozzetti posta su un rack di raffreddamento. Coprire la piastra e spostarla nell'area di manipolazione dell'acido nucleico.

Agitare delicatamente un'aliquota dell'RNA estratto per cinque secondi. Pipettare cinque microlitri di RNA alla miscela di reazione per ottenere 25 microlitri e avviare la RT-qPCR. In una piastra PCR, pipettare 16 microlitri di ciascun campione nella sua posizione sulla piastra e aggiungere quattro microlitri di cinque volte la trascrizione inversa o la miscela master RT.

Quindi iniziare la reazione PCR. Successivamente, preparare 10 diluizioni micromolari di ciascun set di primer e della miscela master per ogni set di primer. In una nuova piastra PCR, pipettare 20 microlitri della miscela principale, quindi cinque microlitri del campione RT a ciascuna miscela.

Dopo aver coperto la piastra, avviare la reazione PCR. Una volta terminata la PCR, far girare la piastra a 1000 G per 15-30 secondi. Per la purificazione PCR, aggiungere 50 microlitri di reagente a base di microsfere in ciascun pozzetto e miscelare mediante pipettaggio per procedere con la separazione magnetica.

Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Risospendere ogni pellet con 15 microlitri di acqua di grado PCR e incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti. Riposizionare la piastra sul supporto magnetico e lasciare che le perline si inpannino per due minuti.

Quindi pipettare con cura 15 microlitri di surnatante da ciascun campione su una nuova piastra PCR. Successivamente, per la preparazione della libreria, aggiungere 1,75 microlitri di tampone di reazione dal kit di preparazione della libreria di DNA e 0,75 microlitri di miscela enzimatica a ciascun campione. Ruotare brevemente la piastra coperta e centrifugare a 1000 G per 15-30 secondi.

Incubare per cinque minuti a 21 gradi Celsius e cinque minuti a 65 gradi Celsius. Pipettare tre microlitri di acqua di grado PCR per ciascun campione su una nuova piastra PCR. Aggiungere 0,75 microlitri dei campioni preparati e 1,25 microlitri di codici a barre per la preparazione della libreria di sequenziamento.

Quindi aggiungere cinque microlitri di T4 DNA ligasi master mix e mescolare bene mediante pipettaggio. Dopo aver centrifugato la piastra nella centrifuga, incubare la piastra a 21 gradi Celsius per 20 minuti e a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver raggruppato tutti i campioni, aggiungere 192 microlitri di reagente a base di microsfere al pool per la purificazione PCR.

Mescolare bene mediante pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Posizionare il tubo su un supporto magnetico. Attendere che il surnatante si schiarisca e che si formi un pellet di perline.

Rimuovere il surnatante e il tubo dal supporto magnetico. Aggiungere 700 microlitri di tampone per frammenti corti o SFB e miscelare mediante pipettaggio. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e attendere che si formi il pellet e che il liquido si liberi.

Scartare il surnatante usando una pipetta. Aggiungere 35 microlitri di acqua per PCR nella provetta, mescolare mediante pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per due minuti. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e lasciare che le perline si inumidiscano e il liquido si liberi.

Pipettare 35 microlitri di surnatante in una nuova provetta. Successivamente, preparare la miscela di reazione di legatura dell'adattatore come descritto nel manoscritto del testo e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Miscelare 20 microlitri del reagente a base di microsfere alla miscela di reazione di legatura per la purificazione PCR e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Posizionare il tubo sul supporto magnetico e attendere che si formi il pellet di perline e che il surnatante diventi incolore. Scartare con cautela il surnatante mediante pipettaggio. Mescola 125 microlitri di SFB nel tubo e rimettilo sul supporto magnetico per separare le perline.

Quando il liquido diventa limpido, scartare il surnatante e ripetere l'aggiunta di SFB come dimostrato in precedenza. Lasciare aperto il tubo sul supporto magnetico per 30 secondi. Aggiungere 15 microlitri di tampone di eluizione e mescolare bene mediante pipettaggio.

Dopo una breve centrifugazione e un'incubazione a temperatura ambiente per cinque minuti, posizionare sul supporto magnetico per due minuti. Pipettare 15 microlitri di surnatante in una nuova provetta a basso legame per misurare la concentrazione con un kit di quantificazione del DNA fluorometrico. Successivamente, inserire la cella di flusso nel dispositivo di sequenziamento del DNA e dell'RNA in tempo reale.

Inserire il puntale di una pipetta da 1.000 microlitri impostata su 200 microlitri nella porta di adescamento. Ruotare la rotella di impostazione del volume per aumentare il volume fino a vedere il liquido nella punta, quindi scartare la punta. Aggiungere 800 microlitri della miscela di adescamento alla porta di adescamento senza bolle e attendere cinque minuti.

Pipettare 200 microlitri della miscela della libreria nella porta di adescamento. Chiudere la porta del coperchio e la porta di adescamento. Avviare l'esperimento di sequenziamento nel software e selezionare Base Calling On.Questo metodo ha rilevato e quantificato l'RNA SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria.

I campioni di acque reflue avevano una deviazione standard dall'1,91% al 13,98% tra i triplicati e variavano da 3,05 volte 10 a tre a 2,83 volte 10 a otto copie geniche per litro. I campioni d'aria variavano da 6,17 volte 10 a tre a 5,48 volte 10 a nove, con la deviazione standard nei duplicati tra 0,54% e 10,95%Come descritto in questo protocollo, i campioni sono stati sequenziati e un esempio di tre risultati di campioni sequenziati è riassunto qui. In tutti e tre i campioni, il lignaggio BA.5.

x è stato assegnato come il più diffuso dallo strumento Freyja. La concentrazione dei campioni di acque reflue è un passaggio cruciale poiché l'RNA virale è presente a basse concentrazioni nelle acque reflue. E quindi questo passaggio è fondamentale per un rilevamento e una quantificazione accurati.

Questa procedura può essere adattata utilizzando diversi primer nel protocollo RT-qPCR da utilizzare per rilevare e quantificare altri agenti infettivi. La tecnica ha quantificato con precisione il SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria. Diversi agenti patogeni possono essere rilevati e quantificati da luoghi diversi.