Name: Determinazione delle relazioni di auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo S (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Impara a determinare l'auto-incompatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo S. Questo metodo semplice e affidabile facilita la selezione di piante impollinatrici compatibili per programmi di miglioramento genetico.

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Questo progetto è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).

1. Preparazione per la colorazione blu all'anilina
<ol><li>Preparare i seguenti reagenti e strumenti per l'esperimento: un pennello impollinatore, una pinzetta, una matita, carta solfato, un sacchetto di impollinazione, sacchetti con chiusura a cerniera, graffette, formaldeide, acido acetico glaciale, etanolo assoluto, provette per centrifuga, pinze, contagocce di colla, vetrini, copertine, bisturi e glicole polietilenico.</li>
	<li>Preparare un mezzo di germinazione in vitro contenente 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 e 15% saccarosio. Regolare il pH a 6,0-6,2 con KOH. Utilizzare un agitatore magnetico poiché PEG-4.000 è difficile da sciogliere.</li>
	<li>Preparare la soluzione fissativa di Carnoy, che è etanolo assoluto e acido acetico glaciale miscelati con un rapporto di 3: 1. Preparare la soluzione di fissazione FAA, che è 40% formaldeide, 80% etanolo e acido acetico glaciale (1: 8: 1). Preparare 4 M idrossido di sodio (NaOH) e soluzione di blu di anilina, che è blu di anilina allo 0,1% in 0,1 M K3PO4. Utilizzare una bottiglia ambrata per conservare la soluzione blu anilina perché è sensibile alla luce.</li>
</ol>2. Raccolta del polline
<ol><li>Conoscere in anticipo il periodo di fioritura degli alberi sperimentali (Ma jia pummelo in questo studio). Raccogli i fiori maturi non aperti dall'inizio del periodo di fioritura alla fase di massima fioritura e mettili in un sacchetto con chiusura a zip. I fiori possono essere conservati a 4 °C in frigorifero per 24 ore.</li>
	<li>Porta i fiori al laboratorio. Usa una pinzetta per raccogliere le antere e mettile in una piastra di Petri contenente carta da filtro. Raccogli antere da 20 a 30 fiori.</li>
	<li>Mettere la piastra di Petri contenente le antere in un forno a 28 °C per 24 ore fino a quando i grani di polline non si asciugano. Per l'organizzazione dettagliata dei fiori, vedi Hu et al.9.</li>
	<li>Mettere il polline essiccato in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Conservare il polline in un sacchetto con chiusura a zip ermetico contenente gel di silice che cambia colore (essiccante). Chiudere il sacchetto ed etichettarlo con il nome della varietà di polline e la data di conservazione. Il polline essiccato può essere conservato in frigorifero a -20 °C per 96 settimane16.</li>
</ol>3. Test di germinazione del polline in vitro
<ol><li>Versare 300 μL di mezzo liquido in una capsula di coltura cellulare o nel tappo di una provetta da centrifuga da 2 ml e cospargere uniformemente il polline con l'aiuto di un pennello per l'impollinazione. Incubare il polline a 28 °C in un ambiente buio umidificato per 12 ore.</li>
	<li>Rimuovere la parte superiore di 1 mm della punta di una punta di pipetta da 1.000 μL. Utilizzare la pipetta per assorbire il polline con una piccola quantità di soluzione di coltura e spostarla al centro del vetrino del microscopio. Coprilo con un foglietto. Osservare il campione con un microscopio invertito usando un obiettivo 10x.</li>
	<li>Eseguire tre repliche indipendenti utilizzando approssimativamente la stessa densità di polline per ciascuna replica17. Gestisci visivamente la quantità di polline, assicurandoti che tutta la piastra di Petri sia coperta di polline e che ogni capsula di Petri abbia una quantità quasi uguale di polline.</li>
	<li>Il polline germinato produce un tubo pollinico con una lunghezza circa doppia del suo diametro. Calcola il tasso di germinazione da 20 campi visivi, che fornisce la percentuale di polline germinato in tutti i campi pollinici.</li>
</ol>4. Impollinazione
<ol><li>Scegli una giornata di sole senza vento per l'impollinazione. Seleziona 10 gemme completamente sviluppate che stanno per aprirsi, stacca i petali con cura e fai attenzione a non ammaccarli.</li>
	<li>Utilizzare un pennello per l'impollinazione per diffondere una quantità sufficiente di polline vitale sulla superficie dello stigma e fare attenzione a non danneggiare il pistillo. Per l'autoimpollinazione, utilizzare il polline della stessa pianta / cultivar. Per l'impollinazione incrociata, utilizzare il polline di una pianta con un genotipo diverso.</li>
	<li>Coprire i fiori impollinati con un sacchetto di carta solfato. Utilizzare una graffetta per sigillare il sacchetto e prevenire l'impollinazione da polline genotipicamente distinti.</li>
	<li>Scrivi il nome della specie e il numero e il tempo di impollinazione sull'etichetta. Appendere l'etichetta sui rami vicino ai fiori impollinati.</li>
</ol>5. Campionamento, fissazione e conservazione
<ol><li>Rimuovere i sacchetti di impollinazione circa 3-4 giorni dopo l'impollinazione e raccogliere i fiori impollinati in sacchetti con chiusura a zip.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente i petali, i recipienti e le ovaie dai fiori e immergere gli stimmi fusi agli stili in un tubo di centrifuga contenente una soluzione fissativa appena preparata. Incubare gli stimmi e gli stili nella soluzione fissativa per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Il giorno dopo, scartare la soluzione fissativa e lavare gli stimmi e gli stili due o tre volte in etanolo al 95%.</li>
	<li>Trasferire gli stili in una soluzione di etanolo al 70%. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso nella soluzione. I modelli in questa fase possono essere conservati a 4 °C per 1-2 mesi.</li>
</ol>6. Colorazione blu all'anilina
<ol><li>Lavare i campioni di stile conservati in etanolo al 70% con acqua distillata tre o quattro volte. Immergere in una soluzione di 4 M NaOH, sigillare e incubare in bagnomaria a 65 °C per 60 minuti. Durante questa fase, il colore dello stile cambia da giallo-bianco a rosso-arancio.</li>
	<li>Immergere gli stili in acqua distillata per 30 min. Scartare l'acqua distillata e lavare gli stili con acqua distillata tre o quattro volte o fino a quando il colore dello stile diventa giallo.</li>
	<li>Mettere il campione in una provetta da 10 ml, aggiungere il blu di anilina fino a quando il campione è stato immerso e colorare per 12 ore al buio.</li>
	<li>Osservare la crescita del tubo pollinico con un microscopio a fluorescenza.</li>
</ol>7. Microscopia a fluorescenza
<ol><li>Prima di osservare i campioni, posizionare il vetrino su un tavolo piano e aggiungere due o tre gocce di glicole polietilenico sulla superficie del vetrino.</li>
	<li>Lavare lo stile da osservare con acqua distillata. Usa un bisturi per dividerlo in due metà lungo l'asse longitudinale. Posiziona metà dello stile sul vetrino e copri con una copertina.</li>
	<li>Posiziona il vetrino sul palco del microscopio sopra l'apertura e visualizzalo utilizzando un obiettivo 10x. Utilizzare il filtro DAPI (eccitazione: 325-375 nm; emissione: 435-485 nm). Osserva cinque stili per ogni tipo di impollinazione. Osserva la crescita del tubo pollinico.</li>
</ol>8. Identificazione del genotipo S basato sulla PCR
<ol><li>Estrarre il DNA genomico dal campione di stigma utilizzando il metodo CTAB18.<ol><li>Mettere le foglie raccolte in una provetta da centrifuga da 2 ml e congelare a scatto in azoto liquido. Preparare un tampone HCl:EDTA:NaCl:H2O in rapporto 1:1:3:5 e una miscela di alcol isoamilico cloroformio in rapporto 24:1</li>
		<li>Aggiungere 10 ml del tampone preparato, 0,2 g di CTAB e 200 μL di mercaptoetanolo in una provetta da centrifuga da 50 mL e metterli a bagnomaria a 65 °C per 5 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida e trasparente.</li>
		<li>Mettere le lame in un mortaio, aggiungere i campioni congelati, aggiungere azoto liquido e macinare. Mettere il campione macinato in una provetta da centrifuga da 2 ml, aggiungere 600 μL di miscela CTAB, metterlo a bagnomaria a 65 °C per 60 minuti e mescolarlo capovolto ogni 30 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 700 μL della miscela di alcol isoamilico cloroformio (24:1) e mescolare capovolto per 10 minuti. Centrifugare a 24 °C a 12.000 x g per 10 minuti, pipettare il surnatante e trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.</li>
		<li>Aggiungere 60 μL di soluzione 5 M di NaCl e 1 ml di etanolo assoluto e mescolare capovolto. Congelare a -20 °C per 30 minuti e centrifugare a 24 °C e 9.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di soluzione di etanolo al 70% e lasciare a temperatura ambiente per 1-2 ore. Centrifugare a 24 °C, 9.000 x g per 5 minuti, scartare il surnatante, aspirare la soluzione di etanolo in eccesso e asciugare all'aria per 5 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di acqua sterile per sciogliere, misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro e congelare in un congelatore a -4 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
		<li>Configurare il sistema di reazione RT-PCR. Preparare la seguente miscela di reazione per 10 μL contenente 5 μL di 2x PCRMix, 0,25 μL ciascuno di primer diretto e inverso, 1 μL di DNA (100 ng/ μL) e 3,5 μL di H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare il programma PCR come da Tabella 1. Il programma PCR per tutte le isoforme era di 95 °C per 5 min 32x (95 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 1 min) e 72 °C per 5 min. Separare i prodotti su gel di agarosio TAE-1,5% e fotografare9. Verificare il genotipo S specificato utilizzando il DNA genomico.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
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<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Nelle colture da frutto, sia la partenocarpia che l'SI sono tratti importanti perché aprono la strada a frutti senza semi - una caratteristica molto apprezzata dai consumatori. L'autoincompatibilità promuove il rifiuto dell'autopolline e, quindi, impedisce la consanguineità20. Tra gli agrumi, il pummelo è una varietà auto-incompatibile7. Quasi il 40% di tutte le specie di angiosperme presenta SI21. Questa caratteristica impedisce l'allegagione, riduc...

L'autoincompatibilità (SI) è un meccanismo geneticamente controllato presente in circa il 40% delle specie di angiosperme. In questo processo, il pistillo respinge il polline da una pianta con lo stesso genotipo SI e, quindi, impedisce l'autofecondazione 1,2. Ma jia pummelo è una varietà locale nella provincia di Jinagsu, in Cina, con le eccellenti qualità di frutta grande e rosa, un ricco contenuto di succo, un sapore agrodolce e una buccia spessa3. Sebbene il SI promuova l'outcrossing, influisce negativamente sulla resa e sulla qualità dei frutti4 e richiede alberi impollinatori adatti con genotipi SI distinti per tassi di allegagione affidabili e rese elevate. Allo stato attuale, ci sono due tipi principali di SI, l'autoincompatibilità sporofica (SSI), rappresentata dalle Brassicaceae, e l'autoincompatibilità gametofitica (GSI), rappresentata dalle Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
Gli agrumi sono una delle colture frutticole più importanti al mondo. Il sistema GSI basato sulla S-RNasi si trova in molte accessioni di agrumi e influenza negativamente il tasso di allegagione9. In questo sistema, SI è controllato dal locus S, un singolo locus polimorfico con due alleli complessi che trasportano determinanti del pistillo S e determinanti del polline S 7. Il determinante femminile è la ribonucleasi S (S-RNasi) e il determinante maschile è il locus S F-box (SLF)7. Le cellule del pistillo secernono proteine S-RNasi. Le S-RNasi non-self sono riconosciute dalle proteine SLF, il che porta all'ubiquitinazione e alla degradazione delle non-self S-RNasi da parte della via del proteasoma 26S. Al contrario, le S-RNasi self sono in grado di accumulare e inibire la crescita del tubo pollinico (PT) perché eludono le proteine SLF e, quindi, sono impedite dall'ubiquitinizzazione10,11,12,13.
Qui riportiamo una tecnica in vivo utile per identificare i genotipi S e i gradi di compatibilità e incompatibilità del polline. Il protocollo prevede l'estrazione del DNA totale dalle foglie e la previsione del genotipo S utilizzando primer specifici per S. Inoltre, la colorazione blu all'anilina e la microscopia a fluorescenza seguita dall'impollinazione manuale forniscono prove del grado di compatibilità e incompatibilità. Anche la procedura di impollinazione semi in vivo, che prevede l'impollinazione manuale dei fiori in laboratorio14,15, è stata adattata per valutare i gradi di autocompatibilità e incompatibilità. Tuttavia, abbiamo anche utilizzato l'impollinazione sul campo seguita dall'insaccamento dei fiori per evitare la contaminazione da polline indesiderato per consentire ai tubi pollinici di svilupparsi in condizioni naturali. Questo protocollo è semplice e diretto e fornisce le informazioni necessarie per la selezione di successo degli alberi impollinatori adatti.

<table><tbody><tr><td>etanolo assoluto</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Blu anilina</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido borico, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia marrone</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di calcio tetraidrato, Ca(NO3) 2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Provetta centrifuga</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette per centrifuga</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0(CAS)</td><td></td></tr><tr><td>Dropping</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico, EDTA</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldeide</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Macinatore rapido per campioni completamente automatico</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>acido</td> <td>acetico glacialeSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di macinazione</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamilico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>etichetta</td><td>M & Fornitore verificato - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Shanghai Leica Co.,Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPIO Vetro di copertura</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>graffette</td><td>M& Fornitore verificato - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matita</td><td>M& Fornitore verificato - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spazzola per impollinatori</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole, PEG 6000</td><td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di potassio, KNO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, NAOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>carta solfato</td><td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostato bagno d'acqua</td><td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tripotassico tribasico triidrato, K3PO4</td><td>Shanghai Lingfeng Reagente chimico Co., Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>sacchetti con chiusura a zip</td><td>M & Fornitore verificato - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione delle relazioni di auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo s

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Gli agrumi utilizzano l'auto-incompatibilità basata sulla S-RNasi per respingere l'auto-polline e, pertanto, richiedono alberi impollinatori vicini per un'impollinazione e una fecondazione di successo. Tuttavia, identificare le varietà adatte a fungere da impollinatori è un processo che richiede tempo. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo rapido per identificare le cultivar di agrumi compatibili con l'impollinazione che utilizza l'elettroforesi su gel di agarosio e la colorazione blu all'anilina. La compatibilità del polline viene determinata sulla base dell'identificazione dei genotipi S estraendo il DNA totale ed eseguendo saggi di genotipizzazione basati sulla PCR con primer specifici. Inoltre, gli stili vengono raccolti 3-4 giorni dopo l'impollinazione manuale e viene eseguita la colorazione blu all'anilina. Infine, lo stato di crescita dei tubi pollinici viene osservato con un microscopio a fluorescenza. La compatibilità e l'incompatibilità del polline possono essere stabilite osservando se la crescita del tubo pollinico è normale o soppressa, rispettivamente. Grazie alla sua semplicità ed economicità, questo metodo è uno strumento efficace per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline di diverse varietà di agrumi per stabilire gruppi di incompatibilità e relazioni di incompatibilità tra diverse cultivar. Questo metodo fornisce informazioni essenziali per la selezione di successo di alberi impollinatori adatti e, quindi, facilita la creazione di nuovi frutteti e la selezione di genitori appropriati per i programmi di allevamento.

Per gli esperimenti fatti qui, sono stati selezionati fiori maturi, le antere sono state raccolte, essiccate in un forno e il polline è stato germinato a 28 ° C per 12 ore. La vitalità del polline e i tassi di germinazione sono stati quantificati come mostrato nella Figura 1.
Gli agrumi sono stati impollinati manualmente e la compatibilità e l'incompatibilità del polline sono state valutate utilizzando la colorazione blu all'anilina e la microscopia a fluorescenza...

Questo protocollo fornisce un metodo rapido per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline nelle cultivar di agrumi.

Determinazione delle relazioni di auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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Questa tecnica può identificare in modo efficiente il genotipo S e identificare con precisione l'autoincompatibilità degli agrumi, fornendo le informazioni necessarie per la selezione di alberi impollinatori adatti. Questa è una tecnica efficiente in termini di tempo, semplice e affidabile per selezionare gli alberi genitori appropriati nei programmi di allevamento. Questa tecnica è semplice e facile da fare e fare esperimenti per la prima volta richiede pazienza e cura.L'identificazione del genotipo S e la progettazione del primer S-specifico richiedono maggiore attenzione e cura. A dimostrare la procedura sarà Yu Hu, uno studente laureato del mio laboratorio. Inizia la raccolta del polline portando il pomelo Majia, Citrus maxima, fiori al laboratorio.Raccogliere le antere usando una pinzetta e metterle in una piastra di Petri contenente carta da filtro. Asciugare i granelli di polline mettendo la capsula di Petri contenente le antere in un forno a 28 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'essiccazione, conservare il polline in un sacchetto ermetico con chiusura a zip Micro Centron contenente gel di silice che cambia colore.Chiudere il sacchetto ed etichettarlo con il nome della varietà di polline e la data di conservazione. Versare 300 microlitri del mezzo liquido nel tappo di un tubo da centrifuga da due millilitri e cospargere il polline in modo uniforme con l'aiuto di un pennello per impollinazione. Mettere il polline in una scatola nera umidificata e incubare a 28 gradi Celsius per 12 ore.Dopo l'incubazione, tagliare la punta superiore di un millimetro da una punta di pipetta da 1.000 microlitri e aspirare il polline con una piccola quantità di soluzione di coltura. Posizionare il polline al centro del vetrino del microscopio e coprirlo con un vetrino di copertura. Una volta fatto, osservare il campione con un microscopio invertito utilizzando un obiettivo 10X.Eseguire tre repliche indipendenti utilizzando approssimativamente la stessa densità di polline per ogni replica. Per l'impollinazione, utilizzare un pennello per l'impollinazione per diffondere una quantità sufficiente di polline vitale sulla superficie dello stigma, assicurandosi di non danneggiare il pistillo. Coprire i fiori impollinati con un sacchetto di carta solfato e prevenire l'impollinazione da pollini genotipicamente distinti sigillando il sacchetto con una graffetta.Scrivi il nome della specie e il numero e il tempo di impollinazione sull'etichetta. Appendere l'etichetta sui rami vicino ai fiori impollinati. Rimuovere i sacchetti di impollinazione circa tre o quattro giorni dopo l'impollinazione e raccogliere i fiori impollinati in sacchetti con chiusura a zip.Rimuovere immediatamente i petali, i recipienti e le ovaie dai fiori e immergere lo stigma fuso per modellare in un tubo di centrifuga contenente una soluzione fissativa appena preparata. Incubare lo stigma e lo stile nella soluzione fissativa durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, scartare la soluzione fissativa prima di lavare lo stigma e modellare due o tre volte in etanolo al 95%.Quindi, aggiungere una soluzione di etanolo al 70% allo stile, assicurandosi che il campione sia completamente immerso nella soluzione. Gli stili in questa fase possono essere conservati a quattro gradi Celsius per uno o due mesi. Per la colorazione blu all'anilina, lavare i campioni di stile conservati in etanolo al 70% con acqua distillata tre o quattro volte.Immergerlo in una soluzione di idrossido di sodio a quattro molari e sigillarlo prima di incubarlo in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per 60 minuti. Durante questa fase, il colore dello stile cambia da giallo-bianco a rosso-arancio. Quindi, immergere gli stili in acqua distillata.Dopo 30 minuti, scartare l'acqua distillata e lavare gli stili con acqua distillata tre o quattro volte o fino a quando il colore dello stile diventa giallo. Quindi, aggiungere il blu di anilina fino a quando il campione è immerso e incubare per 12 ore al buio. Osservare la crescita del tubo pollinico al microscopio a fluorescenza.Posizionare la diapositiva su un tavolo piano. Dividi lo stile in due metà lungo l'asse longitudinale usando un bisturi. Posizionare metà dello stile su un vetrino e aggiungere due o tre gocce di glicole polietilenico sulla superficie del vetrino.Quindi, coprirlo con un foglietto di copertura. Una volta fatto, posizionare il vetrino sul palco del microscopio sopra l'apertura e visualizzare utilizzando un obiettivo 10X. Utilizzare il filtro DAPI e osservare la crescita del tubo pollinico.Osserva cinque stili per ogni tipo di impollinazione. La vitalità del polline di Citrus maxima e i tassi di germinazione sono stati quantificati utilizzando la microscopia fluorescente. Il polline compatibile è germogliato con successo sulla superficie dello stigma e ha prodotto un tubo pollinico normale, che è cresciuto e alla fine ha portato alla fecondazione nell'ovaio.Al contrario, i tubi pollinici incompatibili sono cresciuti attraverso circa 2/3 dello stile e poi hanno smesso di crescere. L'elettroforesi su gel di agarosio ha rilevato il prodotto del DNA amplificato utilizzando i primer specifici del locus S. Ha mostrato l'amplificazione del prodotto del DNA tra 500 e 1.000 coppie di basi.È stato identificato il genotipo S corrispondente. Con questo metodo sono stati identificati 21 aplotipi S in diverse specie di agrumi. La fase di impollinazione è fondamentale.Solo l'impollinazione di successo può garantire la successiva osservazione dei tubi pollinici. La tecnica è stata utilizzata per analizzare i tratti di auto-incompatibilità e per esplorare e identificare le determinanti femminili dell'auto-incompatibilità. Questo metodo è importante per la ricerca sull'auto-incompatibilità e i programmi di allevamento.Può anche facilitare la comunità agricola per la selezione di alberi impollinatori per i loro frutteti.

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Determinazione delle relazioni di auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo S (Video) | JoVE Journal

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