Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato

L'epidemiologia a base d'acqua e delle acque reflue è emersa come metodo alternativo per monitorare e prevedere il corso delle epidemie nelle comunità. Il metodo di flocculazione del latte scremato rappresenta un approccio alternativo ai microbi concentrati. Il metodo di flocculazione del latte scremato rappresenta un metodo versatile, economico e facile per concentrare le frazioni microbiche senza differenze significative rispetto agli approcci di filtrazione a ultrafiltrazione o flusso tangenziale.

Questo approccio viene utilizzato per studi di metagenomica o PCR mirata. Una volta concentrate le frazioni microbiche, l'estrazione degli acidi nucleici può essere condotta utilizzando kit di estrazione commerciali o protocolli interni. Il metodo di flocculazione del latte scremato è relativamente più semplice per grandi o piccoli volumi di campioni di acqua o acque reflue.

Un controllo in background con acqua Milli-Q dovrebbe essere incluso come parte di questo metodo. A dimostrare la procedura saranno Kadir Yanac, Jhannelle Francis e Jocelyn Zambrano-Alvarado, studenti laureati del laboratorio di Miguel Uyaguari. Per iniziare, raccogliere due litri di campioni di acque reflue grezze composite proporzionali al flusso di 24 ore.

Trasportare i campioni al laboratorio in flaconi a prova di luce in una ghiacciaia ed elaborarli entro 24 ore. Ottieni i dati sulle caratteristiche delle acque reflue dal personale tecnico dell'impianto di trattamento delle acque reflue. Per ogni metodo di ultrafiltrazione, aumentare cinque volte 10 alla quarta copia di RNA corazzato in 140 millilitri di ciascuno dei sei campioni di acque reflue fresche raccolti in una data e sei campioni di acque reflue fresche in un'altra data.

Omogeneizzare l'RNA corazzato nel campione agitando per 30 minuti a quattro gradi Celsius su un movimento magnetico. Per la flocculazione del latte scremato o SMF, preparare la soluzione di latte scremato all'1% sciogliendo 0,5 grammi di latte scremato in polvere in 50 millilitri di acqua di mare sintetica. Regolare il pH di SMF a 3,5 utilizzando un acido cloridrico normale.

Aggiungere cinque millilitri di soluzione di latte scremato a 500 millilitri di campione di acque reflue grezze. Mescolare il campione per otto ore e lasciare che gli stormi formati si depositino per altre otto ore a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante usando una pipetta sierologica senza disturbare gli allevamenti stabili.

Trasferire un volume finale di 50 millilitri contenente i greggi in una provetta da centrifuga e centrifugare a 8.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e rottamare accuratamente il pellet usando una spatola sterilizzata. Risospendere il pellet rimanente in 250 microlitri di tampone fosfato sodico 0,2 molare.

Trasferire il pellet raschiato e risospeso nello stesso mini tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Eseguire l'estrazione dell'RNA virale da concentrati virali di campioni di acque reflue e saggi di efficienza di recupero utilizzando un kit di estrazione dell'RNA con un rapporto 25: 24: 2: 1 di fenolo e cloroformio all'alcol isoamilico e beta mercaptoetanolo secondo le istruzioni del produttore. Infine, eluire l'RNA in 50 microlitri di tampone di eluizione.

Per l'analisi RT-qPCR, quantificare l'RNA corazzato utilizzando diluizioni dieci volte superiori di un DNA sintetico a singolo filamento o di un costrutto gBlock. Ottenere curve di calibrazione per ogni esecuzione RT-qPCR. Includi controlli negativi ed esegui i campioni in triplice copia.

Raccogliere 10 litri di campione di acqua superficiale ambientale. Includere 10 litri di acqua deionizzata per il controllo dello sfondo. Eseguire la filtrazione in capsule e sotto vuoto utilizzando filtri a disco a membrana di dimensioni di 0,45, 0,2 e 0,1 micron per ridurre al minimo il rumore durante il sequenziamento della metagenomica.

Dopo la filtrazione, regolare il pH del campione d'acqua a 3,5 utilizzando un acido cloridrico normale. Preparare una soluzione di latte scremato preflocculata all'1% e regolare il pH a 3,5. Aggiungere 100 millilitri della soluzione acidificata di latte scremato a 10 litri di campione di acqua ambientale acidificata.

Agitare il campione per otto ore a temperatura ambiente su uno shaker magnetico e lasciare sedimentare gli stormi per gravità per altre otto ore. Dopo la sedimentazione, rimuovere con cura il surnatante utilizzando una pompa per vuoto senza disturbare le greggi. Aliquote e bilanciare i greggi rimanenti in base al peso in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e centrifuga.

Rimuovere il surnatante e sciogliere il pellet in 200 microlitri di tampone fosfato sodico 0,2 molare. Trattare i pellet disciolti con DNasi I e RNasi A seguendo le istruzioni del produttore per eliminare il DNA libero e l'RNA coprecipitati durante il processo di estrazione. Dopo l'incubazione, inattivare la DNasi I e la RNasi A.Estrarre gli acidi nucleici dal pellet disciolto utilizzando un kit di estrazione del DNA o dell'RNA.

Quantificare la quantità totale di DNA o RNA estratto dal campione di acqua superficiale ambientale utilizzando un fluorometro. Eseguire l'analisi qPCR per colpire i virus enterici di interesse e il sequenziamento Illumina per identificare la struttura della comunità virale. Raccogliere due litri di campioni d'acqua da corsi d'acqua protetti e impattati.

Se il campione contiene detriti considerevoli, utilizzare una garza per rimuoverli. Aggiungere 20 millilitri di soluzione di latte scremato all'1% al campione di acqua dolce da due litri precedentemente regolato per il pH. Agitare il campione per otto ore a temperatura ambiente e lasciare sedimentare gli stormi per gravità per altre otto ore.

Dopo la sedimentazione, rimuovere con attenzione il surnatante usando una pompa peristaltica. Trasferire gli stormi sedimentati in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e centrifugarli a 8.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone fosfato sodico 0,2 molare.

Selezionare circa 0,5 grammi di gregge per l'estrazione del DNA utilizzando il kit di isolamento degli acidi nucleici di scelta seguendo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando un fluorometro. Tutti e sei i campioni trattati con ultrafiltrazione a 3.000 G sono risultati positivi.

Al contrario, solo un campione è risultato positivo quando i campioni sono stati elaborati con ultrafiltrazione a 7.500 G.Tutti i campioni trattati con SMF sono risultati positivi e hanno portato a un migliore recupero. I tassi medi di recupero di 3.000 G e SMF erano significativamente e costantemente superiori all'ultrafiltrazione a 7.500 G.I parametri di qualità dell'acqua nei campioni influenzati e negli acidi nucleici estratti da campioni di acqua ambientale raccolti a Winnipeg in tre stagioni sono riassunti qui. I campioni raccolti da aprile a ottobre 2022 dall'acqua del fiume Assiniboine hanno prodotto la più alta concentrazione di DNA da Forested 1 e la concentrazione più bassa è stata recuperata dal sito agricolo tre.

È molto importante utilizzare la giusta concentrazione di latte scremato e acidificare il campione prima dell'uso. Questa tecnica può fornire un rapido screening di diversi patogeni microbici presenti in campioni ambientali come acqua e acque reflue. Ulteriori modifiche possono essere implementate utilizzando matrici solide come suolo o sedimenti.