Name: Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Scopri la fluoro-respirometria ad alta risoluzione per studiare la funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino. Questo metodo misura l'efficienza mitocondriale confrontando il consumo di ossigeno con la produzione di ATP e specie reattive dell'ossigeno.

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Gli autori desiderano riconoscere il generoso sostegno della John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e della Grayson Jockey Club Research Foundation.

Questo studio è stato approvato dall'Oklahoma State University Institutional Animal Care and Use Committee. Quattro castoni purosangue (17,5 ± 1,3 anni, 593 ± 45 kg) sono stati utilizzati in questo studio per generare i risultati rappresentativi.
1. Ottenere un campione di biopsia del muscolo scheletrico
<ol><li>Ottenere biopsie muscolari scheletriche (seguire la tecnica sterile) dal centro del muscolo semitendinoso (o altro muscolo di interesse), utilizzando un ago da biopsia 12 G University College Hospital (UCH) (vedi tabella dei materiali) mentre si è sotto sedazione leggera e utilizzando l'anestesia locale a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato11.</li>
	<li>Trasferire immediatamente i campioni bioptici in flaconcini con soluzione di mezzo di trasporto per biopsia ghiacciata (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazolo, 20 mM taurina, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotreitolo, 6,56 mM MgCl 2, 5,77 mM ATP e 15 mM fosfocreatina, regolati a pH 7,1; vedere Tabella dei materiali). Trasporto al laboratorio per le analisi. NOTA: Fare riferimento a Doerrier et al.15 per istruzioni specifiche sulla preparazione dei mezzi di trasporto della biopsia.</li>
	<li>Isolare i mitocondri dai campioni bioptici utilizzando un kit commerciale, secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Il buffer di stoccaggio finale non deve contenere substrati come ADP, ATP e succinato, che fanno parte del saggio respirometrico.</li>
	<li>Risospendere il pellet finale dei mitocondri isolati utilizzando 80 μL di mezzi di sospensione (225 mM di mannitolo, 75 mM di saccarosio e 1 mM di EGTA; vedere Tabella dei materiali) per 100 mg di muscolo utilizzato per l'isolamento dei mitocondri.</li>
	<li>Ridurre al minimo l'intervallo dal momento della procedura di biopsia all'isolamento dei mitocondri e mantenere i campioni a 0-4 °C durante le fasi di lavorazione fino ad aggiungerli ai respirometri ad alta risoluzione. NOTA: Studi preliminari hanno rilevato che le sospensioni di mitocondri isolati iniziano a perdere capacità funzionale dopo circa 2 ore quando mantenute a 0-4 °C.</li>
</ol>2. Messa a punto del respirometro ad alta risoluzione
<ol><li>I respirometri ad alta risoluzione vengono utilizzati per quantificare la respirazione mitocondriale e i processi associati. Utilizzare il programma di controllo software fornito dal produttore (vedere Tabella dei materiali) per controllare il respirometro, calibrare i sensori e raccogliere dati grezzi. Analizzare i campioni in duplicato per ogni condizione di test. NOTA: In tutti i casi, le titolazioni raccomandate e le concentrazioni finali di reagenti descritte in questo protocollo si basano su una camera respirometrica da 2 ml.</li>
	<li>Determinare il flusso di fondo O 2 e il punto zero del sensore O 2 ogni2-4 settimane attraverso la titolazione seriale della ditionite, seguendo le istruzioni del produttore. Conservare queste costanti di calibrazione per i test successivi fino a quando la calibrazione non viene ripetuta. NOTA: A differenza delle procedure precedentemente pubblicate che utilizzano fibre muscolari permeabilizzate11,12,13,16, in cui è necessaria iperossia (250-500 μM) per evitare la limitazione della diffusione di O 2 ai mitocondri, i mitocondri isolati possono essere valutati utilizzando un intervallo di 50-200 μM O 2. Ciò può essere ottenuto semplicemente consentendo al mezzo respiratorio di equilibrarsi con l'aria ambiente prima di aggiungere la sospensione mitocondriale (cioè, dopo la calibrazione giornaliera a punto singolo). Allo stesso modo, la riossigenazione della camera respiratoria può essere effettuata semplicemente aprendo la camera fino a quando sufficiente ossigeno ambientale si è dissolto nel mezzo respirometrico per aumentare la concentrazione di ossigeno al livello desiderato.</li>
	<li>Riempire le camere respirometriche con mezzi privi di magnesio (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lattobionato, 20 mM taurina, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM saccarosio e 1 g/L di albumina sierica bovina [BSA] essenzialmente priva di acidi grassi, regolata a pH 7,1; vedi tabella dei materiali). NOTA: Fare riferimento a Komlodi et al.17 per istruzioni specifiche sulla preparazione dei mezzi di respirazione.<ol><li>Impostare la temperatura di incubazione dello strumento a 38 °C per rappresentare la temperatura basale del muscolo scheletrico equino e impostare la miscelazione dei mezzi respiratori a 800 giri / min utilizzando un agitatore magnetico che ruota sul fondo della camera respirometrica.</li>
		<li>Spegnere l'illuminazione della camera per evitare interferenze con i sensori fluorescenti.</li>
		<li>Energizzare l'elettrodo di ossigeno con una tensione di polarizzazione di 800 mV e amplificare il segnale risultante con un'impostazione di guadagno di 1.</li>
		<li>Registrare la concentrazione di ossigeno ogni 2 s, calcolare il flusso di ossigeno come pendenza negativa della misurazione dell'ossigeno nei 40 s precedenti (20 punti dati) e riferire come pmol x s-1 x mL di soluzione di incubazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrare il sensore di ossigeno consentendo al fluido di equilibrarsi con l'aria ambiente. Calcolare la pressione parziale dell'ossigeno di riferimento, in base alla pressione barometrica misurata dal respirometro ad alta risoluzione e alla concentrazione standard di ossigeno atmosferico.</li>
</ol>3. Misurazione del potenziale di membrana mitocondriale mediante TMRM
<ol><li>Utilizzare sensori fluorescenti "verdi" (lunghezza d'onda dominante di 530 nm) per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria. Energizzare i sensori a 400-500 mV; Il segnale risultante viene amplificato con un guadagno di 1:1.000. NOTA: le impostazioni specifiche devono essere ottimizzate per i singoli strumenti per acquisire il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore.</li>
	<li>Aggiungere TMRM (4 μL di soluzione da 1 mM per una concentrazione finale di 2 μM; vedere Tabella dei materiali) prima dell'aggiunta di mitocondri.</li>
	<li>Calibrare il segnale fluorescente utilizzando una semplice calibrazione a due punti del segnale fluorescente (tensione) rispetto alla quantità di fluoroforo aggiunto (mM), prima dell'aggiunta dei mitocondri. NOTA: utilizzare la funzione di calibrazione del segnale fluorescente nel software di controllo della macchina per calibrare questo segnale. Il segnale grezzo della sonda fluorescente può richiedere 30 minuti o più per stabilizzarsi al fine di registrare il secondo punto della calibrazione.</li>
	<li>Eseguire la calibrazione finale del segnale TMRM dopo il completamento del protocollo di titolazione respirometrica erogando diverse titolazioni dell'agente disaccoppiante (cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone; 2 μL per titolazione) fino a quando non si osservano ulteriori aumenti del segnale fluorescente TMRM, indicando il completo collasso del potenziale di membrana mitocondriale (Figura 1). NOTA: Questo valore del segnale fluorescente è considerato uguale al potenziale transmembrana di 0 mV e utilizzato come punto di riferimento per i valori di potenziale di membrana relativi registrati durante il protocollo di titolazione respirometrica.</li>
</ol>4. Misurazione della produzione di ATP utilizzando il verde magnesio (MgG)
<ol><li>Utilizzare sensori fluorescenti "blu" (lunghezza d'onda dominante 465 nm) per quantificare il segnale fluorescente dalla camera respiratoria. Energizza questi sensori per i singoli strumenti per catturare il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore.</li>
	<li>Eseguire la configurazione chimica e la calibrazione del segnale fluorescente MgG dopo l'aggiunta dei mitocondri, ma prima dell'aggiunta di qualsiasi substrato. Aggiungere 8 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 2 mM alla camera respirometrica per chelare cationi (in particolare Ca 2+) che competerebbero con Mg2+ per legarsi a MgG, quindi aggiungere 4 μL di 1 mM MgG (1,1 μM) alla camera di respirazione.</li>
	<li>Calibrare il segnale di fluorescenza grezzo con titolazioni sequenziali 10 x 2 μL di 100 mM MgCl 2, consentendo 1 minuto tra le titolazioni per la stabilizzazione del segnale fluorescente (Figura 2). NOTA: Questo processo, che viene completato offline dopo il completamento del test e utilizzando i modelli forniti dal produttore della macchina e dal software associato, produce una curva di secondo ordine della concentrazione di magnesio al segnale fluorescente (previsto r2 > 0,98), che verrà utilizzato con una quantità nota di ADP aggiunta alla camera respirometrica e i valori Kd precedentemente determinati per determinare la concentrazione corrispondente di ATP11.</li>
	<li>Determinare il tasso di sintesi di ATP, che è la pendenza della concentrazione di ATP nel tempo in tutto il protocollo (Figura 3).</li>
</ol>5. Misurazione della produzione mitocondriale di ROS utilizzando Amplex UltraRed (AmR)
<ol><li>Utilizzare sensori fluorescenti "verdi" (lunghezza d'onda dominante di 530 nm) per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria. Energizzare i sensori a 300-400 mV; Il segnale risultante viene amplificato con un guadagno di 1:1.000. Ottimizza impostazioni specifiche per i singoli strumenti per acquisire il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore. NOTA: Se si utilizza un mezzo respiratorio senza MgCl 2, questo deve essere aggiunto (20-60 μL di 100 mM MgCl 2 per produrre 1-3 μM MgCl2) prima di aggiungere reagenti per il test AmR.</li>
	<li>Eseguire la configurazione chimica e la calibrazione iniziale del test AmR prima dell'aggiunta dei mitocondri. Aggiungere 30 μmoli di DTPA (6 μL di soluzione da 5 mM) ai cationi chelati che potrebbero interferire con la reazione, quindi aggiungere superossido dismutasi (2 μL di una soluzione madre da 5.000 U/mL per convertire gli anioni superossido in H 2 O2per una rilevazione più completa della generazione di ossigeno reattivo), perossidasi di rafano (5 μL di una soluzione madre di 500 U/mL), e Amplex UltraRed (2 μL di una soluzione madre da 10 mM) (vedere Tabella dei materiali) per produrre rispettivamente 5 U/mL, 1 U/mL e 10 μM nella camera respirometrica.</li>
	<li>Lasciare stabilizzare il segnale fluorescente, quindi aggiungere 0,2 μmoli di perossido di idrogeno (5 μL di una soluzione da 40 μM fatta fresca ogni giorno) due volte, a circa 5 minuti di distanza. NOTA: Il segnale fluorescente prima e dopo le due titolazioni di H 2 O 2 fornisce una curva di calibrazione lineare a tre punti del sistema (prevista r 2 > 0,95), la cui pendenza riflette la reattività complessiva del sistema nel riportare la relazione tra il segnale fluorescente e la produzione (o aggiunta) di H 2 O 2. Utilizzare la funzione di calibrazione del segnale fluorescente nel software di controllo della macchina per calibrare questo segnale.</li>
	<li>Eseguire ulteriori calibrazioni a due punti (5 μL di una soluzione da 40 μM fatta fresca ogni giorno) durante il test, per consentire la regolazione della reattività del saggio man mano che la chimica della respirometria cambia durante il test, con la tempistica specifica di questi punti di calibrazione a discrezione dello sperimentatore (Figura 4).</li>
</ol>6. Misurazione della respirazione mitocondriale
<ol><li>Aggiungere 15 μL di sospensione mitocondriale isolata (fase 1.4) a ciascuna camera di incubazione da 2 ml, in modo che i risultati rappresentino la resa mitocondriale di 18,75 mg di muscolo. Sigillare la camera di incubazione. Vortice del campione tra ogni titolazione per mantenere una sospensione uniforme del campione.</li>
	<li>Misurare il consumo di ossigeno residuo (ROX) prima dell'aggiunta di qualsiasi substrato. Sottrarre questo valore (tipicamente inferiore a 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) dai valori di consumo di ossigeno di ciascuna fase del protocollo di titolazione substrato/disaccoppiatore/inibitore (SUIT) dopo il completamento del protocollo. NOTA: È fondamentale che i segnali provenienti sia dal sensore di ossigeno che dal sensore di fluorescenza possano stabilizzarsi per almeno 1 minuto (come valutato dalla pendenza calcolata stabile dei segnali del sensore primario), poiché lo stato generale della respirazione viene modificato dalle titolazioni per ottenere risultati affidabili. Questo vale per tutte le fasi di titolazione.</li>
	<li>Utilizzare una SUIT generica che consenta la caratterizzazione iniziale della funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino. Iniziare con titolazioni sequenziali di piruvato (5 μL di soluzione acquosa 2 M), glutammato (10 μL di soluzione acquosa 2 M) e malato (10 μL di soluzione acquosa 0,4 M) (vedere Tabella dei materiali) in ciascuna camera per produrre nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e stimolare la respirazione non fosforilante (perdita) supportata dal NADH ossidato attraverso il complesso I (LN) (Figura 1, Figura 3 e Figura 4).</li>
	<li>Aggiungere ADP (20 μL di soluzione acquosa da 500 mM; vedi Tabella dei materiali) per stimolare la respirazione fosforilante attraverso il Complesso I (PN).</li>
	<li>Aggiungere succinato (20 μL di soluzione acquosa 1 M; vedi Tabella dei materiali) per produrre la respirazione fosforilante attraverso la combinazione del complesso I e del complesso II (PN+S). NOTA: Con la combinazione della respirazione attraverso il Complesso I e il Complesso II, il consumo di ossigeno può essere abbastanza elevato da consumare la maggior parte dell'ossigeno disciolto nei mezzi di incubazione. Se la concentrazione di O 2 scende al di sotto di 50 μM, riossigenare il mezzo di incubazione togliendo la camera di incubazione fino a quando la concentrazione di O 2 misurata è aumentata oltre 150 μM. Ripetere questo passaggio se necessario per mantenere sufficiente O2 per la respirazione mitocondriale.</li>
	<li>Aggiungere rotenone (2 μL di soluzione di etanolo 0,1 mM; vedere Tabella dei materiali) per bloccare il complesso I. Il flusso di ossigeno risultante rappresenta la capacità del Complesso II di supportare il consumo di ossigeno mitocondriale attraverso l'ossidazione del solo succinato (PS). ATTENZIONE: Il rotenone è una sostanza velenosa. Utilizzare la sicurezza di laboratorio standard ed evitare l'ingestione o l'inalazione.</li>
	<li>Calcolare il valore medio per una data condizione sperimentale attraverso singole camere respirometriche contenenti aliquote di una singola biopsia. NOTA: I calcoli derivati, come i rapporti di controllo del flusso (FCR), sono preziosi per identificare i cambiamenti relativi nei diversi percorsi e includono FCRLeak (L N/P N), FCR N (P N/P N+S) e FCR S (PS/P N+S). L'efficienza di fosforilazione ossidativa calcolata (1-LN/PN+S) fornisce una stima dell'impatto complessivo della respirazione a perdita aggiustata per la capacità respiratoria totale.</li>
</ol>

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<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenergetic+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo manoscritto.

L'aggiunta di segnali fluorescenti all'uscita standard del respirometro ad alta risoluzione fornisce preziose informazioni sulla fisiologia mitocondriale, ma una calibrazione meticolosa del segnale fluorescente è fondamentale per i dati di qualità. I protocolli originali per l'uso di MgG suggeriscono che le curve di calibrazione generate durante il calcolo delle costanti di dissociazione magnesio-adenilato potrebbero essere applicate ai saggi successivi4; tuttavia, il segnale fluorescente provenie...

I mitocondri delle cellule eucariotiche producono la maggior parte dell'ATP utilizzato dalle cellule per il lavoro e il mantenimento1. Un passo chiave nella produzione mitocondriale di ATP è la conversione dell'ossigeno in acqua, e quindi la capacità metabolica dei mitocondri e delle cellule associate è spesso quantificata attraverso la misurazione del consumo di ossigeno2. Tuttavia, la fisiologia mitocondriale è più complessa del semplice processo di consumo di ossigeno e la dipendenza da questo endpoint fornisce esclusivamente una valutazione incompleta dell'impatto della funzione e della disfunzione mitocondriale sulla salute cellulare. La caratterizzazione completa della funzione mitocondriale richiede la valutazione non solo del consumo di ossigeno, ma anche della produzione di ATP e delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).
Ulteriori misure delle funzioni mitocondriali chiave possono essere eseguite in concomitanza con la misurazione della respirazione attraverso l'uso di fluorofori specifici. Il tetrametilrodamina metilestere (TMRM) è un fluoroforo cationico che si accumula nella matrice mitocondriale in proporzione al potenziale di tensione transmembrana mitocondriale, con conseguente diminuzione dell'intensità fluorescente dovuta a questo accumulo3. La TMRM può essere utilizzata come indicatore dei cambiamenti relativi nel potenziale di membrana mitocondriale o può essere utilizzata per quantificare cambiamenti precisi nella tensione transmembrana con ulteriori esperimenti per determinare costanti che consentano la conversione del segnale fluorescente in mV. Il verde di magnesio (MgG) è un fluoroforo che fluoresce quando si lega con Mg2+ e viene utilizzato per misurazioni della sintesi di ATP basate sull'affinità differenziale di ADP e ATP per il catione bivalente di magnesio4. I ricercatori devono determinare le costanti di affinità/dissociazione specifiche (Kd) sia per ADP che per ATP in specifiche condizioni analitiche per convertire le variazioni della fluorescenza di MgG in una variazione della concentrazione di ATP. Amplex UltraRed (AmR) è il fluoroforo utilizzato per misurare la produzione di perossido di idrogeno e altri ROS durante la respirazione mitocondriale5. La reazione tra H2 O2 e AmR (che è catalizzata dalla perossidasi di rafano) produce resorufina, che è rilevabile attraverso la fluorescenza a 530 nM. Ciascuno di questi test può essere aggiunto individualmente ai saggi di respirazione mitocondriale in tempo reale, per fornire misurazioni simultanee dei rispettivi aspetti della fisiologia mitocondriale, fornendo così un collegamento diretto tra respirazione e output mitocondriale.
I cavalli sono capaci di tassi molto elevati di consumo di ossigeno specifico per massa, dovuto in parte all'altissimo contenuto mitocondriale del muscolo scheletrico equino, rendendo questo tessuto altamente rilevante per lo studio della fisiologia mitocondriale. Con lo sviluppo della respirometria ad alta risoluzione, gli studi che utilizzano questa nuova tecnologia hanno contribuito a definire i contributi dei mitocondri del muscolo scheletrico equino sia alla notevole capacità di esercizio dei cavalli che alla fisiopatologia delle malattie del muscolo scheletrico 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Gli studi sulla funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino sono particolarmente vantaggiosi, in quanto l'ottenimento di grandi quantità di questo tessuto non è terminale. Pertanto, i soggetti equini possono non solo fornire tessuto sufficiente per la caratterizzazione completa della funzione mitocondriale, ma anche servire come controlli longitudinali per studi meccanicistici di alta qualità sulla fisiologia mitocondriale. Per questo motivo, sono stati sviluppati ulteriori saggi per quantificare il potenziale di membrana mitocondriale, la sintesi di ATP e la produzione di ROS che completano la misurazione del consumo di ossigeno in questo tessuto, al fine di fornire una caratterizzazione più robusta della fisiologia mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Life Technologies</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di calcio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DatLab 7.0</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td>Software per il funzionamento del fluororespirometro O2K</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DTPA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>D1133</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi di rafano</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>516813</td><td>Deve essere preparato fresco ogni giorno prima del saggio</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma)</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K-MES</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M3733</td><td></td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich ( Kit</td> di isolamento mitocondriale MilliporeSigma)<td>M9647</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>MITOISO1</td><td></td></tr><tr><td>O2K fluororespirometro</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td>Sono necessarie più unità per eseguire contemporaneamente l'intero spettro di saggi.</td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Lattobionato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>L2398</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P2256</td><td>Deve essere preparato fresco ogni giorno prima del saggio</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Superossido dismutasi</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>S8160</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di titolazione</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe di titolazione</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>T5428</td><td></td></tr><tr><td>UCH ago per biopsia</td><td>Millenium Surgical Corp</td><td>72-238067</td><td>Disponibile in una gamma di dimensioni</td></tr></tbody></table>

fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

La funzione mitocondriale - fosforilazione ossidativa e generazione di specie reattive dell'ossigeno - è fondamentale sia per la salute che per la malattia. Pertanto, misurare la funzione mitocondriale è fondamentale nella ricerca biomedica. Il muscolo scheletrico è una robusta fonte di mitocondri, in particolare negli animali con una capacità aerobica molto elevata, come i cavalli, rendendoli soggetti ideali per lo studio della fisiologia mitocondriale. Questo articolo dimostra l'uso della respirometria ad alta risoluzione con fluorometria concomitante, con mitocondri muscolari scheletrici appena raccolti, per quantificare la capacità di ossidare i substrati in diversi stati mitocondriali e determinare le capacità relative di elementi distinti della respirazione mitocondriale. L'estere metilestrale tetrametilrodamina viene utilizzato per dimostrare la produzione di potenziale di membrana mitocondriale derivante dall'ossidazione del substrato, compreso il calcolo dell'efficienza relativa dei mitocondri calcolando il potenziale di membrana relativo generato per unità di flusso concomitante di ossigeno. La conversione di ADP in ATP provoca un cambiamento nella concentrazione di magnesio nella camera di reazione, a causa delle diverse affinità degli adenilati per il magnesio. Pertanto, il verde magnesio può essere utilizzato per misurare la velocità di sintesi dell'ATP, consentendo l'ulteriore calcolo dell'efficienza di fosforilazione ossidativa (rapporto tra fosforilazione e ossidazione [P/O]). Infine, l'uso di Amplex UltraRed, che produce un prodotto fluorescente (resorufin) quando combinato con perossido di idrogeno, consente la quantificazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno durante la respirazione mitocondriale, nonché la relazione tra produzione di ROS e respirazione concomitante. Queste tecniche consentono la robusta quantificazione della fisiologia mitocondriale in una varietà di diverse condizioni simulate, facendo così luce sul contributo di questa componente cellulare critica sia alla salute che alla malattia.

Lo stato di riferimento proposto è quello di un purosangue sedentario sano (nessun aumento della forma fisica dovuto all'esercizio fisico obbligatorio) e di un campione muscolare fresco raccolto dal centro di un muscolo posturale, contenente un'alta percentuale di fibre muscolari scheletriche di tipo I ricche di mitocondri e incubato in condizioni che si avvicinano al metabolismo a riposo (cioè 38 °C e pH 7,0). In queste condizioni, lo sperimentatore può aspettarsi valori di L N di 2,71 ± 0,90, valori di P N d...

I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Questi protocolli consentono ai ricercatori di andare oltre la semplice misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale e consentono invece la misurazione dei principali prodotti finali mitocondriali, ATP e specie reattive dell'ossigeno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il ricercatore può misurare l'efficienza mitocondriale confrontando direttamente il tasso di consumo di ossigeno con il tasso di produzione del prodotto finale. Se il prodotto finale è ATP o ossigeno reattivo.Le tecniche richiedono un'attenzione molto attenta ai dettagli, in particolare per evitare le bolle. Che si trovino nella camera di respirazione o nelle siringhe di titolazione, le bolle sono il tuo nemico perché rendono le misurazioni meno precise. Dopo aver ottenuto le biopsie muscolari scheletriche.Riempire le camere respirometriche con supporti privi di magnesio e sigillare la camera di incubazione. Impostare la temperatura di incubazione dello strumento a 38 gradi Celsius per rappresentare la temperatura basale del muscolo scheletrico equino. E impostare la miscelazione del mezzo di respirazione a 750 giri / min utilizzando un movimento magnetico girando sul fondo della camera respirometri

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Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

Qui, un campione di muscolo quadricipite viene prelevato da un maiale anestetizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Quindi, le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV vengono determinate utilizzando la respirometria ad alta risoluzione.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Questo protocollo presenta una raccolta di dati geometrici sarcomere, calcio e macroscopici da una trabecola cardiaca attivamente contratta ex vivo. Queste misurazioni simultanee sono rese possibili dall'integrazione di tre modalità di imaging.

Imaging tomografico simultaneo a campo luminoso, fluorescenza e coerenza ottica di trabecole cardiache contraenti ex vivo

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.

Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Scopri la fluoro-respirometria ad alta risoluzione per studiare la funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino. Questo metodo misura l'efficienza mitocondriale confrontando il consumo di ossigeno con la produzione di ATP e specie reattive dell'ossigeno.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

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