Name: Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Scopri la quantificazione delle modificazioni degli istoni nella microglia cerebrale di topo mediante citometria a flusso intranucleare. Questo metodo rapido consente analisi epigenetiche ad alto rendimento per studiare i disturbi del neurosviluppo.

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Grazie a Yanyang Bai per l'aiuto con l'immunoblot nella Figura 5. Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti canadesi per la ricerca sulla salute [CRC-RS 950-232402 to AC]; Consiglio canadese per la ricerca in scienze naturali e ingegneria [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 a AC]; Fondazione di beneficenza del rito scozzese [da 21103 ad AC] e la Fondazione Brain Canada [AWD-023132 ad AC]; Borsa di studio per laureati aborigeni dell'Università della British Columbia (da 6481 a MT); Borsa di studio per laureati della Columbia Britannica (da 6768 a MT); Premio canadese per studenti della piattaforma Open Neuroscience (da 10901 a JK); Borsa di dottorato quadriennale dell'Università della British Columbia (da 6569 a JK). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Quantificazione della modifica degli istoni nel cervello di topo mediante citometria a flusso

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato consente la valutazione quantitativa dei livelli globali di HPTM attraverso la citometria a flusso. Sebbene questo protocollo presenti un metodo innovativo, studi precedenti hanno effettuato una valutazione quantitativa delle proteine utilizzando un approccio simile26. I metodi precedentemente utilizzati per valutare i livelli globali di HPTM includono l'immunoistochimica e il western blot 16,17,19,20. Il metodo basato sulla citometria a flusso presentato è un metodo facilmente quantificabile, mentre il western blot e l'immunoistochimica sono semiquantitativi e hanno una produttività inferiore. Il Western blot si basa sulla lisi cellulare e quindi richiede sia la normalizzazione della proteina che una proteina di controllo del carico che si presume sia invariata dalla condizione sperimentale27. L'immunoistochimica è semiquantitativa e a bassissimo rendimento, in quanto è difficile valutare quantitativamente la quantità di proteine senza esaminarla a livello di singola cellula16. Allo stesso modo, per la microglia isolata, c'è un vantaggio nell'utilizzare il metodo della citometria a flusso a causa della resa limitata, poiché il western blot richiede un apporto proteico molto più grande19. I bassi requisiti di numero di celle consentono di eseguire più pannelli di colorazione dallo stesso animale.
Tuttavia, come con qualsiasi altro metodo, ci sono limitazioni a questa tecnica, tra cui il costo e la disponibilità degli anticorpi, poiché non tutti gli anticorpi funzionano bene in un contesto di citometria a flusso. Inoltre, rispetto all'immunoblot, la concentrazione di anticorpi richiesta è molto più alta. Mentre il multiplexing consente di utilizzare più anticorpi sullo stesso pannello di cellule, le cellule non possono essere private dell'anticorpo dopo l'analisi, limitando così l'uso delle cellule a uno per specie di anticorpi. Questo è diverso dall'immunoblot in cui lo stesso blot può essere utilizzato ripetutamente. Tuttavia, a seconda della disponibilità di anticorpi e del numero di canali di rilevamento su un citometro, sarebbe possibile esaminare fino a una dozzina di segni contemporaneamente.
Il metodo attuale cattura solo i livelli globali di espressione proteica e non la posizione genomica specifica, e i cambiamenti nei livelli globali potrebbero non riflettere i cambiamenti nei singoli loci genomici. Allo stesso modo, la mancanza di cambiamenti nei livelli globali potrebbe non significare che nessun loci genomico stia subendo cambiamenti, ma semplicemente che i cambiamenti globali non comportano differenze tra i trattamenti. In quanto tale, questa tecnica è pensata per essere utilizzata come schermo per identificare HPTM di interesse per l'analisi genomica. Inoltre, questo metodo non consente il confronto tra diversi marcatori proteici, tranne quando viene valutato come un cambiamento di piega per il controllo. Pertanto, questo è limitato rispetto a un metodo standard basato su curve come l'ELISA per la determinazione delle proteine.
Il protocollo presentato offre una strategia per isolare la microglia cerebrale viva. Questo protocollo si basa sull'espressione della proteina P2RY12 per l'isolamento della microglia. Tuttavia, P2RY12 è un marcatore omeostatico nella microglia e può essere sottoregolato in modelli di malattia, come 5XFAD22. Pertanto, quando si utilizza un animale modello di malattia, assicurarsi di scegliere altre proteine marcatrici come TMEM119, CD11b o CD45 per aiutare nell'isolamento della microglia23. Allo stesso modo, presentiamo questo protocollo come isolamento dall'ippocampo e/o dalla corteccia. Questo protocollo funzionerebbe per isolare la microglia da altre regioni del cervello, comprese le regioni della sostanza bianca, tuttavia, potrebbero essere necessari più animali per ottenere una quantità sufficiente di microglia a seconda delle dimensioni delle regioni di interesse.
Il protocollo presentato è in grado di isolare in modo robusto la microglia cerebrale viva, ma ci sono diversi passaggi, descritti di seguito, nella fase di isolamento che possono ridurre la resa cellulare se eseguiti in modo errato.
Le perfusioni per questo protocollo si traducono in una percentuale maggiore di microglia nel frammento arricchito di immuni, che ridurrà la quantità di tempo al selezionatore. Tuttavia, la perfusione non è richiesta e, se necessario, possono essere utilizzati altri metodi di eutanasia.
Durante l'isolamento della microglia, la mielina deve essere completamente rimossa. I citometri a flusso si basano sul fatto che le cellule siano in grado di viaggiare attraverso tubi stretti a un ritmo rapido. A causa della sua viscosità e della tendenza ad aggregarsi, la mielina causa problemi con i citometri, spesso causando intasamenti che possono danneggiare l'apparecchiatura e distruggere il campione, riducendo drasticamente la resa. Prestare attenzione a rimuovere tutta la mielina durante la raccolta di frammenti immuno-arricchiti per evitare di avere problemi a valle.
Colorazione su piastra e colorazione in provetta: in questo protocollo, abbiamo descritto due opzioni per la colorazione delle cellule in provette da 1,5 mL o in una piastra a 96 pozzetti. Il caso d'uso per ciascuno dipende dall'esperimento; Tuttavia, in generale, la colorazione delle provette comporta un rischio inferiore di influire sulla resa rispetto alla colorazione delle piastre, poiché il flick rischia la perdita di cellule se eseguita in modo errato. La colorazione delle piastre è molto più veloce poiché l'aspirazione del surnatante per ogni provetta richiede molto tempo. Prima della fissazione (per lo smistamento, ecc.), utilizzare la colorazione delle provette per massimizzare la resa e ridurre il rischio di perdita. Tuttavia, per l'analisi HPTM, una volta che le cellule sono fissate per la colorazione intranucleare, il pellet è più stabile e c'è un rischio ridotto di perdita con il flicking.
Stabilire il gradiente di densità discontinuo: Quando si stabilisce la stratificazione, è essenziale impostare correttamente gli strati per ottenere la frazione arricchita immunitaria. Se gli strati sono disturbati o mescolati e appaiono torbidi, le cellule non si ordineranno nella posizione desiderata e ci sarà difficoltà nell'ottenere la frazione cellulare arricchita con immunità. In tal caso, centrifugare con il mezzo di densità per rimuovere la mielina e quindi raccogliere tutte le frazioni rimanenti, diluire con 3 mL di tampone FACS in 1 mL di mezzo di densità e mescolare bene (ciò richiederà più provette). Girare a 500 x g per 10 min con il freno su 0. Scartare il surnatante, lasciando solo ~300 μL di soluzione. Raccogliere l'intero campione e la colorazione. Ciò produrrà percentuali di ordinamento ridotte e una maggiore quantità di tempo trascorso al citometro, ma la resa può comunque essere comparabile.
Quando si utilizza il metodo di isolamento, è utile essere in grado di raccogliere cellule per l'RNA e per la valutazione HPTM dallo stesso cervello di topo. In questa situazione, dopo aver selezionato la microglia viva, le cellule possono essere divise per allocare una parte alla valutazione dell'RNA (il numero minimo di cellule in ingresso per ottenere una resa decente di RNA è di 75.000 cellule) e una parte per un'ulteriore analisi citometrica a flusso (minimo 10.000 cellule per pozzetto per una buona determinazione dell'IFM). In questo caso, è necessario lo smistamento con citometro a flusso. Tuttavia, quando si prevede di utilizzare le cellule solo per l'analisi HPTM, non è necessario lo smistamento e la frazione immunitaria può essere colorata con l'anticorpo P2RY12 e l'anticorpo HPTM. Il gating sul citometro può quindi essere impostato per la microglia P2RY12+, come si farebbe per lo smistamento del flusso, per analizzare solo il segnale HPTM all'interno della microglia. L'eliminazione dello smistamento consente al protocollo di essere più veloce ed economico. Inoltre, se si valutano HPTM da cellule in coltura, è sufficiente iniziare con il protocollo di colorazione e non sono necessari anticorpi marcatori cellulari, come dimostrato nella Figura 6. Il protocollo di valutazione HPTM può essere utilizzato per molti tipi di cellule, tra cui cellule in coltura, primarie e derivate da IPSC.
Infine, mentre abbiamo presentato solo due potenziali usi della microglia a valle dell'isolamento, ce ne sono molti altri che includono tecniche epigenetiche come ChIP, CUT&Tag e CUT&RUN. Nel caso di tecniche epigenetiche genomiche, in cui è interessante caratterizzare i cambiamenti in loci specifici, scegliere inibitori specifici per scrittori e cancellatori di segni di cromatina11 su misura per gli esperimenti per garantire che eventuali modificazioni epigenetiche microgliali profilate non siano artefatti tecnici derivanti da qualsiasi fase della procedura di isolamento come la digestione enzimatica. Quando si valutano i cambiamenti nei livelli globali di marcatori epigenetici, ad esempio utilizzando la citometria a flusso quantitativa, non ci si aspetta che i cambiamenti indotti dalla procedura siano così grandi da essere rilevati a livello globale.
Nel complesso, i metodi discussi forniscono un nuovo metodo a singola cellula per quantificare i livelli globali di modificazioni istoniche e altri cambiamenti epigenetici mediante citometria a flusso. Abbiamo dimostrato che questo metodo è sufficientemente sensibile per rilevare cambiamenti globali nel marcatore enhancer H3K27ac nella microglia in risposta a LPS in vivo. Ciò è coerente con il precedente sequenziamento ChIP di H3K27ac a seguito di stimolazione LPS che mostrava un drammatico rimodellamento degli enhancer responsivi a LPS28. Le applicazioni di questo metodo consentiranno l'esame dei cambiamenti epigenetici globali in diversi tipi di cellule cerebrali nello sviluppo e nella malattia.

L'epigenetica è lo studio dei meccanismi che regolano l'espressione genica senza alterare la sequenza di DNA sottostante. La regolazione epigenetica dell'espressione genica è dinamica all'interno delle cellule e può consentire risposte rapide e coordinate a vari stimoli ambientali. La regolazione dinamica avviene in parte a causa di cambiamenti nella struttura della cromatina a livello del nucleosoma, che è composto da proteine istoniche (H2A, H2B, H3, H4) assemblate in un nucleo di ottamero strettamente avvolto dal DNA1. Le interazioni tra le proteine istoniche e il DNA possono controllare l'accessibilità del DNA al meccanismo di trascrizione, che può in ultima analisi controllare l'espressione genica e altri aspetti della biologia della cromatina2. Le proteine istoniche hanno code non strutturate che presentano residui caricati positivamente che formano interazioni elettrostatiche con la spina dorsale del DNA caricata negativamente. Queste interazioni si traducono in un impacchettamento stretto del DNA e in una ridotta accessibilità del DNA. Le modificazioni covalenti delle code istoniche, denominate modificazioni post-traduzionali istoniche (HPTM), possono regolare queste interazioni 3,4. Alcuni degli HPTM più ben caratterizzati includono l'acetilazione e la metilazione della coda istonica, che può modificare l'affinità delle interazioni elettrostatiche tra le code istoniche e il DNA, con conseguente accessibilità differenziale al DNA sottostante e reclutamento di fattori di trascrizione che riconoscono questi HPTM in siti specifici. Gli HPTM sono regolati da tre importanti classi di enzimi denominati lettori, che riconoscono, scrittori, che depositano, e cancellatori, che rimuovono gli HPTM. Pertanto, il reclutamento o la dissoluzione di enzimi lettore, scrittore o cancellatore può in ultima analisi cambiare il panorama degli HPTM e governare la struttura e la funzione della cromatina, rendendo la loro regolazione e lettura essenziali per la comprensione della biologia cellulare e della funzione 3,4.
Le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) sono epigeneticamente flessibili in quanto modificano il loro trascrittoma per adattarsi agli stimoli ambientali. Sempre più evidenze suggeriscono che i cambiamenti nell'epigenoma, come la metilazione del DNA, gli RNA non codificanti e gli HPTM, svolgono un ruolo essenziale nella formazione della memoria e nella funzione sinaptica5. L'interruzione delle dinamiche HPTM attraverso la manipolazione dei lettori, degli scrittori o dei cancellatori pertinenti può bloccare o migliorare l'apprendimento associativo e il potenziamento a lungo termine 6,7,8. La microglia, la cellula immunitaria residente del sistema nervoso centrale, regola rapidamente il loro trascrittoma in risposta alla stimolazione immunitaria attraverso cambiamenti dinamici nel loro epigenoma 9,10,11. Questo alto livello di adattamento all'ambiente cerebrale locale li rende difficili da esaminare in un contesto isolato, poiché gli studi hanno dimostrato che l'epigenoma e il trascrittoma della microglia vengono alterati dopo solo poche ore nei terreni di coltura dopo la rimozione dall'ambiente cerebrale11. Inoltre, poiché le microglia costituiscono solo il 10% delle cellule cerebrali, le misure che esaminano i cambiamenti a livello dell'intero tessuto mancano di sensibilità e specificità12,13. Di conseguenza, le microglia devono essere rapidamente isolate per esaminare i cambiamenti epigenetici come i livelli di HPTM, ex vivo.
I metodi comunemente utilizzati per esaminare gli HPTM includono il sequenziamento della cromatina-immunoprecipitazione (ChIP-seq) e il clivaggio sotto i bersagli e il sequenziamento di tagmentazione (CUT&Tag-seq)4. Sebbene queste tecniche siano altamente specifiche per un singolo HPTM e possano informare sulla presenza di HPTM all'interno di uno specifico contesto genomico, possono esaminare solo uno dei molti HPTM possibili all'interno di un singolo esperimento11,14 Pertanto, prima di procedere con tali esperimenti, che richiedono un investimento significativo in termini di tempo e denaro, è molto utile restringere l'elenco degli HPTM potenzialmente interessanti per ulteriori indagini, esaminando prima i cambiamenti nella globalizzazione livelli di HPTM. I due approcci principali per esaminare i livelli globali di HPTM sono l'immunoistochimica e l'analisi western blot, ma entrambi gli approcci sono solo semi-quantitativi, a basso rendimento e richiedono un gran numero di sezioni di tessuto o cellule isolate15,16. Pertanto, abbiamo mirato a sviluppare un metodo quantitativo altamente sensibile che potesse essere utilizzato per esaminare i livelli globali di HPTM rapidamente e a livello di singola cellula.
Il protocollo presentato consente di rilevare rapidamente i livelli globali di HPTM utilizzando la citometria a flusso intranucleare. Precedenti studi sulle cellule tumorali hanno giustificato l'importanza di esaminare i livelli globali da una prospettiva clinica17,18. È anche comune che gli studi utilizzino i livelli globali come metodo di screening prima di valutare la posizione genomica di specifici HPTM di interesse19,20. Per la microglia, la valutazione dei livelli globali dopo l'isolamento è difficile a causa della bassa resa cellulare; Pan et al. presentano livelli globali di HPTM da microglia isolate, in cui la microglia di tre animali è stata raggruppata per consentire il rilevamento del livello proteico mediante western blot19. Utilizzando il nostro protocollo, siamo in grado di rilevare i cambiamenti globali con input cellulari molto più bassi, consentendo lo screening di più marcature per animale ed eliminando la necessità di raggruppare i campioni.
In questo articolo, descriviamo un protocollo per rilevare rapidamente i livelli di HPTM tramite citometria a flusso intranucleare quantitativa in microglia isolate. Anche se per brevità ci concentriamo specificamente sulla quantificazione HPTM, questo protocollo può essere utilizzato allo stesso modo per quantificare i livelli globali di enzimi lettore, scrittore e cancellatore. Il protocollo è suddiviso in due parti: in primo luogo, il metodo di isolamento per la microglia e, in secondo luogo, il metodo basato sulla citometria a flusso per determinare i livelli di HPTM. Il metodo di isolamento produce cellule che possono essere utilizzate sia per l'isolamento dell'RNA che per la valutazione del livello di HPTM, che consente di valutare l'espressione genica e i livelli di HPTM dallo stesso campione. Inoltre, il metodo per la valutazione HPTM può essere utilizzato su altri tipi di cellule come indicato nel protocollo.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provette per centrifuga Falcon, polipropilene, sterili</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 pozzetti Piastre trasparenti non trattate</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Micropiastra in polistirene trasparente, fondo rotondo trasparente, superficie non trattata</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Acetil istone 3 K9 (C5B11)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9649S</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>Acetil Istone H4 K8 (2594)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>2594S</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>Acetil-istone H3 K27 (D5E4)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>8173S</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>Acetil istone H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomicina</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-istone H3 (tri metil K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-lattil-istone H4 (Lys 12) Coniglio mAb</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>Diluizione: 1:250</td></tr><tr><td>Anti-L-lattillisina Coniglio pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Diluizione: 1:250</td></tr><tr><td>Apc anti-P2RY12 Anticorpo, Clone: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Cyto-Last Buffer</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsolfossido, sterile</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td><td>ABclonal</td><td>AS035</td><td>Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipette monouso a trasferimento graduato</td><td>Fisherbrand Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Unità filtrante monouso in PES, 250 ml&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale H3K18ac</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>KONTES Dounce Grinder per tessuti 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lattil-istone H3 (Lys 18) Coniglio mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>Diluizione: 1:250</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads Perline di compensazione</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>Kit PDS, fiala di papaina - Worthington Biochemical</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Particelle fluorescenti arcobaleno, 1 picco (3,0-3,4 uM - Media intensità BioLegend</td><td></td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge senza RNasi, 1,5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene a fondo tondo con tappi, 5 mL</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>Set di tamponi per fattore di trascrizione nucleare reale</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (anti-topo CD16/32) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Kit di viabilità riparabile Zombie Aqua</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Il controllo dell'espressione genica avviene in parte attraverso modifiche nella struttura della cromatina, inclusa l'aggiunta e la rimozione di modifiche post-traduzionali alle code istoniche. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni (HPTM) possono facilitare l'espressione genica o la repressione. Ad esempio, l'acetilazione dei residui di lisina della coda istonica neutralizza la carica positiva e riduce le interazioni tra la coda e il DNA caricato negativamente. La diminuzione delle interazioni coda istonica-DNA si traduce in una maggiore accessibilità del DNA sottostante, consentendo un maggiore accesso al fattore di trascrizione. Il segno di acetilazione funge anche da sito di riconoscimento per gli attivatori trascrizionali contenenti bromodominio, che insieme si traducono in una maggiore espressione genica. I marcatori istonici possono essere regolati dinamicamente durante la differenziazione cellulare e in risposta a diversi ambienti e stimoli cellulari. Mentre gli approcci di sequenziamento di nuova generazione hanno iniziato a caratterizzare le posizioni genomiche per le singole modificazioni istoniche, solo una modifica può essere esaminata contemporaneamente. Dato che esistono centinaia di HPTM diversi, abbiamo sviluppato una misura quantitativa ad alto rendimento di HPTM globali che può essere utilizzata per lo screening delle modifiche istoniche prima di condurre approcci di sequenziamento del genoma più estesi. Questo protocollo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per rilevare HPTM globali e può essere condotto utilizzando cellule in coltura o cellule isolate da tessuti in vivo . Presentiamo dati di esempio da microglia cerebrali di topo isolate per dimostrare la sensibilità del test per rilevare cambiamenti globali negli HPTM in risposta a uno stimolo immunitario derivato da batteri (lipopolisaccaride). Questo protocollo consente la valutazione rapida e quantitativa degli HPTM e può essere applicato a qualsiasi regolatore trascrizionale o epigenetico che possa essere rilevato da un anticorpo.

I topi adulti sono stati perfusi per via transcardiaca e sacrificati per l'isolamento della microglia. Le microglia sono state isolate su ghiaccio e colorate con anticorpi P2RY12-APC e viola 525 morti vivi. Le cellule che sono risultate positive per P2RY12 e negative per la colorazione morta viva viola 525 sono state classificate come microglia vive. La resa media di microglia da un cervello di topo sezionato è stata di 1,28 x 105 ± 0,05 (media ± errore standard della media (SEM), N = 100). Non c'è differenza nella resa della microglia tra topi femmine (1,25 x 105 ± 0,09 [media ± SEM, N=46]) e maschi (1,32 x 105 ± 0,07 [media ± SEM, N=54]) (t(98)=0,6365, p=0,526). Quando si isola da specifiche regioni cerebrali, la resa media della microglia dalla corteccia di topo è di 8,3 x 104 ± 0,08 (media ± SEM, N = 15) e dall'ippocampo del topo è 4,1 x 104 ± 0,02 (media ± SEM, N = 16). Come previsto, c'è una differenza significativa nella resa della microglia da ciascuna regione del cervello (F(2, 128)=25,25, P&lt;0,0001). Dopo l'isolamento della microglia, l'RNA è stato estratto dalle cellule isolate utilizzando un kit di isolamento dell'RNA a basso input. Coerentemente il punteggio di integrità dell'RNA (RIN) è stato superiore a 9,0 (9,62 ± 0,05) e la resa media di RNA per cellula è stata di 0,25 ± 0,01 pg (media ± SEM, N=32; Fascicolo supplementare S2).
I topi adulti sono stati iniettati per via intraperitoneale con 1 mg/kg di lipopolisaccaride (LPS) 24 ore prima del sacrificio. I topi sono stati perfusi per via transcardiaca con HBSS e la microglia è stata isolata dall'intero cervello secondo il protocollo descritto (Figura 5A). Per ogni colorazione, 20.000-30.000 cellule sono state assegnate a ciascun pannello di anticorpi. I livelli globali di acetilazione dell'istone 3 lisina 27 (H3K27Ac) sono stati valutati in microglia isolate tramite citometria a flusso. Per topi maschi e femmine, il trattamento con LPS ha indotto un aumento di H3K27Ac quando l'MFI è normalizzato all'interno del sesso (t(6)=9.676, p&lt;0.0001; Figura 5B). Quando si esaminano gli istogrammi per le cellule colorate, le popolazioni rimangono normalmente distribuite con variazioni simili; tuttavia, le cellule sono passate a una maggiore fluorescenza con conseguente aumento dell'MFI (Figura 5C). Quando si esamina H3K9Ac nello stesso trattamento, si osserva un aumento simile di H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figura 5D,E) tuttavia la variazione di piega dell'LPS rispetto al PBS del segnale H3K9Ac è inferiore al segnale H3K27Ac.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Figura 5: Cambiamenti globali nell'acetilazione degli istoni nella microglia isolata. (A) I topi vengono iniettati per via intraperitoneale con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o 1 mg/kg di lipopolisaccaride (LPS) 24 ore prima del sacrificio. Le microglia vengono raccolte dalla frazione arricchita di immunità e fissate per la citometria a flusso e la valutazione della modificazione post-traduzionale degli istoni globali. L'intensità fluorescente mediana è valutata come proxy per l'espressione proteica. Creato con BioRender.com. (B) I livelli globali di H3K27Ac sono aumentati in risposta al trattamento con LPS. Cambio di piega in PBS normalizzato all'interno dell'esperimento e del sesso. T-test spaiato a due code, t(6)=9.676, p&lt;0.0001. Il grafico a barre rappresenta la media ± SEM. N=8 animali; 2 per condizione in 2 esperimenti indipendenti. (C) Istogrammi di esempio che raffigurano lo spostamento dell'intensità della fluorescenza H3K27Ac. Modal raffigura gli istogrammi dei topi iniettati con PBS rispetto a quelli iniettati con LPS. (D) Istogrammi di esempio che raffigurano lo spostamento dell'intensità della fluorescenza H3K9Ac. Modal raffigura gli istogrammi dei topi iniettati con PBS rispetto a quelli iniettati con LPS. (E) I livelli globali di H3K9Ac sono aumentati in risposta al trattamento con LPS. Cambio di piega in PBS normalizzato all'interno dell'esperimento e del sesso. T-test a due code spaiato, t(6)=7.299, p=0.0003. Il grafico a barre rappresenta la media ± SEM. N=8 animali; 2 per condizione in 2 esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per confermare che il metodo descritto era paragonabile ad altri metodi precedentemente utilizzati per la quantificazione della modificazione istonica globale, abbiamo mirato a utilizzare l'immunoblot come strumento comparativo. Tuttavia, la resa della microglia isolata è semplicemente troppo bassa per consentire una valutazione ragionevole. Pertanto, abbiamo utilizzato cellule BV2 in coltura per confrontare il metodo di citometria a flusso intracellulare con un Western blot (WB). Le cellule BV2 sono state coltivate in terreni completi (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicillina/streptamicina e 1x L-glutammina) a 37 °C, 5% CO2. Le cellule sono state passate con tripsina-EDTA allo 0,25% e piastrate a una densità di 250.000 cellule/pozzetto e trattate in terreni sierici ridotti (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicillina/streptamicina e 1x L-glutammina) e lasciate recuperare per 12 ore a 37 °C, 5% CO2. Le cellule sono state trattate con 25 ng/mL di LPS per 24 ore prima della fissazione come descritto sopra o della lisi con un tampone di lisi WB. Il segnale di H3K27Ac è stato eseguito con entrambi i metodi con GAPDH utilizzato come controllo di carico per WB. L'analisi dell'intensità fluorescente normalizzata rispetto al controllo PBS è stata determinata per ciascun gruppo (Figura 6A). Quando si esamina la variazione del segnale H3K27Ac normalizzato da parte di WB, c'è stato un aumento di 1,527 volte nella condizione trattata con LPS rispetto al controllo H2O che è stato determinato come significativo dal test t spaiato (t=3,024, df=5; p=0,0293). Quando si esamina il cambiamento utilizzando la citometria a flusso, c'è stato un aumento di 1,482 volte nella condizione trattata con LPS che è stata determinata come significativa (t = 7,843, df = 10; p&lt;0,0001). Utilizzando un'ANOVA a 2 vie per confrontare i metodi, è stato determinato che c'è un effetto significativo del trattamento (F(1,15)=45,21,p&lt;0,0001), ma non il metodo (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) o l'interazione (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Inoltre, verifichiamo qui che non vi è alcun cambiamento nei livelli di istone H3 sia mediante Western blot che con citometria a flusso, poiché l'ANOVA a 2 vie non ha rivelato alcun effetto significativo del trattamento LPS (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), del metodo (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) o dell'interazione (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figura 6B). Vengono mostrati anche esempi di blot e spostamenti dell'istogramma per questi dati (Figura 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Figura 6: Confronto dei metodi per la quantificazione della variazione globale della modificazione istonica tra citometria a flusso e western blot. (A) Le cellule BV2 vengono trattate con lipopolisaccaride (LPS) o H2O da 25 ng/mL per 24 ore prima dell'analisi. L'intensità fluorescente di H3K27Ac è rappresentata come variazione di piega al controllo del veicolo, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), sia per la citometria a flusso che per il western blot. L'ANOVA a 2 vie ha rivelato un effetto significativo del trattamento LPS (F(1,15)=45,21, p&lt;0,0001), ma non del metodo (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) o dell'interazione (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). La correzione di Tukey per la verifica di ipotesi multiple è stata applicata per i residui. * presenta 0,0332, ** presenta 0,0021. (B) L'intensità fluorescente per l'istone H3 è rappresentata come variazione di piega in PBS sia per la citometria a flusso che per il western blot. L'ANOVA a 2 vie non ha rivelato alcun effetto significativo del trattamento LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) o del metodo (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) o dell'interazione (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Vengono rappresentati blot esemplificativi (D) spostamenti della citometria a flusso. La dimensione dell'istogramma viene normalizzata in percentuale in base al numero di cellule presenti all'intensità fluorescente modale. Il grafico a barre mostra il SEM medio. n=2 esperimenti indipendenti, 2 per condizione per esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tutti insieme, questi risultati mostrano che questa tecnica può essere utilizzata per valutare quantitativamente i livelli globali di HPTM nella microglia isolata. Inoltre, il metodo ha dimostrato di essere paragonabile alle tecniche precedenti, ma che richiede input cellulari molto più bassi. Inoltre, anche se non mostrata, con un'adeguata compensazione, la presente tecnica può essere utilizzata con più anticorpi sullo stesso pannello che valutano diversi HPTM.
File supplementare S1: File di analisi di esempio. Questo file contiene un file di analisi wsp e 7 file fcs tra cui nessun colorante, P2RY12FMO, 568FMO, due animali trattati con PBS e due animali trattati con LPS colorati con H3K27Ac. Lo scopo di questo file è quello di dimostrare l'analisi e il gating di un esperimento in grado di rappresentare l'aspetto di un esperimento riuscito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare S2: Dati di isolamento. Il file incluso contiene i dati rilevanti dopo l'ordinamento della microglia che contiene la microglia e la resa dell'RNA dal protocollo descritto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>POPOLAZIONE RECINTATA</td>
			<td>Frequenza del genitore</td>
			<td>Frequenza del totale</td>
			<td>Contare</td>
		</tr><tr><td>Visualizzazione del materiale S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2&gt;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ &gt; APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Il grafico di derivazione del campione di esempio illustra la percentuale e i numeri di eventi necessari per un rilevamento accurato delle proteine.

Questo lavoro descrive un protocollo per la quantificazione delle modificazioni istoniche globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare in microglia cerebrali isolate. Il lavoro contiene anche il protocollo di isolamento della microglia che è stato utilizzato per la raccolta dei dati.

Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

La nostra ricerca mira a comprendere i meccanismi regolatori fondamentali che controllano l'espressione genica nel cervello e siamo particolarmente interessati a capire come l'interruzione di questi meccanismi contribuisca alle condizioni dello sviluppo neurologico e neuropsichiatrico. Ci concentriamo sulla comprensione di come i fattori di rischio genetici e ambientali si combinano per alterare la funzione cellulare e produrre disturbi comportamentali. Questo protocollo include metodi per lo screening ad alto rendimento delle modificazioni istoniche nella microglia isolata, consentendoci di eseguire lo screening attraverso dozzine di diverse modificazioni epigenetiche prima di impegnarci in studi di sequenziamento ad alto rendimento e follow-up funzionale.Il nostro protocollo fornisce misure delle modificazioni storiche globali simili alla trama occidentale. Tuttavia, la nostra tecnica è più veloce, richiede meno celle di input, è più quantitativa e può essere multiplexata.

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Questo protocollo descrive un metodo per coltivare i neuroni ippocampali primari dal cervello embrionale del topo. L'espressione del complesso di istocompatibilità principale di classe I sulla superficie extracellulare dei neuroni coltivati viene quindi valutata mediante analisi citometrica del flusso.

Valutazione dell'espressione del complesso di istocompatibilità maggiore classe I sui neuroni ippocampali murini primari per citometria a flusso

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

La citometria a flusso è uno strumento potente che consente l'isolamento e lo studio di popolazioni cellulari specifiche. Questo protocollo descrive i passaggi per isolare cellule esprimenti LacZ da tessuti cocleari di topi transgenici neonati. Le cellule cocleari dissociate sono state marcate utilizzando substrati fluorescenti coniugati della β-galattosidasi prima della separazione mediante citometria a flusso.

Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell&#39;orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Descriviamo un protocollo che permette la purificazione del compartimento vascolare del cervello del topo. I vasi cerebrali isolati includono cellule endoteliali collegate da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continua, periciti, cellule muscolari lisce vascolari e membrane astrogliali perivascolari.

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Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Analisi quantitativa del contenuto della cella all'interno del nervo sciatico murino è difficile a causa della scarsità del tessuto. Questo protocollo descrive un metodo per la digestione del tessuto e preparazione che fornisce cellule sufficienti per analisi di citometria a flusso delle popolazioni delle cellule immuni dai nervi dei topi individuali.

Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso

Vi presentiamo un protocollo per isolare i neuroni, i macrofagi e microglia da cervelli di zebrafish larvale in condizioni fisiologiche e patologiche. All'isolamento, RNA è Estratto da queste cellule per analizzare il loro profilo di espressione genica. Questo protocollo consente la raccolta di RNA di alta qualità per l'esecuzione dell'analisi a valle come qPCR e trascrittomica.

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Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una guida completa, sistematica per la purificazione efficiente degli istoni H3 e H4 e la quantificazione dei residui degli istoni acetilati.

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Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata (Video) | JoVE Journal

Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

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