Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata
September 15th, 2023
Questo lavoro descrive un protocollo per la quantificazione delle modificazioni istoniche globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare in microglia cerebrali isolate. Il lavoro contiene anche il protocollo di isolamento della microglia che è stato utilizzato per la raccolta dei dati.
La nostra ricerca mira a comprendere i meccanismi regolatori fondamentali che controllano l'espressione genica nel cervello e siamo particolarmente interessati a capire come l'interruzione di questi meccanismi contribuisca alle condizioni dello sviluppo neurologico e neuropsichiatrico. Ci concentriamo sulla comprensione di come i fattori di rischio genetici e ambientali si combinano per alterare la funzione cellulare e produrre disturbi comportamentali. Questo protocollo include metodi per lo screening ad alto rendimento delle modificazioni istoniche nella microglia isolata, consentendoci di eseguire lo screening attraverso dozzine di diverse modificazioni epigenetiche prima di impegnarci in studi di sequenziamento ad alto rendimento e follow-up funzionale.
Il nostro protocollo fornisce misure delle modificazioni storiche globali simili alla trama occidentale. Tuttavia, la nostra tecnica è più veloce, richiede meno celle di input, è più quantitativa e può essere multiplexata.
Panoramica
Questo studio delinea un protocollo per quantificare le modifiche globali degli istoni utilizzando la citometria a flusso intranucleare specificamente nella microglia cerebrale isolata. L'indagine mira a comprendere i meccanismi regolatori fondamentali dell'espressione genica nel cervello, in particolare come le interruzioni contribuiscano ai disturbi neuroevolutivi e neuropsichiatrici.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienze
- Epigenetica
- Citometria a flusso
Sfondo
- Focus sulla regolazione dell'espressione genica nel cervello.
- Esplorazione dei fattori di rischio genetici e ambientali legati ai disturbi cerebrali.
- Il ruolo della microglia nelle condizioni neuroevolutive e neuropsichiatriche.
- Sviluppo di un nuovo protocollo di screening ad alto rendimento.
Obiettivo dello Studio
- Fornire un metodo per quantificare le modifiche degli istoni nella microglia.
- Facilitare lo screening delle modifiche epigenetiche prima di ulteriori analisi.
- Avanzare la comprensione delle funzioni cellulari e dei deficit comportamentali legati ai disturbi.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo della citometria a flusso intranucleare per quantificare le modifiche degli istoni.
- Il modello biologico ha coinvolto microglia isolata dal tessuto cerebrale di topo.
- I protocolli includevano passaggi di arricchimento immunitario e centrifugazione per l'isolamento cellulare.
- Sono stati forniti passaggi dettagliati per la preparazione dei campioni di tessuto e l'analisi con anticorpi specifici.
- Analisi statistica presentata per quantificare i livelli di modifica degli istoni tramite valori MFI.
Risultati principali
- Evidenzia un aumento dell'acetilazione della lisina 27 dell'istone H3 dovuto al trattamento con lipopolisaccaride.
- I risultati hanno indicato popolazioni distribuite normalmente con notevoli spostamenti nella fluorescenza.
- Fornisce informazioni quantitative sul panorama epigenetico della microglia e sulle risposte funzionali.
- Ha dimostrato un metodo rapido ed efficiente rispetto alle tecniche tradizionali.
Conclusioni
- Questo studio supporta un approccio più rapido e quantitativo per studiare le modifiche degli istoni nella microglia.
- Rilevanti implicazioni per la comprensione dell'impatto dei cambiamenti epigenetici sui disturbi neuroevolutivi e psichiatrici.
- Il metodo consente un'analisi ad alto rendimento che potrebbe accelerare la ricerca nelle risposte cellulari e nella neurobiologia.
Domande Frequenti
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Mouse Brain Dissection for Microglia Isolation
2:02
Mouse Brain Immune‐Enriched Fragment Isolation for Histone PTM Quantification
3:37
Mouse Brain Enriched Immune Pellet Plate Staining Method for Histone Quantification
4:48
Flow Cytometry and Data Analysis of Murine Brain Histone Post‐Translational Modifications
