Name: Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri la mappatura ottica a doppio colorante per studiare le aritmie cardiache nei cuori di topi knock-in RyR2R2474S affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica.

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Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81700308 a XO e 31871181 a ML e da 82270334 a XT), dal Programma di supporto alla scienza e alla tecnologia della provincia di Sichuan (CN) (da 2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT e da 2022NSFSC1602 a TC) e dal Laboratorio chiave statale per la chimica e l'ingegneria molecolare delle risorse medicinali (Guangxi Normal University) (da CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE a Oxford (ML) sovvenzioni.

Per gli esperimenti vengono utilizzati topi maschi di età compresa tra 10 e 14 settimane di età o topi RyR2-R2474S/+ (sfondo C57BL/6) del peso di 20-25 g. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali della Southwest Medical University, Sichuan, Cina (approvazione n.: 20160930) in conformità con le linee guida nazionali in base alle quali opera l'istituto.
1. Preparazione
<ol><li>Soluzioni di magazzino<ol><li>Soluzione madre di blebbistatina: aggiungere 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) al 100% nel matraccio originale contenente 2,924 mg di (-) polvere di blebbistatina per raggiungere una concentrazione di 10 mM.</li>
		<li>Indicatore di tensione RH237 soluzione madre: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% nel matraccio originale con 1 mg di polvere RH237 per ottenere una concentrazione di 2,01 mM.</li>
		<li>Indicatore di calcio Rhod-2 AM soluzione madre: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% in 1 mg di Rhod-2 AM in polvere per raggiungere una concentrazione di 0,89 mM.</li>
		<li>Soluzione madre Pluronic F127: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% in 200 mg di Pluronic F127 per raggiungere una concentrazione del 20% p/v (0,66 mM).</li>
		<li>Aliquotare le soluzioni madre in provette PCR da 200 μL in 21-51 μL (21 μL di RH237, 31 μL di Rhod-2 AM e 51 μL di blebbistatina) per uso singolo o doppio per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Quindi, avvolgere le soluzioni con un foglio di alluminio e conservare a -20 °C, ad eccezione della soluzione madre Pluronic F127 posta in una stanza buia a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Soluzione di perfusione<ol><li>Soluzione di Krebs (in mM): Preparare 1 L di soluzione di Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 e glucosio 10).</li>
		<li>Filtrare la soluzione con un filtro ad ago asettico da 0,22 μm e ossigenare con il 95% di O 2/5% di CO2 .</li>
		<li>Prelevare 40 mL di soluzione di Krebs in una provetta centrifuga da 50 mL e conservarla a 4 °C per l'isolamento cardiaco di follow-up.</li>
	</ol></li>
	<li>Il sistema di perfusione Langendorff e il dispositivo di mappatura ottica<ol><li>Configurare il sistema di perfusione Langendorff.<ol><li>Aprire il bagnomaria e impostare la temperatura a 37 °C.</li>
			<li>Lavare il sistema di perfusione Langendorff con 1 L di acqua deionizzata.</li>
			<li>Perfondere la soluzione dal tratto di aspirazione e regolare la velocità di deflusso a 3,5-4 mL/min. Quindi, ossigenare il perfusato con O 2/CO2 (95%/5%) gas a 37 °C. NOTA: Una bolla non è mai ammessa nel sistema di perfusione.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparare il sistema di mappatura ottica.<ol><li>Installare la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD) (512 × 512 pixel), l'obiettivo (ingrandimento 40x), i diodi emettitori di luce (LED) dello splitter di lunghezza d'onda, il monitor dell'elettrocardiogramma (ECG) e l'elettrodo di stimolazione (Figura 1).</li>
			<li>Regolare la corretta distanza di lavoro dall'obiettivo alla posizione del cuore.</li>
			<li>Impostare due LED nella posizione diagonale del bagno termostatico per un'illuminazione uniforme, fornendo una lunghezza d'onda di 530 nm per generare luce di eccitazione. Utilizzare un filtro con rivestimento antisputtering ET525/50 per rimuovere qualsiasi luce fuori banda per i LED.</li>
			<li>Regolare l'interruttore della maniglia per ottenere un quadrato uguale della superficie di destinazione, facendo in modo che le immagini di tensione e calcio appaiano adeguatamente sull'interfaccia di acquisizione.</li>
			<li>Ruotare l'apertura dell'obiettivo al diametro massimo per evitare perdite di tensione o segnali di calcio.</li>
			<li>Regolare l'obiettivo della fotocamera a un'altezza adeguata, poiché serve una buona distanza di lavoro dal bagno termostatico, vengono utilizzati principalmente 10 cm.</li>
			<li>Accendere la fotocamera per una temperatura di campionamento stabile a -50 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Procedure
<ol><li>Prelievo, incannulamento e perfusione del cuore di topo<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale negli animali una soluzione di avertin (1,2%, 0,5-0,8 ml) ed eparina (200 unità) per ridurre al minimo la sofferenza e il riflesso del dolore e prevenire la formazione di coaguli di sangue. Dopo 15 minuti, sacrificare gli animali mediante lussazione cervicale.</li>
		<li>Aprire il torace con le forbici, prelevare il cuore con cura e metterlo nella soluzione fredda di Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2 ) per rallentare il metabolismo e proteggere il cuore.</li>
		<li>Rimuovere il tessuto circostante l'aorta, incannulare l'aorta utilizzando un ago cannulante su misura (diametro esterno: 0,8 mm, diametro interno: 0,6 mm, lunghezza: 27 mm) e fissarlo con una sutura di seta 4-0.</li>
		<li>Perfondere il cuore con il sistema Langendorff a una velocità costante di 3,5-4,0 mL/min e mantenere la temperatura a 37 ± 1 °C. NOTA: Tutte le procedure successive vengono eseguite in questa condizione.</li>
		<li>Inserire un piccolo tubo di plastica (0,7 mm di diametro, 20 mm di lunghezza) nel ventricolo sinistro per rilasciare la congestione della soluzione nella camera ed evitare il sovraprecarico.</li>
	</ol></li>
	<li>Disaccoppiatore di eccitazione-contrazione e caricamento a doppio colorante<ol><li>Inserire due derivazioni nel perfuso nella vasca da bagno, accendere l'alimentazione della scatola dell'amplificatore ECG e del controller di stimolazione elettrica, quindi avviare il software ECG di riferimento e monitorare continuamente l'ECG.</li>
		<li>Eseguire i passaggi successivi al buio quando il cuore raggiunge una condizione di stato stabile (il cuore batte ritmicamente a ~400 bpm).</li>
		<li>Miscelare 50 μL di soluzione madre di blebbistatina 10 mM con 50 mL di soluzione di Krebs per raggiungere una concentrazione di 10 μM. Perfondere costantemente la miscela di soluzione di blebbistatina-Krebs nel cuore per 10 minuti per disaccoppiare la contrazione dall'eccitazione ed evitare artefatti di contrazione durante le riprese.</li>
		<li>Usa una torcia rossa per verificare se la contrazione cardiaca si ferma completamente perché la contrazione influenzerà la qualità del caricamento del colorante.</li>
		<li>Dopo aver disaccoppiato eccitazione-contrazione, miscelare 15 μL di soluzione madre Rhod-2 AM con 15 μL di soluzione madre Pluronic F127 in 50 mL di soluzione di Krebs per ottenere le concentrazioni finali di 0,267 μM Rhod-2 AM e 0,198 μM Pluronic F127. Quindi, perfondere continuamente il cuore con la soluzione di lavoro Rhod-2 AM per 15 minuti nel sistema di perfusione Langendorff.</li>
		<li>Mantenere l'apporto di ossigeno durante il caricamento intracellulare del colorante di calcio. Poiché le bolle si formano facilmente in Pluronic F127, inserire una trappola per bolle nel sistema di perfusione per evitare l'embolizzazione gassosa delle coronarie.</li>
		<li>Diluire 10 μL di soluzione madre RH237 in 50 mL di perfuso per raggiungere la concentrazione finale a 0,402 μM ed eseguire il caricamento per 10 minuti.</li>
		<li>Al termine del caricamento del doppio colorante, scattare una sequenza di foto per assicurarsi che sia i segnali di tensione che quelli di calcio siano adeguati per l'analisi (nessuna interazione tra due segnali).</li>
	</ol></li>
	<li>Mappatura ottica e induzione dell'aritmia NOTA: La mappatura ottica inizia dopo la cessazione della contrazione e un appropriato caricamento del colorante, e il cuore viene perfuso consecutivamente come nei passaggi descritti sopra al punto 2.1 (4).<ol><li>Accendi i due LED per le luci di eccitazione e regola la loro intensità a una gamma adeguata (abbastanza forte per l'illuminazione e le riprese relativamente semplici, ma non troppo robusta per la sovraesposizione).</li>
		<li>Posizionare il cuore sotto il dispositivo di rilevamento, assicurarsi che sia illuminato adeguatamente da due LED e regolare il diametro del punto luminoso a 2 cm.</li>
		<li>Impostare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il cuore a 10 cm, ottenendo una frequenza di campionamento di quasi 500 Hz e una risoluzione spaziale di 120 x 120 μm per pixel.</li>
		<li>Aprire il software di campionamento del segnale per controllare digitalmente la telecamera e acquisire contemporaneamente i segnali di tensione e calcio.</li>
		<li>Avviare lo stimolatore di campo miopacante e impostare il modello di stimolazione su Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms di durata della stimolazione per ogni impulso e 0,3 V come intensità iniziale.</li>
		<li>Utilizzare 30 stimoli consecutivi S1 a 10 Hz per testare la soglia di tensione diastolica del cuore guidata dal software di registrazione ECG. Aumentare gradualmente l'ampiezza della tensione fino a realizzare l'acquisizione 1:1 (controllare l'onda QRS dal monitor ECG, i segnali del potenziale d'azione (AP) e dei transienti di calcio (CaT)).</li>
		<li>Dopo aver determinato la soglia di tensione, stimolare il cuore a un'intensità pari a 2 volte la soglia di tensione diastolica con una coppia di elettrodi di platino attaccati all'epicardio dell'apice del ventricolo sinistro (LV) (ELVA).</li>
		<li>Implementare il protocollo S1S1 per misurare il calcio o le alternative del potenziale d'azione e le proprietà di restituzione. Regolare il cuore consecutivamente a una durata del ciclo di base di 100 ms, diminuendo di 10 ms la durata del ciclo ogni sequenza successiva fino a raggiungere i 50 ms. Ogni episodio include 30 stimoli consecutivi con un'ampiezza dell'impulso di 2 ms. Allo stesso tempo, avviare la mappatura ottica prima della stimolazione (il tempo di campionamento include ~10 ritmi sinusali e la durata della stimolazione).</li>
		<li>Per misurare il periodo refrattario effettivo ventricolare (ERP) utilizzando il protocollo di stimolo S1S2, iniziare con una durata del ciclo di stimolazione S1S1 di 100 ms con un S2 accoppiato a 60 ms con un decremento a passi di 2 ms fino a quando S2 non riesce a catturare il complesso QRS ectopico.</li>
		<li>Per l'induzione dell'aritmia, eseguire una stimolazione a raffica perpetua di 50 Hz (50 stimolazioni elettriche continue con un'ampiezza dell'impulso di 2 ms) ed eseguire lo stesso episodio di stimolazione dopo un intervallo di riposo di 2 secondi.</li>
		<li>Osservare attentamente le registrazioni ECG durante il periodo di stimolazione continua ad alta frequenza in modo che le registrazioni simultanee della mappatura ottica possano iniziare prontamente quando si genera un'onda ECG aritmica interessante (poiché la maggior parte delle aritmie cardiache sono indotte dalla stimolazione elettrica, i segnali ottici vengono campionati 2-3 secondi prima della stimolazione a raffica in caso di perdita di eventi cardiaci importanti).</li>
		<li>Immagine con telecamera EMCCD (frequenza di campionamento: 500 Hz, dimensione pixel: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati<ol><li>Caricamento delle immagini ed elaborazione del segnale<ol><li>Premere Seleziona cartella e carica immagini per caricare le immagini nel software di acquisizione delle immagini per l'analisi semiautomatica dei dati video massivi in base alla configurazione e al protocollo descritti in precedenza15,16.</li>
			<li>Immettere i parametri di campionamento corretti (ad esempio Dimensione pixel e Frequenza fotogrammi).</li>
			<li>Impostare la soglia dell'immagine tramite l'inserimento manuale e selezionare la regione di interesse (ROI).</li>
			<li>Implementa un filtro spaziale gaussiano da 3 x 3 pixel, un filtro Savitzky-Goaly e una correzione della linea di base top-hat.</li>
			<li>Premere Elabora immagini per rimuovere la linea di base e calcolare i parametri elettrofisiologici, ad esempio APD80 e CaTD50.</li>
		</ol></li>
		<li>Analisi dei parametri elettrofisiologici<ol><li>Impostare il tempo di avvio dell'APD al picco e il punto terminale all'80% di ripolarizzazione (APD80) per il calcolo dell'APD80. Allo stesso modo, l'ora di inizio CaTD è definita come il picco e il punto terminale è definito come il rilassamento dell'80%.</li>
			<li>La misurazione della velocità di conduzione (CV) dipende dalla dimensione dei pixel e dal tempo di conduzione del potenziale d'azione tra due o più pixel. Calcola la velocità media da tutti i pixel scelti: questa è la velocità media di conduzione della regione selezionata. Genera simultaneamente le mappe isocronali corrispondenti per una visione chiara della direzione di conduzione. NOTA: O'Shea et al.15 hanno riportato la misurazione CV in dettaglio.</li>
			<li>Per l'analisi delle alternanze e delle aritmie, le alternanze di calcio sono definite come un'ampiezza di picco continua grande e piccola che appare alternativamente. Utilizzare il rapporto di ampiezza di picco per valutare la gravità delle alternative dipendenti dalla frequenza (1-A2/A1). Applicare mappe di fase per analizzare aritmie complesse come la tachicardia ventricolare (TV). Cerca i rotori che appaiono distintamente in una regione specifica mentre i rotori si spostano.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
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<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per una mappatura ottica a doppio colorante di successo di un cuore di topo includono una soluzione e un cuore ben preparati, il caricamento del colorante, il raggiungimento del miglior rapporto segnale/rumore e la riduzione dell'artefatto da movimento.
Preparazione della soluzione La soluzione di Krebs è essenziale per il successo di un esperimento sul cuore. Le soluzioni madre di MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) ...

Tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfica (PVT) a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono degenerare in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale 1,2,3,4 . Recenti evidenze a seguito del suo primo rapporto come sindrome clinica nel 1995 implicavano mutazioni in sette geni, tutti coinvolti nel rilascio di Ca 2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) in questa condizione: il più frequentemente riportato RYR2 che codifica per il recettore 2 della rianodina (RyR2) dei canali di rilascio di Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 che codifica per la calsequestrina cardiaca8, TRDN che codificano per la proteina SR giunzionale triadina 9, e CALM19, CALM2 10 e CALM3 codificano in modo identico per calmodulina11,12. Questi pattern genotipici attribuiscono gli eventi aritmici al rilascio patologico non regolato del deposito di SR Ca2+12.
Il rilascio spontaneo di Ca 2+ da SR può essere rilevato come scintille di Ca 2+ o onde di Ca 2+, che attivano lo scambiatore Na+/Ca 2+ (NCX). Lo scambiatore di un Ca2+ per tre Na+ genera una corrente verso l'interno, che accelera la depolarizzazione diastolica e porta la tensione di membrana alla soglia del potenziale d'azione (AP). Nei topi knock-in di RyR2, l'aumento dell'attività di RyR2R4496C nel nodo senoatriale (SAN) porta a una diminuzione imprevista dell'automaticità di SAN da parte di Ca 2+-dipendente della deplezione di ICa,L e SR Ca2+ durante la diastole, identificando alterazioni fisiopatologiche subcellulari che contribuiscono alla disfunzione SAN nei pazienti con CPVT 13,14. L'insorgenza delle relative onde citosoliche di Ca 2+ dei cardiomiociti è più probabile a seguito di aumenti del [Ca2+] citosolico di fondo a seguito della sensibilizzazione a RyR da parte delle catecolamine, incluso l'isoproterenolo (ISO).
Cambiamenti cinetici dettagliati nella segnalazione di Ca 2+ a seguito del rilascio di Ca2+ mediato da RyR2 in risposta all'attivazione del potenziale d'azione (AP) che potrebbe essere la causa delle aritmie ventricolari osservate nei modelli cardiaci intatti di CPVT rimangono da determinare per l'intera gamma di genotipi RyR2 riportati12. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ad alto rendimento dei segnali Ca2+ e dei potenziali transmembrana (Vm) in cuori murini wild-type (WT) ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e dopo la sfida con isoproterenolo. Questo protocollo fornisce un metodo per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in cuori di topo isolati.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m filtro siringa</td><td>Fabbrica di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td>N/A</td><td>Per filtrare la soluzione</td></tr><tr><td>15 ml di provetta da centrifuga</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Cina</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pasteur pipetta</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. Cina</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 ml siringa</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Provetta PCR</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. Cina</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote le soluzioni di riserva&nbsp; per evitare il congelamento ripetuto e lo scongelamento</td></tr><tr><td>50 ml provetta da centrifuga</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Cina</td><td>CFT011500</td><td>Store Soluzione di Tyrode a 4 ° C per l'isolamento cardiaco di follow-up</td></tr><tr><td>Filtro 585/40 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>N/A</td><td>Filtro per il segnale del calcio</td></tr><tr><td>Filtro passa-lungo 630 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>G15604AJ</td><td>Filtro per il segnale di tensione</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanolo)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Regno Unito</td><td>T48402-100G</td><td>Per ridurre al minimo la sofferenza e il riflesso del dolore</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Stati Uniti</td><td></td><td>SLBV5564 Disaccoppiatore di eccitazione-contrazione per eliminare gli artefatti di movimento durante la mappatura</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>SLBK1794V</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>Bagno termostatico su misura</td><td>MappingLab, Regno Unito</td><td>TBC-2.1</td><td>Per mantenere la temperatura della soluzione</td></tr> <tr><td>di perfusioneDimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>Solvente per coloranti</td></tr><tr><td>Pinze Dumont Fabbrica</td><td>di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>Software ElectroMap</td><td>Università di Birmingham</td><td>N/A</td><td>Quantificazione dei parametri elettrici</td></tr><tr><td>Fotocamera EMCCD</td><td>Evolve 512 Delta, Fotometria, Tucson, AZ, Stati</td> <td>UnitiA18G150001</td><td>Acquisire immagini per segnali ottici</td></tr><tr><td>ET525/36 filtro rivestito per polverizzazione catodica</td><td>Tecnologia Chroma</td><td>319106</td><td>Filtro di eccitazione</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>SLBT4811V</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>Eparina sodica</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Cina</td> <td>(H51021209)</td><td>Per prevenire coaguli di sangue nell'arteria coronaria</td></tr><tr><td>&nbsp; Pinze dell'iride</td><td>Fabbrica di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenolo</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, Stati Uniti</td><td>HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>SLBS5003</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Regno Unito</td><td>7355/7356</td><td>La luce di eccitazione delle sonde a fluorescenza</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Regno Unito</td><td>7352</td><td>Controllo dei LED</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Mayo Fabbrica di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Campionamento dei segnali ottici</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>BCBS6841V</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Regno Unito</td><td>M5337</td><td>Collegare lo stimolatore elettrico e il software Spike2</td></tr><tr><td>Stimolatore di campo MyoPacer EP</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, Stati Uniti</td><td>S006152</td><td>Stimolatore elettrico</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>SLBS2340V</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>BCBW9042</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti</td><td>SLBX3605</td><td>Per la soluzione di Tyrode</td></tr><tr><td>Sistema</td><td>NeuroLog Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>Per amplificatore ECG</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, Regno Unito</td><td>N/A</td><td>Alternanti di calcio e Analisi dell'aritmia</td></tr><tr><td>Forbici oftalmiche</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, Cina</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Regno Unito</td><td>6970</td><td>Dividere la luce di emissione per rilevare Ca2+ e Vm&nbsp; contemporaneamente</td></tr><tr><td>Pompa peristalica</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Cina, </td><td>BT100-2J</td><td>Per pompare la soluzione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti</td><td>1899021</td><td>Per migliorare il carico con Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Stati Uniti</td><td>1971387</td><td>Colorante sensibile alla tensione</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti</td><td>1890519</td><td>Indicatore di calcio</td></tr><tr><td>Tubo in gel di silice</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Cina,</td> <td>96402-16</td><td>Collegare con la pompa peristaltica</td></tr><tr><td>Sutura di seta</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Cina</td><td>20172650032</td><td>Per riparare l'aorta</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Regno Unito</td><td>N/A</td><td>Per registrare e analizzare i dati ECG</td></tr><tr><td>Stimolazione elettrodo</td><td>MappingLab, Regno Unito</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>Per sorgente luminosa</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>Per sorgente luminosa</td></tr></tbody></table>

mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in ryr2r2474s di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfa a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono deteriorarsi in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale. Il cuore di topo è una specie molto diffusa per la modellazione di malattie aritmiche cardiache ereditarie, tra cui la CPVT. La mappatura ottica simultanea del potenziale transmembrana (Vm) e dei transienti di calcio (CaT) da cuori di topo perfusi con Langendorff ha il potenziale per chiarire i meccanismi alla base dell'aritmogenesi. Rispetto all'indagine a livello cellulare, la tecnica di mappatura ottica può testare alcuni parametri elettrofisiologici, come la determinazione dell'attivazione, la velocità di conduzione, la durata del potenziale d'azione e la durata del CaT. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ottica ad alto rendimento di CaT e Vm in cuori murini wild-type ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e durante la sfida con isoproterenolo. Questo approccio ha dimostrato un metodo fattibile e affidabile per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in una preparazione cardiaca di topo ex vivo.

La mappatura ottica è stata un approccio popolare nello studio delle aritmie cardiache complesse nell'ultimo decennio. La configurazione di mappatura ottica è costituita da una telecamera EMCCD, che fornisce una frequenza di campionamento fino a 1.000 Hz e una risoluzione spaziale di 74 x 74 μm per ogni pixel. Consente un rapporto segnale-rumore piuttosto elevato durante il campionamento del segnale (Figura 1). Una volta che il cuore perfuso di Langendorff raggiunge uno stato stabile e il ca...

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Questo metodo ci aiuterà a rivelare le proprietà e i meccanismi elettrofisiologici degli strisci di arresto ventricolare associati a malattie come la tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica. Utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere il potenziale di membrana e i segnali intercellulari del calcio simultaneamente nell'ambito di vari protocolli di stimolazione elettrica programmata, il che è particolarmente adatto per esplorare i meccanismi e le dinamiche alla base della malattia aritmica cardiaca come la CPVT. Per eseguire con successo questo esperimento, assicurati di avere un cuore ben perfuso, un corretto caricamento del colorante, il disaccoppiamento eccitazione-contrazione e un'attenta impostazione della fotocamera.Per iniziare, impostare il sistema di mappatura ottica e accendere la fotocamera per una temperatura di campionamento stabile a meno 50 gradi Celsius. Mettere il cuore di topo raccolto nella soluzione fredda di CREB per rallentare il metabolismo e proteggere il cuore. Rimuovere il tessuto circostante dell'aorta.Usa un ago cannulante su misura per incannularlo e fissalo con una sutura di seta 4-0. Ora perfondere il cuore con il sistema Langendorff a una velocità costante da 3,5 a 4,0 millilitri al minuto. Inserire un tubicino di plastica nel ventricolo sinistro per rilasciare la congestione di soluzione nella camera per evitare un precarico eccessivo e fissare il tubo di plastica nell'ago cannulante.Quindi inserire due cavi nel perfuso nella vasca da bagno e accendere le alimentazioni per la scatola dell'amplificatore dell'elettrocardiogramma e il controller della stimolazione elettrica. Successivamente, avviare l'elettrocardiogramma o il software ECG di riferimento e monitorare continuamente l'ECG. Eseguire i passaggi successivi al buio quando il cuore raggiunge una condizione di stato stabile.Perfondere costantemente la miscela di soluzione di blebbistatina CREBs nel cuore per 10 minuti per disaccoppiare la contrazione dall'eccitazione ed evitare artefatti di contrazione durante le riprese. Quindi, usando una torcia rossa, esamina il cuore per confermare la completa cessazione delle contrazioni. Perfondere il cuore con la soluzione di lavoro Rhod-2 AM per 15 minuti nel sistema di perfusione Langendorff dopo aver disaccoppiato la contrazione dell'eccitazione.Mantenere l'apporto di ossigeno durante il caricamento intracellulare del colorante di calcio. Per evitare la formazione di bolle dal pluronico F-127, inserire una trappola per bolle nel sistema di perfusione. Diluire 10 microlitri di soluzione madre RH 237 in 50 millilitri di perfuso e caricare per 10 minuti.Dopo aver completato il doppio caricamento del colorante, scatta una sequenza di foto. Verificare che i segnali di tensione e calcio siano adeguati per l'analisi. Accendere i due LED per le luci di eccitazione e regolarne l'intensità su un intervallo appropriato.Posiziona il cuore sotto il dispositivo di rilevamento, assicurandoti che sia ben illuminato dai due LED che regolano il diametro del punto luminoso a due centimetri. Impostare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il cuore a 10 centimetri per ottenere la frequenza di campionamento e la risoluzione spaziale desiderate. Aprire il software di campionamento del segnale per controllare contemporaneamente la telecamera e acquisire i segnali di tensione e calcio.Avviare lo stimolatore di campo MyoPacer e impostare il modello di stimolazione sulla logica del transistor a transistor con due millisecondi di durata del ritmo per impulso. Impostare l'intensità iniziale a 0,3 volt. Posizionare una coppia di elettrodi di platino attaccati all'epicardio dell'apice del ventricolo sinistro.Applicare 30 stimoli consecutivi S1 a 10 hertz per testare la soglia di tensione diastolica del cuore utilizzando il software di registrazione ECG. Aumentare gradualmente l'ampiezza della tensione fino a ottenere l'acquisizione uno-a-uno. Implementare il protocollo S1-S1 per misurare il calcio o le alternative del potenziale d'azione e le proprietà di restituzione.Regolare il cuore consecutivamente partendo da una durata del ciclo di base di 100 millisecondi. Diminuire la durata del ciclo di 10 millisecondi in ogni sequenza successiva fino a raggiungere i 50 millisecondi. Avviare contemporaneamente la mappatura ottica prima della stimolazione.Per misurare il periodo refrattario effettivo ventricolare utilizzando il protocollo di stimolo S1-S2, iniziare con una durata del ciclo di stimolazione S1-S1 di 100 millisecondi. Accoppiare S2 a 60 millisecondi e diminuire con un decremento a passi di due millisecondi fino a quando S2 non riesce a catturare il complesso QRS ectopico. Per l'induzione dell'aritmia, somministrare una stimolazione perpetua a 50 hertz ed eseguire lo stesso episodio di stimolazione dopo aver atteso un intervallo di due secondi di riposo.Monitorare attentamente le registrazioni dell'elettrocardiogramma durante il periodo di stimolazione continua ad alta frequenza per iniziare prontamente le registrazioni simultanee di mappatura ottica quando viene generata un'onda aritmica interessante. Procedere all'acquisizione di immagini utilizzando la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni. Nel software di acquisizione delle immagini, premere Seleziona cartella e caricare le immagini per avviare il processo di analisi semiautomatica dei dati video massivi.Immettere i parametri di campionamento corretti per l'analisi. Impostare manualmente la soglia dell'immagine e selezionare l'area di interesse. Applicare un filtro spaziale gaussiano di tre x tre pixel, un filtro Savitzky-Golay e una correzione della linea di base con cappello a cilindro.Quindi premere Elabora immagini per rimuovere la linea di base e calcolare i parametri elettrofisiologici come APD-80 e CATD-50. Impostare il tempo di inizio della durata del potenziale d'azione al picco e il punto terminale all'80% di ripolarizzazione per il calcolo dell'APD-80. Allo stesso modo, definisci il tempo di inizio della durata transitoria del calcio come il picco con il punto terminale che è l'80%rilassamento.Vengono mostrate le tracce tipiche nelle mappe di calore di APD-80 e CATD-80. L'isoproterenolo accorcia l'APD-80 e la tachicardia ventricolare polimorfa wild type e catecolaminergica o i topi CPVT, ma non è stata riscontrata alcuna differenza dopo la sfida con isoproterenolo. I topi CATD-80 e CPVT erano più lunghi rispetto al tipo selvatico dopo la sfida con isoproterenolo, mentre non c'era alcun significato prima del trattamento.Secondo i segnali di tensione, i cuori wild type e CPVT possedevano la stessa capacità di conduzione attraverso l'epicardio al basale e dopo l'intervento con isoproterenolo. Le mappe termiche hanno dimostrato che i topi CPVT hanno la stessa capacità di conduzione dei topi wild-type prima e dopo la sfida con isoproterenolo. L'analisi delle alternative di ampiezza del calcio ha mostrato che i segnali di calcio nei cuori wild-type sono rimasti stabili al basale durante la stimolazione consecutiva S1-S1 a 14,29 e 16,67 hertz, mentre i cuori CPVT hanno mostrato alternative dipendenti dalla frequenza.Dopo la sfida con isoproterenolo, i cuori CPVT hanno mostrato alternative dipendenti dalla frequenza e segnale di calcio durante la stimolazione S1-S1, mentre i cuori wild-type non sono stati influenzati. L'analisi dell'aritmia tachiforme ha suggerito che sia i cuori wild type che quelli CPVT mostrano una conduzione normale durante la stimolazione a raffica a 50 hertz al basale. Dopo la profusione con isoproterenolo, i cuori CPVT hanno mostrato rotori ad alta frequenza dopo una stimolazione a raffica a 50 hertz, mentre i cuori wild-type hanno mantenuto una conduzione normale.Seguendo questa procedura, i tipi di adogen e i topi wild-type vengono utilizzati per illustrare le proprietà elettrofisiologiche e funzionali in questi modelli o nell'invenzione di farmaci. La mappatura ottica è uno strumento potente per lo studio delle aritmie cardiache, tuttavia non può essere utilizzata clinicamente a causa della limitazione del colorante fluorescente sotto il disaccoppiamento della contrazione di eccitazione. Con lo sviluppo di fluorescenti propri per diverse molecole bersaglio nell'ambito dello sviluppo della tecnologia di calcolo ad alta rivoluzione, la tecnica di mappatura ottica cardiaca è destinata a raggiungere solo applicazioni.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

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Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Qui, presentiamo un protocollo per la mappatura ottica di attività elettrica dal mouse atrio destro e soprattutto il nodo seno-atriale, con una risoluzione spaziale e temporale elevata.

Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Presentiamo la metodologia per l'isolamento dei miociti murini e come ottenere tracce di tensione o calcio contemporaneamente con tracce di accorciamento sarcomero utilizzando la fotometria a fluorescenza con misurazioni simultanee della geometria cellulare digitale.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Questo lavoro riporta un metodo per controllare il ritmo cardiaco di cuori murini intatti di topi transgenici channelrhodopsin-2 (ChR2) utilizzando la fotostimolazione locale con un array di micro-LED e la mappatura ottica simultanea del potenziale della membrana epicardica.

Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Scopri la mappatura ottica a doppio colorante per studiare le aritmie cardiache nei cuori di topi knock-in RyR2R2474S affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (Video) | JoVE Journal

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2^R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

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