Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

Questo metodo ci aiuterà a rivelare le proprietà e i meccanismi elettrofisiologici degli strisci di arresto ventricolare associati a malattie come la tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica. Utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere il potenziale di membrana e i segnali intercellulari del calcio simultaneamente nell'ambito di vari protocolli di stimolazione elettrica programmata, il che è particolarmente adatto per esplorare i meccanismi e le dinamiche alla base della malattia aritmica cardiaca come la CPVT. Per eseguire con successo questo esperimento, assicurati di avere un cuore ben perfuso, un corretto caricamento del colorante, il disaccoppiamento eccitazione-contrazione e un'attenta impostazione della fotocamera.

Per iniziare, impostare il sistema di mappatura ottica e accendere la fotocamera per una temperatura di campionamento stabile a meno 50 gradi Celsius. Mettere il cuore di topo raccolto nella soluzione fredda di CREB per rallentare il metabolismo e proteggere il cuore. Rimuovere il tessuto circostante dell'aorta.

Usa un ago cannulante su misura per incannularlo e fissalo con una sutura di seta 4-0. Ora perfondere il cuore con il sistema Langendorff a una velocità costante da 3,5 a 4,0 millilitri al minuto. Inserire un tubicino di plastica nel ventricolo sinistro per rilasciare la congestione di soluzione nella camera per evitare un precarico eccessivo e fissare il tubo di plastica nell'ago cannulante.

Quindi inserire due cavi nel perfuso nella vasca da bagno e accendere le alimentazioni per la scatola dell'amplificatore dell'elettrocardiogramma e il controller della stimolazione elettrica. Successivamente, avviare l'elettrocardiogramma o il software ECG di riferimento e monitorare continuamente l'ECG. Eseguire i passaggi successivi al buio quando il cuore raggiunge una condizione di stato stabile.

Perfondere costantemente la miscela di soluzione di blebbistatina CREBs nel cuore per 10 minuti per disaccoppiare la contrazione dall'eccitazione ed evitare artefatti di contrazione durante le riprese. Quindi, usando una torcia rossa, esamina il cuore per confermare la completa cessazione delle contrazioni. Perfondere il cuore con la soluzione di lavoro Rhod-2 AM per 15 minuti nel sistema di perfusione Langendorff dopo aver disaccoppiato la contrazione dell'eccitazione.

Mantenere l'apporto di ossigeno durante il caricamento intracellulare del colorante di calcio. Per evitare la formazione di bolle dal pluronico F-127, inserire una trappola per bolle nel sistema di perfusione. Diluire 10 microlitri di soluzione madre RH 237 in 50 millilitri di perfuso e caricare per 10 minuti.

Dopo aver completato il doppio caricamento del colorante, scatta una sequenza di foto. Verificare che i segnali di tensione e calcio siano adeguati per l'analisi. Accendere i due LED per le luci di eccitazione e regolarne l'intensità su un intervallo appropriato.

Posiziona il cuore sotto il dispositivo di rilevamento, assicurandoti che sia ben illuminato dai due LED che regolano il diametro del punto luminoso a due centimetri. Impostare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il cuore a 10 centimetri per ottenere la frequenza di campionamento e la risoluzione spaziale desiderate. Aprire il software di campionamento del segnale per controllare contemporaneamente la telecamera e acquisire i segnali di tensione e calcio.

Avviare lo stimolatore di campo MyoPacer e impostare il modello di stimolazione sulla logica del transistor a transistor con due millisecondi di durata del ritmo per impulso. Impostare l'intensità iniziale a 0,3 volt. Posizionare una coppia di elettrodi di platino attaccati all'epicardio dell'apice del ventricolo sinistro.

Applicare 30 stimoli consecutivi S1 a 10 hertz per testare la soglia di tensione diastolica del cuore utilizzando il software di registrazione ECG. Aumentare gradualmente l'ampiezza della tensione fino a ottenere l'acquisizione uno-a-uno. Implementare il protocollo S1-S1 per misurare il calcio o le alternative del potenziale d'azione e le proprietà di restituzione.

Regolare il cuore consecutivamente partendo da una durata del ciclo di base di 100 millisecondi. Diminuire la durata del ciclo di 10 millisecondi in ogni sequenza successiva fino a raggiungere i 50 millisecondi. Avviare contemporaneamente la mappatura ottica prima della stimolazione.

Per misurare il periodo refrattario effettivo ventricolare utilizzando il protocollo di stimolo S1-S2, iniziare con una durata del ciclo di stimolazione S1-S1 di 100 millisecondi. Accoppiare S2 a 60 millisecondi e diminuire con un decremento a passi di due millisecondi fino a quando S2 non riesce a catturare il complesso QRS ectopico. Per l'induzione dell'aritmia, somministrare una stimolazione perpetua a 50 hertz ed eseguire lo stesso episodio di stimolazione dopo aver atteso un intervallo di due secondi di riposo.

Monitorare attentamente le registrazioni dell'elettrocardiogramma durante il periodo di stimolazione continua ad alta frequenza per iniziare prontamente le registrazioni simultanee di mappatura ottica quando viene generata un'onda aritmica interessante. Procedere all'acquisizione di immagini utilizzando la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni. Nel software di acquisizione delle immagini, premere Seleziona cartella e caricare le immagini per avviare il processo di analisi semiautomatica dei dati video massivi.

Immettere i parametri di campionamento corretti per l'analisi. Impostare manualmente la soglia dell'immagine e selezionare l'area di interesse. Applicare un filtro spaziale gaussiano di tre x tre pixel, un filtro Savitzky-Golay e una correzione della linea di base con cappello a cilindro.

Quindi premere Elabora immagini per rimuovere la linea di base e calcolare i parametri elettrofisiologici come APD-80 e CATD-50. Impostare il tempo di inizio della durata del potenziale d'azione al picco e il punto terminale all'80% di ripolarizzazione per il calcolo dell'APD-80. Allo stesso modo, definisci il tempo di inizio della durata transitoria del calcio come il picco con il punto terminale che è l'80%rilassamento.

Vengono mostrate le tracce tipiche nelle mappe di calore di APD-80 e CATD-80. L'isoproterenolo accorcia l'APD-80 e la tachicardia ventricolare polimorfa wild type e catecolaminergica o i topi CPVT, ma non è stata riscontrata alcuna differenza dopo la sfida con isoproterenolo. I topi CATD-80 e CPVT erano più lunghi rispetto al tipo selvatico dopo la sfida con isoproterenolo, mentre non c'era alcun significato prima del trattamento.

Secondo i segnali di tensione, i cuori wild type e CPVT possedevano la stessa capacità di conduzione attraverso l'epicardio al basale e dopo l'intervento con isoproterenolo. Le mappe termiche hanno dimostrato che i topi CPVT hanno la stessa capacità di conduzione dei topi wild-type prima e dopo la sfida con isoproterenolo. L'analisi delle alternative di ampiezza del calcio ha mostrato che i segnali di calcio nei cuori wild-type sono rimasti stabili al basale durante la stimolazione consecutiva S1-S1 a 14,29 e 16,67 hertz, mentre i cuori CPVT hanno mostrato alternative dipendenti dalla frequenza.

Dopo la sfida con isoproterenolo, i cuori CPVT hanno mostrato alternative dipendenti dalla frequenza e segnale di calcio durante la stimolazione S1-S1, mentre i cuori wild-type non sono stati influenzati. L'analisi dell'aritmia tachiforme ha suggerito che sia i cuori wild type che quelli CPVT mostrano una conduzione normale durante la stimolazione a raffica a 50 hertz al basale. Dopo la profusione con isoproterenolo, i cuori CPVT hanno mostrato rotori ad alta frequenza dopo una stimolazione a raffica a 50 hertz, mentre i cuori wild-type hanno mantenuto una conduzione normale.

Seguendo questa procedura, i tipi di adogen e i topi wild-type vengono utilizzati per illustrare le proprietà elettrofisiologiche e funzionali in questi modelli o nell'invenzione di farmaci. La mappatura ottica è uno strumento potente per lo studio delle aritmie cardiache, tuttavia non può essere utilizzata clinicamente a causa della limitazione del colorante fluorescente sotto il disaccoppiamento della contrazione di eccitazione. Con lo sviluppo di fluorescenti propri per diverse molecole bersaglio nell'ambito dello sviluppo della tecnologia di calcolo ad alta rivoluzione, la tecnica di mappatura ottica cardiaca è destinata a raggiungere solo applicazioni.