Utilizzo di reagenti di riferimento per confermare la robustezza dei saggi di rilascio di citochine per la previsione della sicurezza degli anticorpi monoclonali

I test di sicurezza dei nuovi farmaci sono fondamentali e questo protocollo descrive come utilizzare gli standard convalidati per valutare la riproducibilità, la robustezza e i potenziali limiti di una piattaforma CRS. Questa tecnica è stata convalidata con questi reagenti in 11 diversi laboratori e in uno studio collaborativo internazionale con modelli di risposta simili osservati, migliorando così gli sforzi di armonizzazione e riproducibilità. Le applicazioni di questa tecnica si estendono al miglioramento dei test del rischio di CRS di nuovi anticorpi terapeutici e aiuteranno anche a essere pronti per la gestione clinica di potenziali effetti collaterali.

Questo lavoro serve a migliorare la riproducibilità e l'armonizzazione, e una dimostrazione visiva aumenta le possibilità di riproducibilità. Iniziare ricostituendo il contenuto delle fiale di reagenti di riferimento in un millilitro di acqua distillata sterile e lasciando 5-10 minuti di reidratazione. Quindi, mescolare correttamente ogni soluzione di anticorpi prima di trasferirla in una provetta sterile con tappo.

Successivamente, diluire ciascun anticorpo ricostituito e testare l'anticorpo a 10 microgrammi per millilitro in PBS sterile. Prelevare una piastra per microtitolazione sterile a 96 pozzetti in polipropilene con fondo a U non trattata con TC e aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi diluiti desiderata nei pozzetti designati della piastra. Quindi, incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius prima di eseguire il saggio in fase solida.

Dopo aver raccolto un minimo di 30 millilitri di sangue intero periferico in una provetta eparinizzato, capovolgerla più volte per garantire una corretta miscelazione del campione di sangue con l'eparina di sodio. Mettere da parte 15 millilitri del campione di sangue intero in una provetta separata per utilizzarli successivamente nel test del sangue intero in fase acquosa. Diluire i restanti 15 millilitri di sangue intero aggiungendo un volume uguale di terreno PBS o RPMI 1640 privo di siero.

Stratificare delicatamente il sangue diluito sulla parte superiore di 15 millilitri di un mezzo a gradiente di densità in una provetta da 50 millilitri. Centrifugare la provetta utilizzando un rotore oscillante senza freno e un'accelerazione ridotta a 500 G e temperatura ambiente per 20 minuti per separare il sangue nei suoi diversi componenti. Dopo la centrifugazione, il gradiente di densità si separerà come uno strato superiore di plasma, seguito da un sottile strato di buffy coat contenente PBMC e uno strato inferiore contenente globuli rossi e granulociti polimorfonucleati, inclusi neutrofili ed eosinofili.

Rimuovere con cautela lo strato superiore di plasma, seguito dallo strato successivo, per raccogliere le PBMC. Per il lavaggio, risospendere il buffy coat raccolto in 10 millilitri di PBS o di terreno RPMI 1640 privo di siero. Centrifugare la provetta a partire da 500 G per 10 minuti per pellettare le cellule.

Scartare il surnatante e ripetere nuovamente il lavaggio. Quindi, risospendere il pellet risultante in due millilitri di supporto RPMI completo. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione di PBMC a 1 milione di cellule per millilitro in RPMI completo.

Per il test di rilascio di citochine nel sangue intero in fase acquosa, prelevare il campione di sangue intero precedentemente accantonato, aggiungere 190 microlitri di campione ai pozzetti di una piastra di polistirene con fondo a U a 96 pozzetti, anticorpi per il trattamento termico e reagenti di riferimento prediluiti a 100 microgrammi per millilitro in PBS e aggiungere 10 microlitri dell'anticorpo diluito desiderato ai pozzetti designati contenenti 190 microlitri di sangue intero. Incubare la piastra per 48 ore in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius. Per il saggio di rilascio di citochine PBMC in fase solida, ottenere le piastre rivestite precedentemente preparate.

Utilizzando una pipetta multicanale, scartare la soluzione di anticorpi dalle piastre rivestite. Dopo aver riempito un serbatoio di reagenti con PBS, lavare la piastra tre volte con 200 microlitri di PBS per rimuovere gli anticorpi monoclonali non legati. Aggiungere 200 microlitri della sospensione di PBMC precedentemente preparata a ciascun pozzetto.

Incubare la piastra per 48 ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione di 48 ore con anticorpi monoclonali di controllo e test, centrifugare le piastre a 400 G per cinque minuti. Raccogliere il mezzo condizionato con le cellule o il plasma senza disturbare il pellet cellulare.

Congelare il surnatante o il plasma raccolto a meno 20 gradi Celsius. I risultati del test in fase solida PBMC hanno dimostrato che gli anticorpi di controllo positivi inducono livelli significativamente elevati di citochine rispetto ai controlli isotipici abbinati. È stato anche osservato che il superagonista anti-CD28 induce un cambiamento significativamente più elevato del rilascio di interleuchina-2, o IL-2, rispetto al suo isotipo corrispondente, mentre l'anti-CD3 e l'anti-CD52, pur inducendo ancora l'espressione di IL-2, hanno portato a cambiamenti di pieghe inferiori.

Nel test in fase acquosa su tutto il sangue, il livello di citochine rilevabili era relativamente inferiore rispetto al test in fase solida, ma era caratterizzato da una maggiore sensibilità alla stimolazione da parte di anti-CD52.