Name: Chiarire il metabolismo del 2,4-dibromofenolo nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Scopri come identificare i metaboliti del 2,4-dibromofenolo nelle piante utilizzando la coltura di callo vegetale. Questo metodo semplifica la valutazione della degradazione metabolica dei xenobiotici riducendo le interferenze esterne.

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Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (21976160) e dal Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) della provincia di Zhejiang.

1. Differenziazione del callo della carota
NOTA: Autoclavare tutte le apparecchiature utilizzate qui ed eseguire tutte le operazioni in un banco da lavoro ultra-pulito sterilizzato ai raggi UV.
<ol><li>Vernalizzare i semi immergendo i semi di carota uniforme (Daucus carota var. sativus) in acqua deionizzata a 4 °C per 16 ore.</li>
	<li>Sterilizzare in superficie i semi vernalizzati con etanolo al 75% per 20 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua deionizzata sterile in condizioni asettiche.</li>
	<li>Sterilizzare ulteriormente i semi con il 20%di H 2 O2 per 20 minuti e lavarli con acqua deionizzata sterilizzata sei volte in condizioni asettiche.</li>
	<li>germinare asetticamente i semi seminandoli su terreno MS privo di ormoni (pH 5,8, autoclavato a 121 °C per 20 min) contenente l'1% di gel di agar, e incubando a 26 °C con fotoperiodo di 16 h (350 μmol/m2s) per 15 giorni.</li>
	<li>Ottenere gli espianti tagliando l'ipocotile e il cotiledone delle piantine in piccoli pezzi (0,5 cm).</li>
	<li>Trasformare gli espianti in piastre di Petri (da due a quattro espianti per capanna) contenenti 15-20 mL di terreno MS asettico integrato con auximone (acido 2,4-diclorofenossiacetico; 1 mg/L) e fitochinina (6-benzilaminopurina; 0,5 mg/L) in condizioni asettiche.</li>
	<li>Incubare gli espianti al buio a 26 °C per 3-4 settimane per indurre il callo.</li>
	<li>Separare i tessuti calli (circa 1 cm di diametro) formati dagli espianti iniziali utilizzando un bisturi sterile e una pinza. NOTA: I tessuti del callo appena formati sono di colore da bianco a giallo crema e si attaccano liberamente agli espianti iniziali.</li>
</ol>2. Trattamento con 2,4-dibromofenolo
<ol><li>Sciogliere 1 μg di 2,4-dibromofenolo in 10 mL di terreno MS liquido asettico (la concentrazione finale di 2,4-dibromofenolo è 100 ppb, pH 5,6-7,0).</li>
	<li>Aggiungere 3 g di callo di carota fresco (fase 1.8) in matracci di vetro contenenti la soluzione preparata di 2,4-dibromofenolo (fase 2.1) in condizioni asettiche. Consideralo come il trattamento con 2,4-dibromofenolo. NOTA: I palloni di vetro sono stati sterilizzati in autoclave e sigillati con pellicola di paraffina.</li>
	<li>Includere un mezzo di controllo contenente solo la soluzione di 2,4-dibromofenolo (preparata nella fase 2.1) per valutare la degradazione abiotica del 2,4-dibromofenolo.</li>
	<li>Includere un controllo in bianco contenente solo il callo della carota (nessuna soluzione di 2,4-dibromofenolo) per verificare l'eventuale presenza di eventuali contaminazioni.<ol><li>Preparare il bianco di controllo contenente la carota aggiungendo 3 g di callo di carota appena raccolto in 10 ml di terreno MS sterile.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare il trattamento con 2,4-dibromofenolo e i controlli in bianco e in bianco a 130 giri/min e 26 °C al buio in un incubatore per 120 ore.</li>
	<li>Rimuovere i matracci di vetro dall'incubatore per raccogliere i campioni del trattamento con 2,4-dibromofenolo e dei controlli dopo 120 ore di incubazione. NOTA: Tutti i campioni sono stati preparati in triplice copia.</li>
</ol>3. Preparazione del campione
<ol><li>Separare accuratamente il callo dal mezzo MS mediante filtrazione con filtri in fibra di vetro (0,45 μm) per il trattamento con 2,4-dibromofenolo e i controlli. Raccogliere il callo dopo il lavaggio con acqua ultrapura tre volte.</li>
	<li>Liofilizzare il callo raccolto con azoto liquido e successivamente omogeneizzare il callo raccolto (0,2 g) con un macinatore tissutale ad alta produttività a 70 Hz per 3 minuti.</li>
	<li>Spike il callo omogeneizzato aggiungendo 50 μL di surrogato 4-n-NP-d4 da 25 mg/L con una microsiringa di vetro e successivamente facendo vortice per 1 minuto.</li>
	<li>Sonicare i campioni con 5 mL di metanolo/acqua (1:1, v/v) in un ultrasuonatore (150 W, 40 kHz) riempito con acqua ghiacciata per 30 minuti, per estrarre il 2,4-dibromofenolo e i metaboliti.</li>
	<li>Centrifugare le sospensioni a 8.000 x g a 4 °C per 10 minuti e raccogliere i surnatanti mediante pipettaggio.<ol><li>Ripetere tre volte i processi di estrazione del campione di callo e combinare gli estratti.</li>
	</ol></li>
	<li>Passare gli estratti attraverso cartucce di estrazione idrofila lipofila bilanciata in fase solida (HLB SPE) con una portata di 1 mL/min. NOTA: Le cartucce HLB SPE sono state pretrattate in sequenza con 6 mL di metanolo e 6 mL di acqua per rimuovere eventuali interferenze.</li>
	<li>Eluire gli analiti facendo passare 6 mL di metanolo attraverso le cartucce HLB SPE. Quindi, concentrare gli eluenti ottenuti a 1 mL sotto un leggero flusso di azoto gassoso per l'analisi strumentale.</li>
	<li>Iniettare 10 μL di eluenti risultanti nell'UPLC-Q-TOF-MS per l'analisi del 2,4-dibromofenolo e dei loro metaboliti15.<ol><li>Filtrare tutti i campioni con una membrana di nylon da 0,22 μm prima dell'analisi strumentale.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi strumentale
NOTA: Le analisi del 2,4-dibromofenolo e dei loro metaboliti sono state eseguite su un cromatografo liquido ad alte prestazioni (UPLC) in combinazione con uno spettrometro di massa micrOTOF-QII dotato di ionizzazione elettrospray (ESI), operante in modalità ionica positiva e negativa.
<ol><li>Aprire lo sportello del riscaldatore della colonna e installare la colonna UPLC collegando l'ingresso della colonna alla valvola di iniezione e l'uscita della colonna all'ingresso dello spettrometro di massa. NOTA: Per la separazione degli analiti a 40 °C è stata utilizzata una colonna C18 (50 mm x 2,1 mm; dimensione delle particelle 1,7 μm).</li>
	<li>Collegare la fase mobile A (acqua ultrapura) e la fase mobile B (metanolo per cromatografia) allo strumento inserendo l'estremità dei tubi del solvente A e B rispettivamente nei corrispondenti flaconi di solvente.<ol><li>Filtrare tutte le fasi mobili (500 mL per ciascuna) attraverso un filtro da 0,22 μm e sonicare per più di 30 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Nella finestra del software, fare clic su Strumento | Metodo di ingresso per modificare le condizioni del cromatogramma liquido.<ol><li>Impostare le condizioni di gradiente della fase mobile B come segue: una portata di 1,0 mL/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 minuti, dal 5% al 50%; 3,5-6,5 minuti, dal 50% al 100%; 6,5-7 minuti, 100%; 7-10 minuti, dal 100% al 5%.</li>
		<li>Impostare la velocità di iniezione dei campioni nell'UPLC-Q-TOF-MS su 0,2 mL/min. NOTA: L'iniezione del campione viene programmata utilizzando un campionatore completamente automatico.</li>
	</ol></li>
	<li>Nella finestra del software, selezionare MS Method e quindi impostare i parametri di Q-TOF-MS: una portata del gas di essiccazione (N2) di 8 L/min, una temperatura di 300-350 °C; una tensione capillare di 4.500 V; un'energia di collisione di 5-45 V; e un intervallo di scansione completo di 40-800 Da.</li>
	<li>Posizionare le fiale dei campioni nelle posizioni corrispondenti dei vassoi dei campioni in base al numero di serie e reinserire i vassoi dei campioni nella camera del campione. NOTA: Tenere i vassoi dei campioni piatti e assicurarsi che lo sportello della camera dei campioni sia chiuso.</li>
	<li>Nella finestra del software, selezionare File | Nuovo per creare un database. Assegnare un nome al database.</li>
	<li>Caricare il programma di esempio creato in precedenza selezionando MS File | File di ingresso | Iniettare volume.</li>
	<li>Salvare il database nella cartella di esempio del progetto facendo clic su File | Salva.</li>
	<li>Selezionare Esegui | Iniziare dalla finestra principale del software, quindi selezionare Acquisisci dati di esempio e fare clic su OK nella finestra dell'elenco di esempio di avvio per raccogliere i dati. NOTA: Il cromatogramma in tempo reale può essere visualizzato facendo clic su Cromatogramma | Aggiornamento in tempo reale durante il processo di acquisizione dei dati.</li>
	<li>Elaborare i dati nel software selezionando la riga dei dati di destinazione e facendo clic sulla finestra Cromatogramma per visualizzare il cromatogramma MS.</li>
	<li>Nella finestra Cromatogramma , fare clic su Visualizza | TIC | ScanWaveDS | Aggiunta di traccia | OK per ottenere la figlia scansione spettri di massa.</li>
	<li>Identificare i metaboliti confrontando i cromatogrammi del trattamento con 2,4-dibromofenolo e i controlli.</li>
	<li>Chiarire i metaboliti candidati in base al tempo di ritenzione, alla massa e ai modelli di frammentazione16,17. NOTA: L'errore di accuratezza della massa tra i valori sperimentali m/z degli ioni progenitori dei metaboliti candidati e i corrispondenti m/z teorici deve essere inferiore a 10 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+investigation+on+plasticizers%2C+bisphenol+A%2C+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li>
<li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants%2C+bisphenol+A%2C+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).</li>
<li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232(2021).</li>
<li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta%2C+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li>
<li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li>
<li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li>
<li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li>
<li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole%2C+flurtamone%2C+fenhexamid%2C+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.%2C+Glycine+max+%28L.%29+Merr.%2C+Zea+mays+L.%2C+and+Triticum+aestivum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li>
<li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li>
<li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants%3A+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064(2021).</li>
<li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li>
<li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation%3A+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li>
<li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li>
<li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e%2C4-Dibromophenol+in+Carrot%3A+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li>
<li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li>
<li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment%3A+ready+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li>
<li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è stato sviluppato per identificare in modo efficiente la biotrasformazione degli xenobiotici nelle piante. La fase critica di questo protocollo è la coltura del callo della pianta. La parte più difficile è la differenziazione e il mantenimento del callo della pianta, perché il callo della pianta si infetta facilmente e si sviluppa nei tessuti vegetali. Pertanto, è importante assicurarsi che tutte le apparecchiature utilizzate siano sterilizzate in autoclave e che tutte le operazioni vengano eseguite in...

Un numero crescente di inquinanti organici è stato scartato nell'ambiente a causa delle attività antropiche1,2 e il suolo è considerato un importante pozzo di assorbimento per questi contaminanti 3,4. I contaminanti presenti nel suolo possono essere assorbiti dalle piante e potenzialmente trasferiti a organismi di livello trofico superiore lungo le catene alimentari, entrando direttamente nel corpo umano attraverso il consumo delle colture, portando di conseguenza a un'esposizione involontaria 5,6. Le piante utilizzano diversi percorsi per metabolizzare gli xenobiotici per la disintossicazione7; Chiarire il metabolismo degli xenobiotici è importante, in quanto controlla il destino effettivo dei contaminanti nelle piante. Poiché i metaboliti possono essere escreti dalle foglie (nell'atmosfera) o dalle radici, la determinazione dei metaboliti nelle primissime fasi di esposizione offre quindi la possibilità di testare un numero esteso di metaboliti8. Tuttavia, gli studi che utilizzano piante intatte richiedono esperimenti a lungo termine e complessi protocolli di preparazione dei campioni che possono essere influenzati da vari fattori.
Le colture di callo delle piante, quindi, sono una buona alternativa per studiare il metabolismo degli xenobiotici nelle piante, in quanto possono ridurre notevolmente i tempi di trattamento. Queste colture escludono l'interferenza microbica e la degradazione fotochimica, semplificano l'effetto matrice delle piante intatte, standardizzano le condizioni di coltivazione e richiedono meno sforzo sperimentale. Le colture di callo vegetale sono state applicate con successo come approccio alternativo negli studi metabolici di triclosan9, nonilfenolo10 e tebuconazolo8. Questi studi hanno dimostrato che i modelli metabolici nelle colture di calli erano simili a quelli delle piante intatte. Questo studio propone un metodo per l'identificazione efficiente e accurata dei metaboliti degli xenobiotici nelle piante senza protocolli complessi e dispendiosi in termini di tempo. Qui, utilizziamo colture di calli vegetali in combinazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione per l'analisi di metaboliti con segnali a bassa intensità11,12.
A tal fine, le sospensioni di callo di carota (Daucus carota var. sativus) sono state esposte a 100 μg/L di 2,4-dibromofenolo per 120 ore in uno shaker a 130 giri/min e 26 °C. Il 2,4-dibromofenolo è stato scelto a causa della sua attività endocrina dirompente13 e della sua presenza diffusa nel suolo14. I metaboliti sono stati estratti e analizzati mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. Il protocollo qui proposto può indagare il metabolismo in pianta di altri tipi di composti organici che possono essere ionizzati.

<table><tbody><tr><td>acido 2,4-diclorofenossiacetico</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP-d4</td><td>Pointe-Claire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-benzilamminopurina</td><td>WAKO</td><td>0,5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75% etanolo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>1269101-500ML</td><td></td></tr><tr><td>7890A-5975&nbsp; per gascromatografia</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQULTY ultra-performance&nbsp; cromatografia liquida</td><td>Acque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro ambrato</td><td>Acque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per clima artificiale</td><td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co., LTD</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>Autoclavi</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>C18 colonna</td><td>ACQUITY UPLC BEH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna capillare DB-5MS</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40071190-4L</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti ad alta produttività</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicrOTOF-QII spettrometro di massa</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>N-esano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H109658-4L</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di soffiaggio dell'azoto&nbsp;</td><td>AOSHENG</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>Isomeri NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB cartucce</td><td>Waters</td><td>60 mg/3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Research plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>100-1000 &; L</td></tr><tr><td>Semi di carota mignolo (Daucus carota var. sativus)&nbsp;</td><td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitazione&nbsp; Incubatrici</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., ltd.</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore in fase solida</td><td>AUTO SCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina ad ultrasuoni</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>Banco da lavoro ultra-pulito sterilizzato UV</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chiarire il metabolismo del 2,4-dibromofenolo nelle piante

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Le colture possono essere ampiamente esposte a inquinanti organici, poiché il suolo è un importante pozzo di assorbimento per gli inquinanti scartati nell'ambiente. Ciò crea una potenziale esposizione umana attraverso il consumo di alimenti inquinanti accumulati. Chiarire l'assorbimento e il metabolismo degli xenobiotici nelle colture è essenziale per la valutazione del rischio di esposizione alimentare nell'uomo. Tuttavia, per tali esperimenti, l'uso di piante intatte richiede esperimenti a lungo termine e complessi protocolli di preparazione dei campioni che possono essere influenzati da vari fattori. Le colture di callo delle piante combinate con la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) possono fornire una soluzione per l'identificazione accurata e rapida dei metaboliti degli xenobiotici nelle piante, in quanto possono evitare interferenze dal microambiente microbico o fungino, ridurre la durata del trattamento e semplificare l'effetto matrice delle piante intatte. Il 2,4-dibromofenolo, un tipico ritardante di fiamma e interferente endocrino, è stato scelto come sostanza modello a causa della sua presenza diffusa nel suolo e del suo potenziale di assorbimento da parte delle piante. In questo caso, il callo della pianta è stato generato da semi di asepsi ed esposto a terreno di coltura sterile contenente 2,4-dibromofenolo. I risultati hanno mostrato che otto metaboliti del 2,4-dibromofenolo sono stati identificati nei tessuti del callo della pianta dopo 120 ore di incubazione. Ciò indica che il 2,4-dibromofenolo è stato rapidamente metabolizzato nei tessuti callosi della pianta. Pertanto, la piattaforma di coltura del callo vegetale è un metodo efficace per valutare l'assorbimento e il metabolismo degli xenobiotici nelle piante.

I passaggi del protocollo sono illustrati nella Figura 1. Seguendo il protocollo, abbiamo confrontato il cromatogramma dell'estratto di callo di carota dal trattamento con 2,4-dibromofenolo ai controlli e abbiamo trovato otto picchi distinti che sono presenti nel trattamento con 2,4-dibromofenolo ma assenti nei controlli (Figura 2). Ciò indica che un totale di otto metaboliti del 2,4-dibromofenolo (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 e M187) sono stati rile...

Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per l'identificazione dei metaboliti del 2,4-dibromofenolo nelle piante.

Chiarire il metabolismo del 2,4-dibromofenolo nelle piante

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

La coltura del callo delle piante fornisce una soluzione per la valutazione accurata, efficiente e rapida della degradazione metabolica degli xenobiotici nelle piante. La coltura del callo delle piante può escludere l'interferenza del microbioma o dei funghi e la degradazione fotochimica, semplificare l'effetto matrice delle piante intatte, standardizzare le condizioni di coltivazione, ridurre la durata del trattamento e richiedere meno sforzo sperimentale. Il metodo qui proposto potrebbe fornire informazioni sul comportamento di assorbimento e sui meccanismi metabolici di diversi inquinanti organici sulle colture ed è utile per gli sforzi sulla valutazione del rischio ambientale.Per iniziare, sterilizzare in autoclave tutta l'attrezzatura ed eseguire tutte le operazioni in un banco da lavoro ultra pulito sterilizzato ai raggi UV. Sterilizzare la superficie del seme vernalizzata con etanolo al 75% per 20 minuti. Sciacquarli tre volte con acqua deionizzata sterile e sterilizzarli nuovamente con perossido di idrogeno al 20% per 20 minuti.Dopo aver lavato i semi con acqua deionizzata sterilizzata per sei volte, farli germinare in modo asettico seminando su terreno Murashige e Skoog au

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Scopri come identificare i metaboliti del 2,4-dibromofenolo nelle piante utilizzando la coltura di callo vegetale. Questo metodo semplifica la valutazione della degradazione metabolica dei xenobiotici riducendo le interferenze esterne.

Chiarire il metabolismo del 2,4-dibromofenolo nelle piante

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