Vascolarizzazione efficiente degli organoidi renali attraverso il trapianto di intracelomica negli embrioni di pollo

Gli organoidi renali coltivati in vitro rimangono immaturi, limitandone l'applicabilità. E questo metodo di trapianto intracelomico induce vascolarizzazione e migliora la maturazione degli organoidi. La procedura è molto efficiente, consentendo il trapianto e l'analisi di un gran numero di organoidi in un esperimento.

Dopo aver preparato organoidi renali derivati da HIPSC e incubato le uova fecondate di livorno, creare una finestra nel guscio d'uovo il terzo giorno di incubazione. Metti un piccolo pezzo di nastro trasparente sulla punta appuntita dell'uovo. Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo nel mezzo del nastro trasparente picchiettandolo con l'estremità affilata di un paio di forbici da dissezione.

Quindi, inserire un ago da 19 gauge su una siringa da cinque millilitri nel foro con un angolo di 45 gradi. Aspirare da due a tre millilitri di albumina dall'uovo per abbassare l'embrione all'interno dell'uovo. Nascondere il foro con un secondo pezzo di nastro trasparente, quindi posizionare un grande pezzo di nastro trasparente sulla matita contrassegnata verso l'alto verso il lato dell'uovo.

Fai un buco nel guscio d'uovo nel mezzo del nastro trasparente picchiettandolo con l'estremità affilata di un paio di forbici da dissezione. Taglia una piccola finestra circolare nel guscio d'uovo da questo foro usando forbici da dissezione curve. Guarda attraverso questa finestra per individuare l'embrione.

Quindi, ingrandisci la finestra per ottimizzare l'accesso all'embrione. Rimuovere eventuali pezzi grandi di guscio d'uovo che potrebbero essere caduti sopra l'embrione usando una pinza. Rimuovere i pezzi più piccoli mettendo alcune gocce di DPBS con calcio e magnesio sull'embrione con una pipetta di trasferimento di plastica, quindi aspirando il DPBS con il guscio d'uovo nella pipetta.

Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, aggiungere tre gocce di DPBS, integrate con streptomicina penicillina allo 0,5% all'uovo. Sigillare accuratamente la finestra con un grande pezzo di nastro trasparente prima di riporre l'uovo nell'incubatrice fino al quarto giorno di incubazione. Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve.

Metti l'uovo sotto un microscopio da dissezione su un supporto di gomma o un cartone per uova. L'embrione di pollo è ora nella fase 23-24 di Hamburger-Hamilton e giace sul lato sinistro con il lato destro rivolto verso lo spettatore. Localizzare l'ala destra e la gemma della gamba dell'embrione poiché il celoma sarà valutato tra questi due germogli degli arti.

Nell'area tra l'ala destra e la gemma della gamba, crea un'apertura consecutiva nella membrana vitellina, nel corion e nell'amnione tenendoli con due paia di pinze da dissezione e tirandoli delicatamente in direzioni opposte. Controlla se c'è un accesso libero alla cavità celomica. Afferrare delicatamente il bordo della parete del corpo tra l'ala e il germoglio dell'arto con un paio di pinze da dissezione e tirarlo leggermente verso l'osservatore.

La cavità celomica deve essere chiaramente visibile. Inserire con attenzione uno strumento smussato ma sottile nella cavità celomica. Posizionare mezzo organoide all'interno dell'uovo sopra l'allantoide usando un dissettore di dura.

Usando una pinza da dissezione, afferrare con attenzione il bordo della parete del corpo e tirarlo leggermente verso l'osservatore per rendere visibile l'apertura del coelum. Spostare delicatamente l'organoide verso e attraverso l'apertura nella parete del corpo nel coelum con un filo di tungsteno smussato e un supporto per bisturi micro. Spingere leggermente l'organoide cranicamente per alloggiarlo all'interno del celo.

Ora è visibile appena dietro la gemma dell'ala. Aggiungere tre gocce di DPBS all'uovo usando una pipetta di trasferimento di plastica. Sigillare accuratamente la finestra con un grande pezzo di nastro trasparente prima di riporre l'uovo nell'incubatrice fino al giorno 12 dell'incubazione.

Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve. Metti l'uovo sotto un microscopio da dissezione in un supporto di gomma. Valutare la vascolarizzazione e individuare le vene, che possono essere distinte dalle arterie per il loro colore rosso leggermente più brillante.

Per migliorare l'accesso al sistema vascolare, allargare con cura la finestra tagliandola con forbici da dissezione curve. Dopo aver selezionato la vena, inserire la punta dell'ago micro capillare nella vena con un angolo da zero a 20 gradi. Assicurarsi che l'ago sia nella vena spostando delicatamente la punta da un lato all'altro.

Soffiare delicatamente e costantemente nel sistema di iniezione per iniettare la lente culinaris agglutinina. E rimetti l'uovo nell'incubatrice per 10 minuti per farlo circolare. Metti l'uovo in un supporto di gomma sul banco.

Quindi, tagliare le membrane che circondano l'embrione con forbici da dissezione curve. Raccogliere l'embrione dall'uovo con un cucchiaio perforato e decapitare immediatamente l'embrione usando le forbici. Sotto il microscopio a dissezione, posizionare il corpo dell'embrione in una capsula di Petri.

Metti l'embrione sulla schiena nella capsula di Petri e allarga le sue membra. Aprire con attenzione la parete addominale dell'embrione lungo l'asse longitudinale usando una pinza. Individuare l'organoide all'interno dell'embrione.

L'organoide si attacca più frequentemente al lobo del fegato destro, sia sulla punta del coccolo che cranialmente, appena sotto la gabbia toracica. Quindi, è consigliabile iniziare guardando queste posizioni. Una volta individuato l'organoide, rimuoverlo dall'embrione tagliandolo intorno con micro forbici.

Posizionare l'organoide nel tessuto di pollo che è inevitabilmente attaccato ad esso in una capsula di Petri sotto il microscopio da dissezione. Rimuovere il più possibile il tessuto di pollo con una lama di rasoio in acciaio inossidabile a doppio taglio. Le immagini immunofluorescenti di un organoide renale non trapiantato e di un organoide renale trapiantato contengono entrambe strutture glomerulari e tubolari.

Negli organoidi non trapiantati sono presenti alcune cellule endoteliali umane. Nell'organoide trapiantato, una rete vascolare perfusa è visibile in tutto l'organoide. Le immagini ingrandite delle aree inscatolate dimostrano i tre tipi di cellule endoteliali che possono essere distinte negli organoidi trapiantati: cellule endoteliali umane perfuse, cellule endoteliali umane non perfuse e cellule endoteliali perfuse derivate dal pollo.

Negli organoidi non trapiantati, le cellule endoteliali circondano le strutture glomerulari ma non le invadono. Tuttavia, negli organoidi trapiantati, le strutture glomerulari sono vascolarizzate da capillari perfusi. Gli organoidi trapiantati possono essere analizzati utilizzando tecniche diverse a seconda dello scopo dell'esperimento.

Il confronto diretto con i controlli non trapiantati può fornire informazioni sul processo di vascolarizzazione e maturazione.