Name: Una procedura conforme alle GMP per la generazione di cellule T geneticamente modificate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri una procedura conforme alle GMP per la trasduzione di cellule T primarie umane con un gene di interesse. Questo metodo economico facilita la generazione di terapie cellulari modificate geneticamente, inclusi i CAR T-cell, per il trattamento delle neoplasie ematologiche.

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Questa ricerca è stata co-finanziata dall'Unione Europea e dai fondi nazionali greci attraverso il Programma Operativo Competitività, Imprenditorialità e Innovazione, nell'ambito del bando RESEARCH - CREATE - INNOVATE (codice progetto: T2EDK - 00474). Vorremmo anche esprimere la nostra gratitudine alla Fondazione Choose Life per aver fornito un supporto continuo al GMP Lab "Dimitris Lois" dell'Istituto di Terapia Cellulare.

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Patrasso e dal Comitato di Revisione Istituzionale dell'Ospedale Generale Universitario di Patrasso. Prima di ottenere campioni biologici, è stato ottenuto il consenso informato da individui sani. La valutazione dell'idoneità dei partecipanti è stata condotta secondo le procedure istituzionali e in conformità con gli standard JACIE per la leucoaferesi. Se questo protocollo deve essere implementato in un contesto clinico ACT, tutte le procedure devono rispettare le linee guida delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) ed essere eseguite in camere bianche conformi alle GMP. Quando si lavora con vettori virali, sono necessarie speciali precauzioni di sicurezza e queste procedure devono essere condotte all'interno di un armadio di biosicurezza dedicato. In questo studio, le procedure descritte sono state condotte all'interno di una Hypoxystation HEPA H35 convalidata (vedi Tabella dei Materiali) per garantire un ambiente controllato e monitorato. La decontaminazione di tutti i liquidi pericolosi deve essere effettuata utilizzando una soluzione di candeggina al 10%.
1. Isolamento PBMC e attivazione delle cellule T (Giorno 0)
<ol><li>Raccogliere le cellule dalla sacca per aferesi del donatore (leucopati, vedere Tabella dei materiali) in provette da 50 ml, a seconda del volume iniziale.</li>
	<li>Eseguire due lavaggi della sacca cellulare infondendo 15 mL di terreno ematopoietico completo (+5% HSA, terreno ematopoietico commerciale senza siero, vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire la centrifugazione in gradiente di densità a base di polisaccaridi a una diluizione 1:2 (reagente:campione). Centrifugare a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente con pause (A/D, 9/0).</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, raccogliere le PBMC in una provetta pulita da 50 ml.</li>
	<li>Lavare le celle due volte con 1x PBS, riempiendo fino a 50 ml per ogni lavaggio (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). Risospendere le cellule in 5 mL di terreno completo.</li>
	<li>Contare le cellule utilizzando il blu di tripano utilizzando un emocitometro standard o un contatore di cellule automatizzato (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Diluire le cellule con terreno completo per ottenere una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL.</li>
	<li>Attivare 20 x 106 PBMC aggiungendo 10 μL di reagente di stimolazione delle cellule T (vedere la tabella dei materiali) per 2 x 106 cellule di partenza. NOTA: Questo protocollo è progettato per l'attivazione di 20 x 106 PBMC, ma può essere regolato per numeri di celle maggiori in base alle esigenze.</li>
	<li>Aggiungere rhIL-2 (20 U/mL) (vedere la tabella dei materiali), mescolare delicatamente e trasferire la miscela in un recipiente appropriato (ad es. piastra a 6 pozzetti).</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 72 ore.</li>
</ol>2. Trasduzione lentivirale delle cellule T (Giorno 3)
<ol><li>Trasferire la coltura cellulare in un recipiente adatto, ad esempio una provetta conica da 50 ml. Mescolare bene e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere il reagente di attivazione. Scartare con cura completamente il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo. NOTA: In questa fase, è possibile scongelare il virus sul ghiaccio.</li>
	<li>Conta le cellule usando il blu di tripano.</li>
	<li>Risospendere le cellule in un terreno completo per ottenere una concentrazione che consenta di placcare 0,5 x 106 cellule in un volume totale di 400 μL per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere rhIL-7 (155 U/mL) e rhIL-15 (290 U/mL) (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Assicurarsi di tenere conto del volume di virus da aggiungere. Fare riferimento al punto 2.4.</li>
	<li>In una provetta separata, aggiungere Vectofusin-1 (vedere Tabella dei materiali) al terreno Opti-MEM ad una concentrazione di 10 μg/mL, con un volume pari al volume virale da utilizzare. NOTA: Considerare il volume totale della coltura cellulare quando si calcola la concentrazione di Vectofusin-1. Vedere il passaggio 2.3. In alternativa, Vectofusin-1 GMP può essere utilizzato come reagente di grado GMP.</li>
	<li>Combinare il virus concentrato a una molteplicità di infezione (MOI) di 40 con la miscela Vectofusin-1/Opti-MEM (rapporto 1:1) e mescolare accuratamente. Aggiungere questa miscela alla coltura cellulare e regolare il volume totale a 400 μL per pozzetto utilizzando un terreno completo, se necessario.</li>
	<li>Mettere il coperchio sul piatto, sigillarlo con pellicola di paraffina e centrifugare a 1000 x g per 2 h a 32 °C. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C, 5% CO2 per una notte.</li>
</ol>3. Rimozione del virus ed espansione delle cellule T (Giorno 4)
<ol><li>Raccogliere le cellule e raggrupparle in un recipiente adatto, come una provetta da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Rimuovere con cautela completamente il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo.</li>
	<li>Conta le cellule usando il blu di tripano. Risospendere le cellule in terreno completo ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL. Aggiungere rhIL-7 (155 U/mL) e rhIL-15 (290 U/mL) (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Trasferire le cellule in un recipiente appropriato, ad esempio un matraccio T25, ad una concentrazione di 0,3-0,5 x 106 cellule/cm2 e incubarle a 37 °C, 5% CO2 , per 2 giorni. NOTA: Se è necessaria una popolazione cellulare più ampia, le cellule possono essere sottocoltivate (1:2) in presenza di rhIL7 e rhIL-15 ogni 2 giorni, seguendo le stesse condizioni di incubazione sopra menzionate, fino al raggiungimento del numero di cellule desiderato.</li>
</ol>4. Crioconservazione (giorno 14)
NOTA: Durante questa fase, sarà necessario del ghiaccio per trasferire i crioviali nel luogo di conservazione. La tempistica della crioconservazione dipende dal numero di cellule desiderate. Per questo protocollo, la crioconservazione viene eseguita il giorno 14 dopo aver raggiunto un'espansione di 25 volte.
<ol><li>Una volta raggiunto il numero di cellule desiderato, prelevare le cellule e trasferirle in provette da 50 mL (regolare il numero di provette in base al volume totale).</li>
	<li>Centrifugare le provette a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Rimuovere con cautela completamente il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di terreno. Se necessario, raggruppare le cellule da più provette.</li>
	<li>Conta le cellule usando il blu di tripano. Mantenere un'aliquota di 1 x 106 celle per ogni test di controllo qualità (QC) (fare riferimento alla Sezione 5) per valutare il numero di copie vettoriali e l'efficienza di trasduzione.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 400 x g per 10 minuti a RT. A questo punto, etichettare i crioviali di conseguenza.</li>
	<li>Rimuovere completamente il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di crioconservazione composta dal 50% di HSA e dal 40% di HBSS a una concentrazione di 1 x 107 cellule per mL per crioviale. Trasferire la sospensione cellulare nel numero appropriato di crioviali e aggiungere il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) a ciascun crioviale.</li>
	<li>Mettere i crioviali sul ghiaccio e trasferirli prontamente in un congelatore a velocità controllata per la crioconservazione. Dopo la crioconservazione, trasferire i crioviali in un serbatoio di azoto liquido monitorato per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>5. Controllo qualità (giorno 14)
NOTA: Per i test di rilascio, il prodotto è stato sottoposto a diversi test, inclusi test di sterilità per la crescita microbica e valutazione del livello di endotossine. Questi test sono stati condotti in laboratori certificati presso l'Ospedale Generale Universitario di Patrasso e l'Università di Patrasso. La presenza di micoplasmi è stata determinata internamente utilizzando un test di rilevamento biochimico e misurata su un luminometro seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). Il fenotipo cellulare (Figura 1), il numero di cellule e la vitalità sono stati valutati internamente mediante citometria a flusso (vedere paragrafo 5.1) e un contatore automatico di cellule (vedere la tabella dei materiali), rispettivamente. I criteri di rilascio sono stati stabiliti sulla base dei dati pubblicati e delle raccomandazioni10,11 per i prodotti cellulari prodotti secondo GMP (Tabella 1).
<ol><li>Eseguire la colorazione citometrica a flusso di efficienza di trasduzione (Giorno 14) NOTA: Un'aliquota di 1 x 106 cellule sarà colorata per la vitalità (7-AAD) e il marcatore CD32 per valutare l'efficienza di trasduzione (vedi Tabella dei materiali). Se il gene di interesse, come nel caso delle cellule CAR-T, deve essere rilevato, l'anticorpo specifico deve essere di un colore diverso da quello del marcatore CD3 e 7-AAD per evitare la compensazione. Devono essere presi in considerazione campioni di controllo appropriati.<ol><li>Mettere il campione in una provetta FACS e aggiungere 500 μL di tampone FACS.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min.</li>
		<li>Scartare completamente il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in una soluzione diluita 1:5 di tampone CD3:FACS (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Agitare il campione e incubare per 30 minuti su ghiaccio al buio.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di tampone FACS. Centrifugare a 400 x g per 5 min (RT).</li>
		<li>Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione diluita 1:20 di tampone 7-AAD:FACS (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Vorticare il campione e incubare per 10 minuti su ghiaccio al buio.</li>
		<li>Aggiungere 200 μL di tampone FACS e analizzare il campione utilizzando un citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+quality%2C+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Medicines+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).</li>
<li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+CAR+T-Cell+production+%28ARI-0001%29+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor%3A+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).</li>
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<li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+International%22%5BJournal%5D)">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li>
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<li>Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+choice%3A+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).</li>
<li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34%2B+cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li>
<li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li>
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</ol>

N.S. ha sviluppato il protocollo e scritto il manoscritto che è stato revisionato e supervisionato da A.S.; K.S., G.A. eseguì ulteriori esperimenti; D.K., M.L. ha fornito un valido supporto negli esperimenti e insieme a V.Z., N.T. nel processo di revisione. N.T. è membro di ProtATonce Ltd. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

I vettori lentivirali come veicoli di veicolazione genica sono strumenti importanti nel campo della terapia cellulare e genica a causa della loro capacità di trasdurre sia cellule in divisione che in divisione12. Tuttavia, la produzione su larga scala di vettori lentivirali utilizzando metodi compatibili con le GMP è ancora impegnativa a causa di vari parametri, come i metodi di trasfezione e le fasi di purificazione, che possono comportare variabilità nei lotti di lentivirus. I centri accademici ...

L'emergere delle terapie cellulari adottive (ACT) e delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha portato a un cambiamento rivoluzionario nella pratica clinica moderna, stabilendo un nuovo paradigma di medicina personalizzata. In particolare, le cellule CAR-T che hanno come bersaglio CD19 hanno dimostrato risposte cliniche eccezionali e rappresentano la terapia con cellule T più avanzata per le neoplasie maligne delle cellule B 1,2,3,4,5. Tuttavia, le attuali terapie a base di cellule T geneticamente modificate commercializzate si basano fortemente su vettori virali per il trasferimento genico. L'implementazione di vettori virali in ACT, in particolare in condizioni di buone pratiche di fabbricazione (GMP) all'interno di un ambiente accademico, presenta sfide significative a causa dei limiti di scalabilità, dei requisiti di apparecchiature specializzate, della necessità di personale altamente qualificato e dell'uso di reagenti conformi alle GMP per la produzione di particelle virali mediate da plasmidi 6,7,8.
Di conseguenza, il processo di produzione per le terapie con cellule T geneticamente modificate è complesso e in genere inizia con l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da un prodotto per la leucoaferesi. Le cellule T sono spesso arricchite dal pool PBMC e attivate utilizzando microcomplessi anti-CD3/CD28 7,9. Successivamente, le cellule T vengono geneticamente modificate con vettori virali o non virali, che possono essere prodotti in situ o in outsourcing. Per ottenere il numero di cellule richiesto per l'infusione, le cellule geneticamente modificate vengono espanse prima della formulazione finale e/o della crioconservazione. Infine, il prodotto cellulare deve soddisfare vari criteri di rilascio basati su più saggi di controllo della qualità9.
Questo protocollo presenta una metodologia completa che utilizza tecniche semplici per la manipolazione ex vivo di PBMC sane per produrre un prodotto a base di cellule T geneticamente modificate in condizioni conformi alle GMP. Il protocollo prevede l'uso di un vettore lentivirale, che può essere esternalizzato a un'azienda di produzione virale che fornisce tutti i necessari test quantitativi/funzionali, di purezza e di sicurezza (ad esempio, titolo virale, rilevamento di lentivirus competenti per la replicazione del DNA della cellula ospite). Per questo studio, il vettore utilizzato è un vettore lentivirale di seconda generazione basato su VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) con Green Fluorescent Protein (GFP), come gene di interesse, in espressione costitutiva.

<table><tbody><tr><td>Piastra trattata TC a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>provetta FACS da 5 mL</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 50 mL</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Piastra trattata con TC a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter&nbsp;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Tampone FACS (1x D-PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Ipossistazione</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Luminometro portatile</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Provirus Quantificazione</td> Kit <td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano&nbsp; CD3 (Clone: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus Kit di rilevamento</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Nastro di chiusura ultra-espandibile Parafilm 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (sacca per aferesi)</td><td>Dispositivo Biomed</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Pialla Kryo10 Serie III</td><td>T75</td><td></td><td></td></tr><tr><td> fiasche</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, soluzione allo 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 Terreno cellulare ematopoietico senza siero</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

una procedura conforme alle gmp per la generazione di cellule t geneticamente modificate

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

Il campo della terapia cellulare adottiva (ACT) è stato rivoluzionato dallo sviluppo di cellule geneticamente modificate, in particolare cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR). Queste cellule modificate hanno mostrato notevoli risposte cliniche in pazienti con neoplasie ematologiche. Tuttavia, l'elevato costo di produzione di queste terapie e la conduzione di approfondite valutazioni di controllo della qualità ne hanno limitato l'accessibilità a una gamma più ampia di pazienti. Per affrontare questo problema, molte istituzioni accademiche stanno esplorando la fattibilità della produzione interna di cellule geneticamente modificate, aderendo alle linee guida stabilite dalle agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali.
La produzione di prodotti a base di cellule T geneticamente modificate su larga scala presenta diverse sfide, in particolare in termini di capacità produttive dell'istituzione e della necessità di soddisfare i requisiti di quantità di infusione. Una delle principali sfide riguarda la produzione di vettori virali su larga scala secondo le linee guida delle buone pratiche di fabbricazione (GMP), che spesso vengono esternalizzate a società esterne. Inoltre, la semplificazione del processo di trasduzione delle cellule T può aiutare a ridurre al minimo la variabilità tra i lotti di produzione, ridurre i costi e facilitare la formazione del personale. In questo studio, delineiamo un processo semplificato per la trasduzione lentivirale di cellule T umane primarie con un marcatore fluorescente come gene di interesse. L'intero processo aderisce agli standard conformi alle GMP ed è implementato all'interno della nostra istituzione accademica.

Valutazione dell'efficienza di trasduzione Le cellule trasdotte sono state valutate per l'espressione del gene di interesse (GFP) utilizzando la citometria a flusso. I risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 1. Il giorno 14, oltre il 95% delle cellule era CD3+, indicando un'attivazione e un'espansione delle cellule T di successo. L'efficienza di trasduzione all'interno della popolazione CD3+ è stata misurata al 58,7% (TD, <s...

Questo protocollo delinea il processo di trasduzione delle cellule T umane primarie con un gene di interesse, garantendo la compatibilità con gli standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Una procedura conforme alle GMP per la generazione di cellule T geneticamente modificate

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

Questo protocollo descrive un processo semplificato e conforme al PNL di trasduzione di cellule T primarie umane con il gene di interesse. Questa particolare tecnica è stata progettata per essere conveniente e conforme al PNL senza l'uso di costose piattaforme di produzione a sistema chiuso attualmente disponibili in molti centri accademici. Questo metodo potrebbe potenzialmente essere applicato alla generazione di terapie cellulari geneticamente modificate, tra cui, ma non solo, le cellule CAR-T, che hanno rappresentato un cambiamento di paradigma per affrontare le neoplasie ematologiche.Per isolare la PBMC dalle cellule raccolte dopo la leucoaferesi del sangue del donatore, eseguire una centrifugazione a gradiente di densità a base di polisaccaridi del campione, mantenendo un rapporto reagente/campione di 1:2, centrifugando la miscela a 800 G per 30 minuti a temperatura ambiente con i freni disattivati. Quindi, utilizzando una micropipetta, raccogliere le PBMC in una provetta pulita da 50 millilitri. Lavare le celle due volte con PBS mediante centrifugazione.Prima di risospendere le cellule lavate in terreno ematopoietico completo. Attivare circa 20 milioni di cellule ottenute ag

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Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Il video delinea un processo per la creazione di cellule CAR T geneticamente modificate attraverso il sistema CRISPR-Cas9. L'infezione delle cellule T con lentivirus CRISPR e CAR provoca modifiche al gene bersaglio e la sintesi di un recettore chimerico dell'antigene o CAR, portando infine alla formazione di cellule T CAR geneticamente modificate.

Cellule CAR T geneticamente modificate utilizzando un sistema CRISPR-Cas9

Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

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Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

Gli effetti linfodepletivi e immunomodulatori della chemioterapia e dello standard di cura delle radiazioni possono essere sfruttati per migliorare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia con cellule T. Descriviamo un metodo per generare cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) specifiche per EGFRvIII e somministrarle nel contesto dello standard di cura del glioblastoma.

Generazione di cellule CAR T per adottiva terapia nel contesto di Glioblastoma standard di cura

Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Questo articolo descrive in dettaglio il processo di produzione delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico per uso clinico, in particolare utilizzando un processore cellulare automatizzato in grado di eseguire la trasduzione virale e la coltivazione delle cellule T. Forniamo raccomandazioni e descriviamo le insidie che dovrebbero essere considerate durante lo sviluppo del processo e l'implementazione di uno studio clinico in fase iniziale.

Produzione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

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Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Questo protocollo descrive un metodo scalabile per l'espansione dei prodotti Adoptive Cell Therapies (ACT), ovvero le cellule Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T e le cellule Cytokine-Induced Killer (CIK), utilizzando dispositivi di espansione rapida permeabile ai gas (G-Rex), dimostrando una crescita efficiente e robusta in un contesto clinicamente rilevante.

Generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da CAR-T e citochine in dispositivi scalabili GMP

Scopri una procedura conforme alle GMP per la trasduzione di cellule T primarie umane con un gene di interesse. Questo metodo economico facilita la generazione di terapie cellulari modificate geneticamente, inclusi i CAR T-cell, per il trattamento delle neoplasie ematologiche.

Una procedura conforme alle GMP per la generazione di cellule T geneticamente modificate

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