Name: Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Scopri un metodo xenogenico-free per isolare e coltivare cellule staminali umane derivate da adiposio, garantendo biosicurezza per la terapia cellulare. Questa tecnica semplice e riproducibile supporta applicazioni cliniche come la riparazione del nervo periferico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Le hASC sono state isolate dal tessuto adiposo addominale di una donna sana sottoposta a ricostruzione mammaria utilizzando lembi autologhi addominali (lembi perforatori epigastrici inferiori profondi, [DIEP]) presso l'Ospedale universitario di Losanna, CHUV, Losanna, Svizzera. La parte scartata del lembo e del tessuto adiposo è stata ottenuta dopo che il paziente ha firmato il consenso informato. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Dipartimento della Biobanca dell'ospedale DAL (numero 314 GGC) e dai comitati etici in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto una cappa a flusso laminare e con condizioni asettiche. Guanti e camici da laboratorio per la protezione personale devono essere sempre indossati e tutte le superfici devono essere lavate con biocidi appropriati. Il tessuto in eccesso deve essere smaltito correttamente come rifiuto biomedico.
1. Materiali necessari e preparazione delle soluzioni colturali
<ol><li>Per l'isolamento, l'espansione e la crioconservazione delle cellule, ottenere i seguenti strumenti: forbici sterili; bisturi sterili; pinzette sterili; una capsula di Petri da 10 cm; Tubi da 15 ml; palloni T25; una camera Burker; criovali; un contenitore di congelamento cellulare; un microscopio ottico con obiettivi di ingrandimento 4x e 10x; e una centrifuga a secchio oscillante.</li>
	<li>Per l'immunofenotipizzazione, ottenere i seguenti strumenti e reagenti: tubi FACS, soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS); Il mezzo essenziale minimo (DMEM) di Dulbecco; hPL; solfuro di dimetile; e tripsina senza animali.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura completo integrando DMEM con hPL privo di eparina al 5%. Conservare il fluido a 4 °C per un massimo di 3 settimane e utilizzare sempre in caldo (tra temperatura ambiente e 37 °C). Seguendo le linee guida GMP per la produzione di farmaci cellulari destinati alla terapia umana, non aggiungere antibiotici al terreno di coltura.</li>
	<li>Preparare il mezzo di congelamento contenente il 20% di hPL e il 10% di dimetil solfuro in DMEM.</li>
</ol>2. Isolamento delle hASC dal campione di tessuto adiposo
<ol><li>Elaborare il campione di tessuto adiposo entro 6 ore dal suo ottenimento. Prima di procedere al metodo di isolamento meccanico privo di xenogenici stabilito, lavare il tessuto 2x con PBS per 10 minuti fino al rilascio di tessuto connettivo e sangue.</li>
	<li>Conservare il campione di tessuto adiposo ottenuto dalla chirurgia addominoplastica in PBS a 4°C fino alla lavorazione e, comunque, non più di 24 h, al fine di non danneggiare la vitalità dell'hASC.</li>
	<li>Tagliare il tessuto adiposo in pezzi più piccoli di circa 1 cm2 con forbici sterili.</li>
	<li>Con un bisturi, micro-sezionare ogni pezzo in piccoli frammenti con diametri <5 mm, e disperderne cinque in una capsula di Petri di 10 cm (Figura 2A).</li>
	<li>Per attaccare ogni frammento, utilizzare il bisturi per creare incisioni sulla superficie di plastica, trascinando ogni frammento fino a quando non è saldamente attaccato alla capsula di Petri. Utilizzare una pinzetta per gestire il frammento (Figura 2B).</li>
	<li>Aggiungere delicatamente 10 ml di terreno di coltura completo per coprire tutti i frammenti senza staccarli.</li>
	<li>Incubare le piastre di Petri a 37 °C e 5% di CO2. Le hASC migreranno fuori dal tessuto e saranno selezionate a causa della loro aderenza plastica senza digestione enzimatica.</li>
	<li>Fino alla confluenza cellulare, monitorare l'espansione hASC al microscopio ottico con un ingrandimento 4x una volta al giorno. Quando le hASC iniziano a uscire dal tessuto, appaiono come piccoli gruppi attorno ai pezzi di tessuto con una tipica morfologia simile ai fibroblasti. Gli hASC sono selezionati in base alla loro capacità di aderire alla superficie plastica. Ogni 72 ore, rimuovere quanto più mezzo possibile e sostituirlo con un mezzo completo fresco per rimuovere i detriti cellulari.</li>
	<li>Lasciare i frammenti di tessuto sul posto fino al primo passaggio delle cellule, che di solito è dopo 7 giorni.</li>
</ol>3. Coltura hASC dopo la fase di isolamento
<ol><li>Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, le hASC sono pronte per essere staccate e ulteriormente espanse per essere utilizzate per altri esperimenti o per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Con una pinzetta sterile, rimuovere e scartare tutti i pezzi di tessuto dalla capsula di Petri. Rimuovere e scartare il mezzo esausto, facendo attenzione a non toccare le hASC per non staccarle.</li>
	<li>Lavare accuratamente le cellule una volta con 10 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di 1x tripsina senza animali e lasciare la capsula di Petri nell'incubatrice a 37 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Controllare al microscopio ottico con ingrandimento 4x se tutte le cellule si sono staccate; altrimenti, lasciare la capsula di Petri per altri 2 minuti nell'incubatrice e infine picchiettare delicatamente la superficie di plastica per supportare il distacco della cella.</li>
	<li>Interrompere l'azione della tripsina aggiungendo 2 ml di terreno completo e raccogliere tutte le cellule in una provetta da 15 ml.</li>
	<li>Per rimuovere la tripsina residua, centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, sospendere le cellule con 5 ml di terreno completo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25. Mantieni le hASC in cultura ed espandile fino a quando necessario.</li>
</ol>4. Studio immunofenotipico mediante citometria a flusso
<ol><li>Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, staccare gli hASC come descritto in precedenza nella sezione 3.</li>
	<li>Dopo aver raccolto le cellule, sospenderle in 1 mL di mezzo completo e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.</li>
	<li>Centrifugare gli hASC a 300 x g per 5 minuti e sospenderli a 1 x 106 celle/ml di tampone FACS. Trasferire 100 μL della sospensione contenente 1 x 105 celle in un tubo FACS. Utilizzare un tubo FACS per ogni antigene studiato, più un altro per ogni controllo isotipico.</li>
	<li>Colorare le cellule con 100 μL dei seguenti anticorpi diluiti in tampone FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcato con FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcato PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, marcato con FITC); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcato con FITC); e controlli isotipici per ciascun fluoroforo, marcato con IgG1 con FITC (1:1.000) e con PE IgG1 (1:50).</li>
	<li>Incubare i campioni per 1 ora al buio agitando a 4 °C. Centrifugare le provette a 300 x g per 5 minuti, eliminare il surnatante e sospendere le cellule in 500 μL di tampone FACS.</li>
	<li>Valutare l'immunofenotipo cellulare con uno strumento di citometria a flusso, registrando 50.000 eventi per ogni tubo all'interno del cancello selezionato per escludere i detriti cellulari. Calcola la percentuale di cellule che esprimono come differenza dal controllo isotipico specifico.</li>
</ol>5. Saggio di proliferazione di hASC
<ol><li>Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, staccare le hASC come descritto nella sezione 3.</li>
	<li>Dopo aver raccolto le cellule, sospenderle in 1 mL di mezzo completo e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.</li>
	<li>Semina 5 x 102 hASC in 200 μL di terreno completo in lastre trasparenti a 96 pozzetti. Semina le celle in repliche tecniche, con un pozzetto per ogni punto temporale.</li>
	<li>A 3 giorni dalla semina, iniziare a rilevare la proliferazione cellulare utilizzando un kit di test di proliferazione seguendo le istruzioni del produttore. In breve, sostituire il terreno di coltura con 100 μL di terreno fresco aggiunto a 20 μL di reagente di analisi per pozzetto. Incubare le hASC per 2,5 ore a 37 °C, 5% CO2 per lo sviluppo del reagente, quindi rilevare l'assorbanza a 490 nm con uno spettrofotometro.</li>
	<li>Esprimere la proliferazione hASC come assorbanza percentuale dopo aver rimosso l'assorbanza in bianco.</li>
</ol>6. Crioconservazione e conservazione delle hASC
<ol><li>Staccare le cellule come descritto nella sezione 3 e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sospendere le cellule con miscela di congelamento ad una densità di 1 x 106 hASCs/mL e trasferire 1 mL della soluzione cellulare in un crioviale.</li>
	<li>Mettere i crioviali a -80 °C in un contenitore di congelamento che riduce la temperatura di 1 °C/min, quindi spostare i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>

<ol><li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSC%29+in+plastic+and+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li>
<li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+human+platelet+lysate+%28hPL%29+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426(2021).</li>
<li>Condé-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction%3A+Review+of+upcoming+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017(2016).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+Implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li>
<li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li>
<li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileria%22%5BJournal%5D)">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li>
<li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adipose-derived+stem+cells%3A+A+comparison+among+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li>
<li>Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).</li>
<li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+%28SafeCell%29%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559(2012).</li>
<li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+extraction%2C+culture%2C+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li>
<li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li>
<li>Kyllönen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17(2013).</li>
<li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate%3A+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351(2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176(2021).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease%3A+Experiments+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs%3A+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212(2017).</li>
<li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells%3A+Update+on+clinical+utility+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Eukaryotic+Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li>
<li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li>
<li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol%3A+A+cell+factory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124(2018).</li>
<li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li>
<li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures%3A+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142(2022).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432(2020).</li>
<li>Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le cellule staminali derivate dall'adiposio hanno attirato l'interesse della ricerca traslazionale nell'ultimo decennio grazie alla loro abbondanza, ai metodi di isolamento rapidi e convenienti, all'alto tasso di proliferazione in vitro / in vivo e alle proprietà di staminalità / differenziazione18,19,20. Di conseguenza, le hASC sono considerate un ottimo candidato per le strategie basate sulle cellule nella me...

Negli ultimi decenni, la crescente domanda di trattamenti terapeutici innovativi ha dato luogo a notevoli sforzi e investimenti di risorse nel campo della medicina traslazionale1. I prodotti a base cellulare sono associati a rischi determinati dalla fonte cellulare, dal processo di produzione (isolamento, espansione o modificazione genetica) e dagli integratori non cellulari (enzimi, fattori di crescita, integratori di coltura e antibiotici) e questi fattori di rischio dipendono dalla specifica indicazione terapeutica. La qualità, la sicurezza e l'efficacia del prodotto finale potrebbero essere profondamente influenzate dagli elementi sopra indicati2. La terapia con cellule staminali richiede il rispetto dei principi di biosicurezza; I potenziali rischi di trasmissione patogena con prodotti di origine animale in coltura cellulare potrebbero essere problematici e la sperimentazione approfondita di qualsiasi prodotto introdotto nella fabbricazione è essenziale3.
Il metodo tradizionale per isolare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) prevede una digestione enzimatica eseguita con collagenasi seguita da fasi di lavaggio attraverso la centrifugazione4. Mentre l'isolamento enzimatico è generalmente considerato più efficiente di altre tecniche meccaniche in termini di rese cellulari e vitalità, i componenti di origine animale utilizzati, come la collagenasi, sono considerati più che minimamente manipolati dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Ciò significa che vi è un rischio significativamente aumentato di reazioni immunitarie o di trasmissione di malattie, limitando così la traduzione della terapia con hASC in contesti clinici 5,6.
La digestione a base di tripsina è un altro protocollo enzimatico per isolare le ASC. Sono state descritte diverse tecniche con lievi modifiche in termini di concentrazione di tripsina, velocità di centrifugazione e tempo di incubazione. Sfortunatamente, questo metodo non è ben descritto e manca il confronto in letteratura, in particolare con i protocolli di isolamento meccanico7. Tuttavia, in termini di traducibilità dell'approccio, la tripsina presenta gli stessi inconvenienti della collagenasi.
Metodi di isolamento alternativi per ottenere ASC, basati su forze meccaniche e senza aggiunta enzimatica, comportano la centrifugazione ad alta velocità (800 x g o 1.280 x g, 15 min) dei frammenti di tessuto adiposo. Quindi, il pellet viene incubato con un tampone di lisi dei globuli rossi (5 min), seguito da un'altra fase di centrifugazione a 600 x g prima della risospensione in terreno di coltura. Nonostante un numero maggiore di cellule isolate nei primi giorni rispetto ai metodi di espianto, uno studio precedente ha mostrato una proliferazione inferiore o assente oltre la seconda settimana di coltura8.
Oltre a ciò, un'ulteriore manipolazione con mezzo aggiunto xenogenico, come il siero bovino fetale (FBS), che viene utilizzato come integratore del fattore di crescita per la coltura cellulare, è associata ad un aumentato rischio di reattività immunitaria ed esposizione a infezioni virali, batteriche o prioniche del paziente ospite 9,10. Reazioni immunitarie e sviluppo di rash orticariforme sono già stati descritti in soggetti trattati con diverse dosi di cellule staminali mesenchimali prodotte con FBS11. Inoltre, FBS è soggetta a variabilità da lotto a lotto, che può avere un impatto sulla qualità del prodotto finale12.
In conformità con le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (GMP), la dissociazione enzimatica dei tessuti deve essere evitata e l'FBS deve essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Questi passaggi, insieme a protocolli più affidabili e riproducibili, sono essenziali per supportare l'applicazione della terapia cellulare 3,13.
In questo contesto, il lisato piastrinico umano (hPL) è stato suggerito come sostituto di FBS poiché è un integratore privo di cellule, contenente proteine, arricchito con fattore di crescita, ed è stato precedentemente introdotto tra i prodotti cellulari di grado clinico come additivo del mezzo di crescita per la coltura cellulare in vitro el'espansione 14,15. Poiché l'hPL è un prodotto di derivazione umana, viene spesso utilizzato come sostituto dell'FBS durante la coltura in vitro di hASC destinate ad applicazioni cliniche, riducendo così i problemi relativi alle reazioni immunologiche e alle infezioni correlate alla traducibilità della FBS15,16.
Nonostante i maggiori costi di produzione, è già stato dimostrato che rispetto all'FBS, l'hPL supporta la vitalità cellulare per molti tipi cellulari, aumenta la proliferazione, ritarda la senescenza, assicura la stabilità genomica e conserva l'immunofenotipo cellulare anche nei passaggi cellulari tardivi; Tutti questi elementi supportano il passaggio a questo supplemento culturale11.
Lo scopo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo standardizzato per isolare e coltivare hASC con un metodo completo privo di animali, senza modificare la fisiologia cellulare e le proprietà di staminalità rispetto alle classiche hASC coltivate con FBS (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>euroclone</td><td>et5015b</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560839</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555821</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555482</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>BD561254</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di risciacquo autoMACS (tampone FACS)</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio BD Accuri C6 (strumento per citometria a flusso)</td><td>Camera BD accuri-Burker</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Blaubrand</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per il congelamento delle cellule</td><td>Corning</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Saggio di proliferazione cellulare</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell Contenitore per il congelamento</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS432002</tr><tr><td>Cryovials</td><td>clearline</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>solfuro di dimetile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>lama disposabile bisturi</td><td>paragon</td><td>bs 2982</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucosio</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Piastrine umane lisato FD (grado GMP)</td><td>Stemulate</td><td>PL-NH-500</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Infinite F50</td><td></td> <td>Tecan-Microscopio</td><td></td></tr> <tr><td>ottico con obiettivi di ingrandimento 4x e 10x</td> Piastra di Petri <td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterili</td><td>Reda</td><td>07104-00</td><td></td></tr><tr><td>Forbici sterili</td><td>Bochem</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta sterile</td><td>Bochem</td><td>1152</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a secchiello oscillante</td><td>Sigma</td><td>3-16K</td><td></td></tr><tr><td>T25 palloni</td><td>Greiner bio-one</td><td>6910170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLe (sostituto della tripsina senza animali)</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Considerando il crescente impatto della terapia con cellule staminali, sono state sollevate preoccupazioni in materia di biosicurezza per quanto riguarda la potenziale contaminazione o trasmissione di infezioni dovute all'introduzione di prodotti di origine animale durante la manipolazione in vitro . I componenti xenogenici, come la collagenasi o il siero fetale bovino, comunemente usati durante le fasi di isolamento cellulare e di espansione potrebbero essere associati ai potenziali rischi di reattività immunitaria o infezione virale, batterica e prionica nei pazienti riceventi. Seguendo le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione, la dissociazione chimica dei tessuti dovrebbe essere evitata, mentre il siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Inoltre, per garantire la sicurezza dei prodotti cellulari, è importante definire metodi più affidabili e riproducibili. Abbiamo sviluppato un metodo innovativo, completamente xenogenico-free per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano senza alterarne le proprietà rispetto ai protocolli standard di coltura FBS di collagenasi. Qui, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) sono state isolate dal tessuto adiposo addominale. Il campione è stato tritato meccanicamente con forbici / bisturi, micro-sezionato e disperso meccanicamente in una capsula di Petri di 10 cm e preparato con incisioni di bisturi per facilitare l'attaccamento dei frammenti di tessuto e la migrazione delle hASC. Dopo le fasi di lavaggio, le hASC sono state selezionate grazie alla loro aderenza plastica senza digestione enzimatica. Le hASC isolate sono state coltivate con terreno integrato con lisato piastrinico umano privo di eparina al 5% e staccate con un sostituto della tripsina privo di animali. Seguendo le indicazioni delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) sulla produzione di prodotti cellulari destinati alla terapia umana, non sono stati utilizzati antibiotici in alcun terreno di coltura.

Applicando il metodo di isolamento descritto sopra, le hASC sono state ottenute con successo da campioni di tessuto adiposo addominale senza l'uso di collagenasi. Inoltre, le hASC sono state espanse in condizioni completamente prive di xenogenici in presenza di hPL e senza altri componenti di origine animale. I seguenti risultati supportano il protocollo e sono ottenuti da hASC coltivate in parallelo con hPL e con FBS come condizione di controllo.
Dopo l'apparizione iniziale del cluster, le hA...

I prodotti xenogenici (chimici o di derivazione animale) introdotti nelle fasi di preparazione/manipolazione della terapia cellulare sono associati ad un aumentato rischio di reattività immunitaria e trasmissione patogena nei pazienti ospiti. Qui viene descritto un metodo completamente privo di xenogenici per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano.

Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Il nostro metodo privo di esogeni per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano è la risposta ai problemi di biosicurezza relativi alla terapia cellulare quando viene considerata per l'applicazione traslazionale. I nostri metodi di isolamento ed espansione sono semplici da replicare, rapidi e con requisiti tecnici ridotti, rendendoli utili a tutti. Studiamo la strategia terapeutica basata sulle cellule staminali adipose umane per la riparazione dei nervi periferici.Tuttavia, la nostra tecnica può essere ampiamente applicata quando sono necessarie nuove cellule staminali adipose in diverse configurazioni di ricerca clinica. Abbiamo mantenuto la semplicità per conservare una più facile producibilità. La sterilità deve essere attentamente osservata dalla sala operatoria fino alla coltura cellulare.Per la manipolazione dei campioni e dei frammenti, la microdissezione è a rischio di contaminazione. Dopo aver ottenuto il campione di tessuto adiposo dalla chirurgia plastica addominale, usando forbici sterili, tagliarlo in pezzi di circa un centimetro quadrato. Con un bisturi, micro sezionare ogni pezzo in frammenti più piccoli e disperdere cinque frammenti in una capsula di Petri di 10 centimetri.Per l'attacco del frammento, utilizzare un bisturi per creare incisioni sulla superficie di plastica e trascinare ogni frammento. Delicatamente, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura completo per coprire tutti i frammenti senza staccarli e incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Monitorare quotidianamente l'espansione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano, o HASC, al microscopio ottico fino a quando le cellule non diventano confluenti.Sostituire il mezzo con un nuovo mezzo completo ogni 72 ore per rimuovere i detriti cellulari e lasciarli crescere fino al primo passaggio. Una volta che la coltura HASC raggiunge il 70-80% di confluenza, rimuovere e scartare tutti i pezzi di tessuto usando pinzette sterili. Inoltre, scartare il mezzo esaurito evitando il distacco dell'HASC dalla capsula di Petri.Lavare accuratamente le cellule con 10 millilitri di PBS. Dopo aver rimosso PBS, aggiungere un millilitro di tripsina senza animali e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Verificare il distacco delle cellule al microscopio ottico e incubare per altri due minuti, se necessario.Per sostenere il distacco della cella, picchiettare delicatamente sulla superficie di plastica. Interrompere l'azione della tripsina aggiungendo due millilitri di mezzo completo e raccogliere tutte le cellule in un tubo da 15 millilitri. Rimuovere la tripsina rimanente mediante centrifugazione.Dopo aver scartato il surnatante, sospendere le celle in un mezzo completo da cinque millilitri e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25. Per la crioconservazione, contare un'aliquota di cellule staccate utilizzando il contatore di cellule sotto un microscopio ottico. Centrifugare le cellule a 300 G per cinque minuti.Dopo aver scartato il surnatante, sospendere le cellule nella miscela di congelamento ad una densità di una volta 10 alla sesta cellula per millilitro e trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una fiala di crio. Mettere le fiale criogeniche a meno 80 gradi Celsius in un contenitore di congelamento che riduce la temperatura di un grado Celsius al minuto e quindi spostare le fiale criogeniche in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Nell'aspetto iniziale del cluster, gli HASC mostravano una classica forma a fuso ed erano più piccoli, oltre che più allungati rispetto alle celle di controllo in presenza di FBS.L'immunofenotipo cellulare sembrava essere simile tra gli HASC coltivati con i due integratori. Più dell'80-90% degli HASC erano positivi per CD73 e CD105 e meno del 5% espressi per CD34 e CD45. Infine, il test di proliferazione ha rivelato un aumento significativo della crescita cellulare quando il lisato piastrinico umano è stato aggiunto al terreno rispetto al controllo FBS.Il passo più importante è la micro dissezione dei frammenti adiposi e il loro attacco con incisione a bisturi sulla piastra di Petri. Si ottiene una popolazione di cellule staminali derivate da adiposo umano pronta all'uso nel rispetto dei criteri di biosicurezza GMP, mantenendo le proprietà terapeutiche delle cellule e migliorando la proliferazione cellulare.

isolation-culture-human-adipose-derived-stem-cells-with-an-innovative

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nel 2001, i ricercatori della UCLA hanno descritto l'isolamento di una popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule o ASC staminali derivate da tessuto adiposo, dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive l'isolamento di ASC da lipoaspirato utilizzando un protocollo digestione enzimatica manuale mediante collagenasi.

Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

L'eterogeneità trascrizionale all'interno delle cellule stromali umane di derivazione adiposa può essere definita a livello di singola cellula utilizzando marcatori di superficie cellulare e geni osteogenici.  Descriviamo un protocollo che utilizza la citometria a flusso per l'isolamento di sottopopolazioni cellulari con aumentato potenziale osteogenico, che può essere utilizzato per migliorare la ricostruzione scheletrica craniofacciale.

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Questo protocollo fornisce un metodo privo di enzimi per isolare le cellule staminali mesenchymal da campioni di abdominoplastica e lipoaspirati utilizzando un metodo explant. L'assenza di enzimi duri o passaggi di centrifugazione prevede cellule staminali clinicamente rilevanti che possono essere utilizzate per studi in vitro o trasferite di nuovo alla clinica.

Un metodo privo di enzimi per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali mesenchimale derivate dall'Adipo

Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l'ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l'ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.

Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

Il presente protocollo descrive una metodologia migliorata per l'isolamento ADSC con conseguente enorme resa cellulare con guadagno di tempo rispetto alla letteratura. Questo studio fornisce anche un metodo semplice per ottenere un numero relativamente elevato di cellule vitali dopo la crioconservazione a lungo termine.

Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.

Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

Il tessuto adiposo è un'ottima fonte di cellule staminali mesenchimali. Qui, portiamo l'estrazione, la coltivazione e la caratterizzazione passo dopo passo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) da topi svizzeri tessuto adiposo epididimale.

Isolamento, espansione in vitro e caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo epididimo di topo

Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del &gt;90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.

Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino

Scopri un metodo xenogenico-free per isolare e coltivare cellule staminali umane derivate da adiposio, garantendo biosicurezza per la terapia cellulare. Questa tecnica semplice e riproducibile supporta applicazioni cliniche come la riparazione del nervo periferico.

Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana (Video) | JoVE Journal

Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Esplora altri video