Name: Ferritinofagia: Valutazione della degradazione selettiva del ferro mediante autofagia nei fibroblasti umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Impara a valutare la ferritinofagia nei fibroblasti umani per studiare l'omeostasi del ferro nella BPAN. Questo protocollo di immunofluorescenza ad alto rendimento consente l'analisi quantitativa della degradazione lisosomica della ferritina a livello cellulare.

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Linee cellulari</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti umani primari derivati dalla pelle&nbsp;</td><td>Biopsia cutanea, donatore umano sano, Biobanca Clinica Universitaria T&uuml; bingen, Approvazione etica 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, passaggio 9</td><td></td></tr><tr><td>Trattamenti di coltura cellulare</td><td></td><td></td><td>Concentrazione finale (composto)</forte></td></tr><tr><td>Terreno di controllo</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td> <td>(solo DMSO)</td></tr><tr><td>Terreno di controllo + bafilomicinaA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td>Terreno di controllo + deferasiox (DFX)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 &micro; M DFX</td></tr><tr><td>Mezzo di controllo + DFX + bafilomicinaA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 &micro; M DFX, 100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td>Terreno di controllo + citrato di ammonio ferrico (FAC)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC</td></tr><tr><td>Terreno di controllo + FAC + bafilomicinaA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina [BSA] Frazione V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 capra a-coniglio</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 capra a-topo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Colture cellulari trattate con piastre da 10 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza calcio né magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di ammonio ferrico (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITIN (Milza umana)</td><td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL penicillina, 100 mg/mL streptomicina)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%) con fenolo rosso</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 piastre con fondo in vetro a 96 pozzetti #0</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,7% paraformaldeide (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA disciolto in PBS, pH 7,5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bafilomicina A1 100 mM stock</td><td></td><td></td><td>Bafilomicina A1 diluita in DMSO</td></tr><tr><td>Citrato di ammonio ferrico (FAC) 100 mg/mL stock</td><td></td><td></td><td>FAC diluito in acqua distillata doppia autoclavata</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS, integrato con il 10% di Tween20&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, integrato con 10% Tween20, 1% BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Versione 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinofagia: valutazione della degradazione selettiva del ferro mediante autofagia nei fibroblasti umani

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

I fibroblasti primari derivati dalla pelle umana (F-CO-60) provenienti da donatori sani (Figura 1A) sono stati preparati per le valutazioni della ferritinofagia utilizzando il trattamento con baflomicina A1 seguita da immunocolorazione della ferritina endogena e LAMP2, analisi automatizzata delle immagini e analisi basata su CellProfiler (Figura 1B).
La colocalizzazione della ferritina endogena e della LAMP2 è aumentata dopo che la degradazione lisosomiale della ferritina è stata bloccata dall'aggiunta di bafilomicina A1, coerentemente con la sua capacità di inibire gli enzimi V-ATPasi lisosomiale e, quindi, di bloccare la ferritinofagia7 (Figura 2). Inoltre, il riconoscimento cellulare basato su software, così come il riconoscimento della ferritina e del LAMP2, sono mostrati come esempio (Figura 2).
A questo proposito, va notato che la pipeline di CellProfiler qui descritta è estremamente versatile e può essere adattata a letture aggiuntive e/o alternative, ad esempio per valutare gli effetti di alcune mutazioni BPAN sulla crescita cellulare, sui mitocondri o su altri organelli nel contesto di sistemi funzionali di marcatori a singola cellula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica sperimentale. Rappresentazione grafica di (A) il processo di ferritinofagia e (B) il flusso di lavoro sperimentale per valutare la ferritinofagia in fibroblasti umani primari di origine cutanea, come descritto in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> Figura 2: Immagini rappresentative. I fibroblasti umani primari di origine cutanea in terreno di controllo (condizioni alimentate) in (A) assenza o (B) presenza di bafilomicina A1 sono stati sottoposti a un'analisi di immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi anti-ferritina e anti-LAMP2, mentre i nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI. Vengono presentate immagini di fluorescenza esemplari acquisite con l'automazione della microscopia a scansione laser confocale (barre di scala: 10 μm). Cambiamenti nell'abbondanza e nella colocalizzazione di ferritina e LAMP2 possono essere osservati in seguito all'inibizione lisosomiale in seguito alla somministrazione di bafilomicina A1. Viene inoltre visualizzata l'analisi basata su CellProfiler, che mostra le sovrapposizioni di immagini derivate dal software di riconoscimento cellulare (viola), nuclei (blu), ferritina (verde), LAMP2 (rosso) e punti di co-localizzazione ferritina/LAMP2 (giallo). (C) Sezioni dell'immagine ingrandite (barra di scala = 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Le impostazioni della microscopia a scansione laser confocale utilizzate in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Le impostazioni numeriche di CellProfiler utilizzate in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File supplementare 1: La pipeline CellProfiler utilizzata in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: visualizzazione della pipeline CellProfiler (vedere File supplementare 1) con screenshot acquisiti in ordine consecutivo (vedere la tabella 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Ferritinofagia: Valutazione della degradazione selettiva del ferro mediante autofagia nei fibroblasti umani

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

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