Name: Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Scopri un'imaging chimico bioortogonale per visualizzare il metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici. Questa tecnica label-free combina microscopia Raman e fluorescenza a due fotoni per analisi subcellulari ad alta risoluzione.

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Ringraziamo il Dr. Yajuan Li e Anthony Fung per il loro supporto tecnico e il laboratorio Fraley per la linea cellulare. Riconosciamo i fondi iniziali di UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.

1. Preparazione dei supporti
<ol><li>Preparare 10 mL di AAA di controllo e AAA in eccesso nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 50% di D2O.<ol><li>Per i mezzi di controllo, misurare e miscelare 10 mg di polvere DMEM con 4,7 mL di acqua bidistillata (ddH2O) in un tubo conico da 15 ml. La polvere DMEM contiene tutti gli aminoacidi a concentrazioni standard. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere 4,7 ml di D2O, 0,5 ml di siero fetale bovino (5% FBS) e 0,1 ml di penicillina/streptomicina (1%). Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.</li>
		<li>Per il mezzo di trattamento 15x Phe, misurare e mescolare 10 mg di polvere DMEM con 4,7 ml di ddH2O, 0,5 mL di FBS (5%) e 0,1 mL di penicillina/streptomicina (1%) in un tubo conico da 15 ml. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere la polvere di Phe in eccesso ad una concentrazione di 924 mg / L al mezzo. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.</li>
		<li>Per il mezzo di trattamento 15x Tryp, misurare e mescolare 10 mg di DMEM in polvere con 4,7 mL di ddH2O, 0,5 mL di FBS (5%) e 0,1 mL di penicillina/streptomicina (1%) in un tubo conico da 15 ml. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere la polvere di Tryp in eccesso ad una concentrazione di 224 mg / L al mezzo. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.</li>
		<li>Aggiungere metionina e treonina a 30,0 mg/ml e 95,0 mg/ml, rispettivamente, a tutti i tubi conici dei passaggi precedenti. Vortice completo e capovolgere il tubo. Non è necessario aggiungere piruvato di sodio ai terreni di coltura.</li>
		<li>Filtrare i mezzi di controllo e trattamento con un filtro a siringa da 25 mm con filtri a membrana in polietersulfone da 0,22 μm.</li>
		<li>Sigillare tutti i tubi conici contenuti nei fluidi con parafilm e conservare a 4 °C per un massimo di 3 settimane. Prima di trattare le cellule con i media, riscaldare tutti i mezzi a 37°C. NOTA: I reagenti in polvere e liquidi devono essere misurati e combinati in base al volume totale dei mezzi di trattamento e di controllo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione del campione di cellule
<ol><li>Mantenere le cellule del cancro cervicale (HeLa) in un pallone di coltura (cioè T10, T25, ecc.) utilizzando DMEM standard integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2).</li>
	<li>Sub-coltura delle cellule HeLa con un rapporto di divisione di 1:10 fino a raggiungere l'80% o superiore di vitalità cellulare.</li>
	<li>Una volta che le cellule raggiungono l'80% o superiore di confluenza, procedere a seminare 2 x 10 5 cellule per pozzetto su una piastra a 24 pozzetti utilizzando DMEM integrato con0,5 % FBS e 1% penicillina / streptomicina.<ol><li>Prima della semina cellulare, preparare una piastra a 24 pozzetti con vetrine rotonde sterilizzate, poli-d-lisina, rivestite di laminina, di 12 mm di diametro. Immergere i vetrini di copertura in etanolo al 70% e asciugare delicatamente con salviette prive di lanugine. Posizionare i coprivetrini puliti negli appositi pozzetti della piastra.</li>
		<li>Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza nella fase 2.2, lavare le cellule una volta con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza ioni magnesio e calcio.</li>
		<li>Aggiungere tripsina allo 0,25% per dissociare le cellule aderenti dal matraccio e incubare a 37 °C e al 5% di CO2 per 3 minuti.</li>
		<li>Aggiungere DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, pipettare delicatamente su e giù, e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti.</li>
		<li>Risospendere le cellule in DMEM integrato con 0,5% FBS e 1% penicillina / streptomicina.</li>
		<li>Contare le cellule usando un emocitometro, un microscopio ottico e un tripano blu e seminare una densità di 2 x 105 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. In alternativa, è possibile utilizzare un contatore automatico delle celle per contare le celle.</li>
		<li>Riportare le cellule nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 e agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo 8 ore, sostituire i vecchi terreni di coltura con il 50%di D 2 O/eccesso di Phe o il 50% di D2O/eccesso di terreno Tryp. Riportare le cellule nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 36 ore.</li>
	<li>Dopo 36 ore, fissare le cellule su vetrini da microscopio.<ol><li>Prima del fissaggio, preparare vetrini da microscopio con distanziatori di imaging di 9 mm di diametro e posizionare 15 μL di 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio.</li>
		<li>Risciacquare le cellule con 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 ml di soluzione di paraformaldeide (PFA) priva di metanolo al 4% e lasciare la piastra sotto il cappuccio di biosicurezza per circa 15 minuti.</li>
		<li>Aspirare la soluzione di PFA e risciacquare con 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio due volte.</li>
		<li>Aggiungere 1,5 ml di 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Utilizzare pinzette sterili per afferrare delicatamente i coperchi da ciascun pozzetto. Capovolgere e posizionare il lato contenente la cella dei vetrini di copertura sui distanziatori di imaging per contattare il PBS preparato al punto 2.5.1. Assicurarsi che il lato non contenente celle sia esposto all'aria.</li>
		<li>Utilizzando uno smalto trasparente, sigillare lo strato esterno della vetrina con il distanziatore di imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservare i vetrini del microscopio a 4 °C quando non si esegue l'imaging.</li>
</ol>3. Misurazione spontanea della spettroscopia Raman (Figura 2)
<ol><li>Utilizzare un microscopio Raman confocale per ottenere spettri Raman spontanei (Figura 2A).</li>
	<li>Accendere il laser ruotando la chiave in posizione ON .</li>
	<li>Fare doppio clic sull'icona del software LabSpec6 per aprire il software di acquisizione.</li>
	<li>Caricare il campione biologico sul supporto del campione direttamente sotto la lente dell'obiettivo.</li>
	<li>Sul software, fare clic sull'icona Fotocamera per accendere la videocamera.</li>
	<li>Regolare il piano di messa a fuoco per identificare una regione di interesse con l'obiettivo 50x. Spostare il joystick per controllare la traslazione della pialla dello stadio XY e ruotare il joystick per modificare la profondità di messa a fuoco.</li>
	<li>Dopo aver scelto la posizione per la misurazione, passare all'obiettivo 100x con 40 mW di potenza di eccitazione. Fare clic sull'icona rossa Stop per spegnere la videocamera.</li>
	<li>Selezionare una griglia di 1800 linee/mm e impostare l'intervallo di acquisizione da 400 cm-1 a 3.150 cm-1.</li>
	<li>Impostare il tempo di acquisizione su 90 s, l'accumulo su 3 e il binning su 4 per il minimo rumore e lo spettro più accurato. NOTA: questi parametri di imaging possono essere ottimizzati per adattarsi all'esperimento.</li>
	<li>Fare clic sull'icona della freccia per attivare la visualizzazione in tempo reale.</li>
	<li>Regolate lo spostamento Raman (cm-1) su un valore scelto per ottimizzare il piano di messa a fuoco. NOTA: In questo esperimento, il laser Raman è stato focalizzato sulle goccioline lipidiche, che contenevano un'alta concentrazione di legami CH2 . Pertanto, è stato selezionato uno spostamento Raman di 2.850 cm-1 che corrispondeva alle modalità di allungamento del legame CH2 .</li>
	<li>Regolare il piano di messa a fuoco con il joystick per ottimizzare il miglior rapporto segnale-rumore.</li>
	<li>Dopo aver scelto il piano di messa a fuoco, fare clic sull'icona rossa Stop per visualizzare in tempo reale.</li>
	<li>Selezionare l'icona Cerchio per avviare l'acquisizione dello spettro.</li>
	<li>Una volta presa la regione cellulare, utilizzare lo stesso piano di messa a fuoco per misurare lo sfondo con PBS. Sottrarre lo spettro di fondo da ogni spettro bersaglio subcellulare utilizzando un'applicazione software separata, come Origin (Figura 1B).</li>
</ol>4. Esperimenti di imaging con 2PEF e SRS
NOTA: Descrizioni dettagliate dell'allineamento laser SRS sono disponibili in un rapporto precedente28. Questo protocollo si concentra sul funzionamento di un sistema di imaging SRS e 2PEF multimodale (Figura 2C, D).
<ol><li>Fare clic su Start per riscaldare il laser.</li>
	<li>Seguire l'ordine per impostare gli interruttori principali della centralina e del monitor su: 1) premere l'interruttore principale della scatola di controllo IX3-CBH su On, 2) premere l'interruttore principale del controller del pannello a sfioramento su On, 3) premere l'interruttore principale dell'adattatore CA dell'alimentatore per LD OBIS 6 Laser Remote collegato al combinatore laser principale FV31-SCOMB su One 4) premere l'interruttore principale dell'adattatore CA dell'alimentatore per LD OBIS 6 Laser Remote collegato al combinatore sub laser FV31-SCOMB su On.</li>
	<li>Premere gli interruttori principali del rilevatore di fotodiodi Si e dell'amplificatore di blocco On.</li>
	<li>Impostare il fascio di Stokes a 1.031 nm, la larghezza dell'impulso a 6 ps e la frequenza di ripetizione a 80 MHz.</li>
	<li>Accoppiato al microscopio, impostare il sistema picoEmerald fornito con il fascio della pompa sincronizzato con una lunghezza d'onda sintonizzabile da 720-990 nm, una larghezza di impulso di 5-6 ps e una frequenza di ripetizione di 80 MHz. La potenza di eccitazione media sia della pompa che di Stokes è di 450 mW. Ottimizzare il potere di eccitazione per ridurre al minimo il fotodanneggiamento per il campione.</li>
	<li>Utilizzare un condensatore dell'olio ad apertura numerica (NA) (cioè 1,4 NA) per raccogliere gli Stokes e i raggi della pompa in cui il campione è montato emettendo alcune gocce sul condensatore.</li>
	<li>Montare il campione sull'olio e posizionare una grande goccia d'acqua sopra il vetrino del microscopio dove è fissato il campione. Questo è per l'obiettivo ad immersione in acqua.</li>
	<li>Impostare l'amplificatore lock-in su 20 MHz. Elabora l'immagine ora utilizzando il modulo software super-risoluzione.</li>
	<li>Selezionare 512 pixel x 512 pixel e 80 μs/pixel per il tempo di permanenza.</li>
	<li>Una volta che la regione cellulare desiderata è messa a fuoco correttamente, acquisire l'immagine. Utilizzando il software di acquisizione del microscopio, salvare le immagini come file grafico Olympus .oir.</li>
	<li>Acquisisci un'immagine di sfondo a 1.900 cm-1 e sottrarla da tutte le immagini cellulari.</li>
	<li>Per eseguire l'imaging 2PEF, utilizzare lo stesso laser a picosecondi sintonizzabili e impostare l'autofluorescenza label-free di Flavina e NADH rispettivamente su 800 nm e 780 nm.</li>
	<li>Utilizzare un cubo filtrante da 460 nm/515 nm per raccogliere l'emissione retrodiffusa di autofluorescenza di Flavina e NADH.</li>
	<li>Regolare il tempo di permanenza su 8 μs/pixel e la dimensione dei pixel su 512 pixel x 512 pixel. Impostare il parametro di potenza dell'otturatore laser su 150 mW.</li>
	<li>Per la ricostruzione di immagini 3D, sintonizzare la perdita Raman stimolata a 2.850 cm-1 (797 nm).</li>
	<li>Una volta identificate le singole cellule desiderate, registrare il laser per eseguire la scansione dal piano di messa a fuoco superiore per rilevare gli strati superiore e inferiore di tali cellule. NOTA: i modelli 3D vengono generati e salvati come file .oir.</li>
</ol>5. Spettri e analisi delle immagini
<ol><li>Analisi spettrale<ol><li>Utilizza il software Origin o altre applicazioni pertinenti per sottrarre lo spettro di fondo da tutti gli spettri target subcellulari.</li>
		<li>Utilizza le operazioni di modellazione matematica di MATLAB per elaborare gli spettri Raman con le funzioni integrate nel software. Python può anche essere usato per l'elaborazione degli spettri.<ol><li>La pre-elaborazione spettrale inizia con la conversione dei file in una matrice. Gli spettri sono interpolati ad ogni centimetro reciproco.</li>
			<li>Per la convalida, rappresentare graficamente i dati non elaborati. Esegui la correzione della linea di base sugli spettri grezzi usando la funzione integrata msbackadj in MATLAB. In breve, la funzione incorporata stima i punti della linea di base ai valori dell'unità di separazione identificati dagli utenti e restituisce la distanza tra le finestre adiacenti. Dai punti della linea di base, stimare e tracciare una linea di regressione. Applicate Arrotondamento (Smoothing) per smussare la linea di regressione e sottrarre la linea di base da ogni singolo spettro grezzo.</li>
			<li>Eseguire la normalizzazione min-max dividendo l'intensità Raman della proteina a 2.930 cm-1 per l'intensità di ogni spostamento Raman. Il segnale di 2.930 cm-1 è tipicamente la più alta intensità sullo spettro Raman. Con questa normalizzazione, il valore massimo viene trasformato in un 1 mentre il valore minimo viene trasformato in uno 0. Ogni altro valore viene trasformato in un decimale compreso tra 0 e 1.</li>
			<li>Calcola la media dei singoli spettri della stessa condizione in un singolo spettro per ridurre il rumore.</li>
		</ol></li>
		<li>Una volta elaborato, utilizza applicazioni, come Origin, per visualizzare tutti gli spettri contemporaneamente. I picchi visualizzati negli spettri rappresentano uno specifico legame chimico o gruppo funzionale.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi 3D delle goccioline lipidiche<ol><li>Utilizzare il software FIJI-ImageJ per elaborare tutte le immagini 3D</li>
		<li>Eseguire le funzioni Bandpass Filters e Smoothing per gli stack di immagini 3D.</li>
		<li>Per l'analisi delle immagini 3D, assegnare ogni goccia lipidica a un punteggio sferico calcolato misurando la distanza tra il suo centro di massa e la superficie. Confronta ogni partitura sferica con una partitura sferica di una sfera perfetta sullo stesso piano euclideo. Scartare le goccioline lipidiche con bassi punteggi sferici e valutare le goccioline lipidiche rimanenti per il loro volume e conteggio.</li>
		<li>Analizzare il volume e la conta delle goccioline lipidiche tra diversi trattamenti per la significatività statistica su un'applicazione software statistica appropriata. Qui è stato utilizzato GraphPad Prism.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi di immagini iperspettrali 2D<ol><li>Utilizzare il software FIJI-ImageJ per elaborare tutte le immagini iperspettrali 2D.</li>
		<li>Selezionare il canale 2.930 cm-1 per creare un'immagine maschera contenente valori 0 e 1. Assegna lo sfondo a 0 e la regione cellulare a 1.</li>
		<li>Sottrarre il canale proteico marcato con deuterio (2.175 cm-1) al canale di fondo (1.900 cm-1) per rimuovere gli effetti fluorescenti.</li>
		<li>Dividere il canale proteico marcato con deuterio risultante per il canale proteico (2.930 cm-1) per ottenere immagini del rapporto del tasso di turnover proteico.</li>
		<li>Quindi, moltiplicare l'immagine della maschera creata nel passaggio 5.3.2 per le immagini raziometriche per rimuovere eventuali rumori di fondo rimanenti. Di conseguenza, viene generato uno sfondo scuro in ogni immagine raziometrica.</li>
		<li>Utilizzate lo strumento Selezione a mano libera in FIJI-ImageJ per segmentare e calcolare manualmente le intensità dei pixel visualizzate su singole celle. Le intensità dei pixel corrispondono alle concentrazioni del legame chimico visualizzato.</li>
		<li>Analizzare le intensità dei pixel per la significatività statistica su un'applicazione software statistica appropriata. Qui è stato utilizzato GraphPad Prism. Ripetete questa analisi con l'analisi raziometrica rimanente.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amino+acids+in+nutrition+and+health%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Functional amino acids in nutrition and health.</a> Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).</li>
<li>Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+amino+acids+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of amino acids in cancer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).</li>
<li>Parthasarathy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-ring+circus%3A+Metabolism+of+the+three+proteogenic+aromatic+amino+acids+and+their+role+in+the+health+of+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-tryptophan+activates+mammalian+target+of+rapamycin+and+enhances+expression+of+tight+junction+proteins+in+intestinal+porcine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells.</a> The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
<li>Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signalling+and+cellular+metabolism+are+mutual+determinants+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).</li>
<li>Kimura, T., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+protects+hepatocytes+against+reactive+oxygen+species-dependent+cell+death+via+multiple+pathways+including+Nrf2-dependent+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction.</a> Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+supplementation+with+aromatic+amino+acids+decreased+triglycerides+and+alleviated+hepatic+steatosis+by+stimulating+bile+acid+synthesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice.</a> Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+implications+of+natural+compounds+targeting+lipid+metabolism+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%2C+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).</li>
<li>Lubes, G., Goodarzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+based+metabolomics+used+for+the+identification+of+cancer+volatile+organic+compounds+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).</li>
<li>Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+metabolic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential of metabolic imaging.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).</li>
<li>Bowman, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lipid+coverage+and+high+spatial+resolution+MALDI-imaging+capabilities+of+oversampling+combined+with+laser+post-ionisation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).</li>
<li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+lipid+species+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).</li>
<li>Pirman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cancer+cell+metabolism+revealed+by+direct+sample+analysis+with+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), e61379(2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics+with+high+structural+specificity+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry.</a> Nature Communications. 12 (1), 2869(2021).</li>
<li>Miyagi, M., Kasumov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+synthesis+of+biomolecules+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions.+Series+A%2C+Mathematical%2C+Physical+and+Engineering+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry.</a> Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378(2016).</li>
<li>Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+recognition+of+sphingomyelin-rich+membrane+domains+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).</li>
<li>Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+and+tissue+imaging+using+Raman+and+coherent+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501(2020).</li>
<li>Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stimulated+Raman+scattering+imaging+for+tissues+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Imaging+in+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals.</a> Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).</li>
<li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+EdU%2C+an+alkyne-tagged+cell+proliferation+probe%2C+by+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+metabolic+dynamics+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of metabolic dynamics in animals.</a> Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).</li>
<li>Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cancer+cell+metabolic+dynamics+regulated+with+aromatic+amino+acids+using+DO-SRS+and+2PEF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702(2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+lipid+metabolic+changes+in+drosophila+ovary+during+aging+using+DO-SRS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy.</a> Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+metabolic+dynamics+in+aging+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila.</a> Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Fung, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+sub-cellular+methionine+and+insulin+interplay+in+triple+negative+breast+cancer+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism.</a> Frontiers in Oncology. 12, 858017(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+diet+regulated+metabolic+activities+in+Drosophila+during+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes.</a> Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).</li>
<li>Shi, L., Wei, M., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-multiplexed+tissue+imaging+with+raman+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).</li>
<li>Rysman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+lipogenesis+protects+cancer+cells+from+free+radicals+and+chemotherapeutics+by+promoting+membrane+lipid+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation.</a> Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).</li>
<li>Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lipid+class+homeostasis+is+altered+under+nutrient-deprivation+but+stable+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia.</a> BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).</li>
<li>Thiam, A. R., Dugail, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-membrane+contact+sites+-+from+protein+binding+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function.</a> Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).</li>
<li>Schott, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+size+directs+lipolysis+and+lipophagy+catabolism+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).</li>
<li>Hoang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+resolution+DO-SRS+and+2PEF+imaging+of+metabolic+dynamics+regulated+by+L-methionine+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Biopsy+XXI%3A+Toward+Real-Time+Spectroscopic+Imaging+and+Diagnosis.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+A-PoD%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+metabolic+imaging+uncovers+sex-+and+diet-dependent+lipid+changes+in+aging+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-molecular+hyperspectral+PRM-SRS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

L'imaging DO-SRS e 2PEF è stato applicato per studiare la dinamica metabolica in vari modelli ex vivo, tra cui Drosophila e tessuti umani 21,22,23,24,26,27,33. La modalità di imaging utilizzata in questo studio integra la microscopia DO-SRS e 2PEF, che può superare altri metodi di i...

Essendo aminoacidi aromatici essenziali (AAA), la fenilalanina (Phe) e il triptofano (Tryp) possono essere assorbiti dal corpo umano per sintetizzare nuove molecole per sostenere le normali funzioni biologiche1. Phe è necessario per la sintesi di proteine, melanina e tirosina, mentre Tryp è necessario per la sintesi di melatonina, serotonina e niacina 2,3. Tuttavia, il consumo eccessivo di questi AAA può sovraregolare il bersaglio nei mammiferi della via della rapamicina (mTOR), inibire la proteina chinasi attivata da AMP e interferire con il metabolismo mitocondriale, alterando collettivamente la biosintesi delle macromolecole e portando alla produzione di precursori maligni, come le specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule sane 4,5,6. La visualizzazione diretta delle dinamiche metaboliche alterate sotto l'eccesso di regolazione AAA è essenziale per comprendere il ruolo delle AAA nel promuovere lo sviluppo del cancro e la crescita delle cellule sane 7,8,9.
Gli studi AAA tradizionali si basano sulla gascromatografia (GC)10. Altri metodi, come la risonanza magnetica (MRI), hanno risoluzioni spaziali limitate, rendendo difficile eseguire analisi cellulari e subcellulari di campioni biologici11. Recentemente, il desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI) è stato sviluppato per chiarire il ruolo degli AAA nelle sintesi lipidiche e proteiche nella proliferazione del cancro con biomarcatori non invasivi12,13,14. Tuttavia, questa tecnica soffre ancora di profondità di imaging poco profonde, scarsa risoluzione spaziale e ampia preparazione del campione. A livello cellulare, gli isotopi stabili non tossici, come l'azoto-15 e il carbonio-13, possono essere tracciati con imaging multi-isotopico e spettrometria di massa di ioni secondari su scala nanometrica per comprendere la loro incorporazione in macromolecole. Tuttavia, questi metodi sono distruttivi per i campioni biologici viventi15,16. La microscopia a forza atomica (AFM) è un'altra potente tecnica in grado di visualizzare la dinamica metabolica17. La lentezza della scansione durante l'imaging AFM, d'altra parte, può causare la distorsione dell'immagine del risultato dalla deriva termica.
Abbiamo sviluppato una modalità di imaging biortogonale non invasiva accoppiando la microscopia a diffusione Raman stimolata con ossido di deuterio (D2O) (DO-SRS) e la microscopia a fluorescenza a due fotoni senza etichetta (2PEF). Questa modalità raggiunge un'elevata risoluzione spaziale e specificità chimica durante l'imaging di campioni biologici 18,19,20,21,22,23,24. Questo protocollo introduce le applicazioni di DO-SRS e 2PEF per esaminare le dinamiche metaboliche dei lipidi, delle proteine e dei cambiamenti del rapporto redox durante la progressione del cancro. Poiché D2O è una forma isotopica stabile dell'acqua, le biomolecole cellulari possono essere marcate con deuterio (D) a causa della sua rapida compensazione con l'acqua corporea totale nelle cellule, formando legami carbonio-deuterio (C-D) attraverso lo scambio enzimatico21. I legami C-D in macromolecole di nuova sintesi, inclusi lipidi, proteine, DNA / RNA e carboidrati, possono essere rilevati nella regione silenziosa cellulare dello spettro Raman 20,21,22,25,26,27. Con due impulsi laser sincronizzati, i legami C-D di lipidi e proteine appena sintetizzati possono essere visualizzati su singole cellule tramite imaging iperspettrale (HSI) senza estrarli o etichettarli con agenti citotossici. Inoltre, la microscopia SRS ha la capacità di costruire modelli tridimensionali (3D) di regioni selezionate di interesse in campioni biologici catturando e combinando una serie di immagini in sezione trasversale22,26. Con l'imaging iperspettrale e volumetrico 3D, DO-SRS può ottenere distribuzioni spaziali di macromolecole appena sintetizzate in singole cellule, insieme al tipo di organelli che facilitano il processo di promozione della crescita del cancro ai sensi della regola AAA22. Inoltre, utilizzando 2PEF, possiamo ottenere segnali di autofluorescenza di Flavina e nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) ad alta risoluzione, profondità di penetrazione profonda e danni di basso livello in campioni biologici21,23,24. I segnali di autofluorescenza di flavina e NADH sono stati utilizzati per caratterizzare l'omeostasi redox e la perossidazione lipidica nelle cellule tumorali22,26. Pertanto, non solo l'accoppiamento di DO-SRS e 2PEF fornisce un'analisi subcellulare delle dinamiche metaboliche regolate da AAA nelle cellule tumorali con elevata distribuzione spaziale, informazioni sulla specificità chimica e preparazione minima del campione, ma il metodo riduce anche la necessità di estrarre o etichettare molecole endogene con reagenti tossici. In questo protocollo, presentiamo prima le procedure di D2O e la preparazione di aminoacidi, nonché la coltura di cellule tumorali. Quindi, mostriamo i protocolli di imaging DO-SRS e imaging 2PEF. Infine, presentiamo i risultati rappresentativi dell'imaging SRS e 2PEF, che dimostrano i cambiamenti metabolici regolati da AAA di lipidi e proteine e i cambiamenti del rapporto redox nelle cellule tumorali. Un'illustrazione dettagliata del processo è evidenziata nella Figura 1.

<table><tbody><tr><td>10 ml di pipette sierologiche</td><td>Avantor (by VWR)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16% di formaldeide, senza metanolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 piastra</td> <td>a 24 pozzettiFisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>Filtro per siringa da 25 mm, 2 & m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003</td></tr><tr><td>460 nm Cubo</td><td>filtro Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>Adattatori CA dell'alimentatore per LD OBIS 6 Laser Remote</td><td>Olympus</td><td></td><td>Alimentazione al laser</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>Terminatore BNC 50 Ohm</td><td>Mini circuiti</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cavo BNC</td> Cavo coassiale <td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>, BNC maschio/maschio</td></tr><tr><td>Specchio dielettrico a banda larga</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Condensatore centrifugo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Corning</td><td>2850-25</td><td>Alimentatore</td></tr><tr><td>CC</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per colture cellulari di dimetilsolfossido</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf'aquila</td></tr><tr><td>modificata di Dulbecco' s Medium senza metionina, treonina e piruvato di sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Con bicarbonato di sodio e senza metionina, treonina e piruvato di sodio.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium</td><td>Corning</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>Versione 1.53t 24 agosto 2022</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Acqua pesante (ossido di deuterio)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Celle Hela</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Emocimetro</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc = aw.ds</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda ad alto diametro</td><td>esterno Tecnologia cromatica</td><td>ET890 / 220m</td><td>Filtra il raggio di Stokes e trasmette il raggio della pompa</td></tr><tr><td>HyClone Fetale Siero Bovino (FBS)</td> <td>Cytiva &nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.25% (1x) Soluzione</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Sistema laser SRS integrato</td><td>Fisica applicata & Elettronica, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD fornisce un impulso di uscita a 1031 nm con larghezza dell'impulso di 6 ps e frequenza di ripetizione di 80 MHz, che funge da fascio di Stokes. Il fascio raddoppiato di frequenza a 532 nm viene utilizzato per seminare in modo sincrono un oscillatore parametrico ottico (OPO) a picosecondi per produrre un treno di impulsi bloccato in modalità con larghezza di impulso di cinque ~ 6 ps (il raggio idler dell'OPO è bloccato con un filtro interferometrico). La lunghezza d'onda di uscita dell'OPO è regolabile da 720&ndash; 950 nm, che funge da raggio della pompa. L'intensità del fascio di Stokes a 1031 nm è modulata sinusoidalmente da una EOM integrata a 8 MHz con una profondità di modulazione superiore al 90%. Il fascio della pompa è sovrapposto spazialmente al fascio di Stokes utilizzando uno specchio dicroico all'interno di picoEMERALD. La sovrapposizione temporale tra gli impulsi di pompa e quelli di Stokes è ottenuta con uno stadio di ritardo incorporato e ottimizzata dal segnale SRS di D2O puro al microscopio.</td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser invertito</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH Scatola di controllo</td><td>Olympus</td><td></td><td>Control il microscopio a scansione laser</td></tr><tr><td>Montaggio a specchio cinematico</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 regolatori esagonali a basso profilo</td></tr><tr><td>L-fenalynine</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td> Amplificatore <td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr> <tr><td>Lock-In</td><td>Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>Divisore di fascio dicroico passa-lungo</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>Laser 980 nm BrightLine divisore di fascio dicroico piatto laser a bordo singolo</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Versione: R2022b</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html</td></tr><tr><td>vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 Software di imaging per microscopia</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>NA Condensatore d'olio</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>6-U130</td><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Wet n Wild</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>Origin OriginLab</td><td></td><td>Origin 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Periscopio</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>Include le unità superiore e inferiore, &Oslash; Palo da 1" e forcella di serraggio.</td></tr><tr><td>PicoEmerald System</td><td>A.P.E</td><td>N/A Scatola</td><td></td></tr> https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ <tr><td>schermata con connettori BNC</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>Scatola in alluminio con coperchio, rivelatore a fotodiodo Si BNC femmina/femmina</td></tr><tr><td>Costruito</td> in <td>casa</td> serie <td>N/A</td><td>DYI Distanziatori</td></tr> per <tr><td>wafer</td><td></td><td></td><td></td>di silicio</tr><tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr> <tr><td>Spettroscopia Raman spontanea</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/</td></tr> <tr><td>Microscopia a diffusione Raman stimolata</td><td>Costruito in casa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Touch&nbsp; Pannello controller</td><td>Olympus</td><td></td><td>Controlla la direzione X-Y del microscopio a scansione laser</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,4% (0,85% NaCl)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Kaverme - Amazon</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>Due fotoni eccitazione fluorescenza microscopia</td><td>casa</td> costruito <td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>pesatura carta...</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper</td></tr><tr><td>Zurich LabOneQ Software</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>Controlla l'amplificatore lock-in Zurich</td></tr></tbody></table>

imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Gli amminoacidi aromatici essenziali (AAA) sono elementi costitutivi per sintetizzare nuove biomasse nelle cellule e sostenere le normali funzioni biologiche. Ad esempio, un'abbondante fornitura di AAA è importante per le cellule tumorali per mantenere la loro rapida crescita e divisione. Con questo, c'è una crescente domanda di un approccio di imaging altamente specifico e non invasivo con una preparazione minima del campione per visualizzare direttamente come le cellule sfruttano gli AAA per il loro metabolismo in situ. Qui, sviluppiamo una piattaforma di imaging ottico che combina il sondaggio all'ossido di deuterio (D2O) con lo scattering Raman stimolato (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF) in un singolo microscopio per visualizzare direttamente le attività metaboliche delle cellule HeLa sotto regolazione AAA. Collettivamente, la piattaforma DO-SRS fornisce un'elevata risoluzione spaziale e specificità di proteine e lipidi di nuova sintesi in singole unità cellulari HeLa. Inoltre, la modalità 2PEF può rilevare segnali di autofluorescenza di nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e flavina in modo label-free. Il sistema di imaging qui descritto è compatibile sia con modelli in vitro che in vivo , che è flessibile per vari esperimenti. Il flusso di lavoro generale di questo protocollo include la coltura cellulare, la preparazione dei terreni di coltura, la sincronizzazione cellulare, la fissazione cellulare e l'imaging dei campioni con le modalità DO-SRS e 2PEF.

L'aggiunta di AAA in eccesso a concentrazioni 15x al terreno di coltura cellulare contenente D2O al 50% ha prodotto bande Raman C-D distinte di lipidi e proteine di nuova sintesi nelle cellule HeLa (Figura 2B). Esperimenti precedenti sono stati eseguiti con diversi livelli di concentrazione, come 2x e 5x, e sebbene i dati non siano presentati, la concentrazione 15x ha prodotto le bande Raman C-D più distinte di lipidi e proteine appena sintetizzati. In particolare, studiando le go...

Presentiamo un protocollo per visualizzare direttamente le attività metaboliche nelle cellule regolate da aminoacidi utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata (DO-SRS) con ossido di deuterio (acqua pesante D2O), che è integrata con la microscopia a fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF).

Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Presentiamo una nuova tecnica di imaging con capacità label-free, elevata specificità chimica e risoluzione subcellulare. La nostra metodologia può rispondere a domande sulla disfunzione metabolica nell'invecchiamento e malattie come il cancro L'imaging Raman, accoppiato con la fluorescenza a due fotoni e la generazione di seconda armonica, offre una tecnologia di imaging non distruttiva e senza etichetta che richiede una preparazione minima del campione e raggiunge un'elevata risoluzione subcellulare senza danneggiare il campione cellulare. Diverse modalità di imaging sono gestite come parte della nostra piattaforma.Gli individui dovrebbero seguire il nostro protocollo al meglio delle loro capacità, notando che il nostro sistema è costruito in casa. Lungo la strada dovrebbero sviluppare la propria pratica per garantire il successo. In due tubi separati iniziare misurando e mescolando 10 milligrammi di polvere DMEM con 4,7 millilitri di acqua distillata doppia in un tubo conico da 15 ml.Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Per entrambi i tubi, aggiungere 4,7 ml di ossido di deuterio, 0,5 ml di FBS e 0,1 ml di penicillina e streptomicina prima di vorticare e invertire il tubo. Quindi, aggiungere la fenilalanina in eccesso a un tubo e la polvere di triptofano in eccesso al secondo tubo e mescolare di nuovo.Aggiungere metionina e treonina a 30 e 95 mg per ml, rispettivamente, a entrambi i tubi, seguito da vortice e capovolgere il tubo. Successivamente, filtrare il mezzo preparato con un filtro a siringa da 25 millimetri con filtri da 0,22 micrometri. Sigillare tutti i supporti contenuti tubi conici con Parafilm.Conservare i supporti preparati a quattro gradi Celsius. Mantenere le cellule guaritrici in un pallone di coltura utilizzando DMEM standard integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina. Subcoltura le cellule guaritrici con un rapporto di divisione di uno a 10 fino a raggiungere l'80% o superiore di vitalità cellulare.Prima di seminare le cellule, immergere la poli-D-lisina sterilizzata, rivestita di laminina, rotonda 12 mm di diametro scivola in 70% etanolo. Asciugare i vetrini di copertura utilizzando salviette prive di lanugine e posizionare i vetrini di copertura puliti negli appositi pozzetti della piastra. Lavare le cellule una volta con PBS senza ioni di magnesio e calcio.Aggiungere lo 0,25% di tripsina per dissociare le cellule di aderenza dal pallone e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre minuti. Quindi aggiungere DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina alle cellule. Pipetta delicatamente su e giù.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 G per tre minuti a temperatura ambiente. Successivamente, ri-sospendere le cellule in DMEM integrato con 0,5% FBS e 1% penicillina e streptomicina. Contare le cellule della colorazione blu tripano usando un emocitometro al microscopio ottico e seminare a una densità di due volte 10 alle quinte cellule per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.Distribuire uniformemente le cellule agitando delicatamente la piastra. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo otto ore, sostituire i vecchi terreni di coltura con il 50% di ossido di deuterio e l'eccesso di fenilalanina o il 50% di ossido di deuterio e mezzi di triptofano in eccesso.Restituire le cellule all'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 36 ore. Ora prepara vetrini da microscopio con spazi di imaging di nove mm di diametro. Posizionare 15 microlitri di PBS, integrati con ioni di calcio e magnesio e risciacquare le cellule con la stessa soluzione.Aggiungere 0,5 ml di soluzione paraformaldeide priva di metanolo al 4% e lasciare la piastra sotto il cappuccio di biosicurezza per 15 minuti. Aspirare la soluzione di paraformaldeide e risciacquarla con PBS, integrata con calcio e magnesio ferro due volte. Aggiungere un mL di PBS, integrato con ioni di calcio e magnesio a ciascun pozzetto.Utilizzare pinzette sterili per rimuovere con cura i vetrini di copertura da ciascun pozzetto. Capovolgerli e posizionare la cella contenente il lato sugli spazi di imaging a contatto con il PBS. Sigillare lo strato esterno del vetrino con il distanziatore di imaging utilizzando uno smalto trasparente.Caricare il campione biologico sul supporto del campione direttamente sotto la lente dell'obiettivo. Quindi fare clic sull'icona della fotocamera sul software per accendere la videocamera e regolare il piano di messa a fuoco per identificare una regione di interesse con l'obiettivo 50X. Passare all'obiettivo 100X.Fare clic sull'icona di arresto per spegnere la videocamera. Quindi selezionare un reticolo di 1.800 linee per mm e impostare l'intervallo di acquisizione da 400 a 3.150 centimetri inverso. Infine, impostare il tempo di acquisizione a 90 secondi l'accumulo a tre e il binning a quattro per il minor rumore e lo spettro più accurato.Fare clic su Start per riscaldare il laser. Iniziare premendo l'interruttore principale della scatola di controllo IX3CBH su On, quindi dall'interruttore principale del controller del pannello a sfioramento. Quindi accendere l'interruttore principale dell'adattatore CA dell'alimentatore per LDOBIS6 telecomando laser collegato al pettine principale del combinatore laser FV31S.Accendere anche l'adattatore CA del LDOBIS6 alimentatore remoto laser collegato al pettine sub laser combinatore FV31S. Successivamente, premere gli interruttori principali del rilevatore di fotodiodi SI e dell'amplificatore di blocco acceso. Impostare l'IR laser a 1031 nanometri Impostare il sistema pico emerald a una lunghezza d'onda regolabile tra 720 e 990 nm.Montare il campione sull'olio e posizionare una grande goccia d'acqua sul vetrino del microscopio dove è fissato il campione. Selezionare la dimensione di scansione come 512 x 512 pixel. Acquisisci e salva le immagini come Olympus.File grafico OIR. Dopo aver impostato il segnale su 862.0, acquisire un'immagine di sfondo e salvarla. Regolate il tempo di permanenza su otto microsecondi per pixel e la dimensione in pixel su 512x512 pixel.Impostare il parametro di potenza dell'otturatore laser su 150 milliwatt Per la ricostruzione dell'immagine 3D, sintonizzare la perdita Raman stimolata su 2.850 cm inversa. Una volta identificate le singole cellule desiderate, registrare il laser per eseguire la scansione dal piano di messa a fuoco superiore per rilevare gli strati superiore e inferiore di tali cellule. L'ossido di deuterio, sondato, stimolato dallo scattering Raman è stato utilizzato per visualizzare la distribuzione spaziale dei segnali CD su singole cellule.Le cellule di controllo mostravano bande CD, lipidiche e proteiche moderate. Tuttavia, il viaggio 15 x v e 15 x ha mostrato divieti lipidici e proteici CD più forti. L'analisi quantitativa ha indicato che l'eccesso di aminoacidi aromatici può sovraregolare la sintesi lipidica dal 10 al 17%, ma downregolare la sintesi proteica del 10%L'analisi metrica del rapporto delle cellule trattate con aminoacidi aromatici ha mostrato un aumento del 50% della flavina divisa per flavina più NADH e un aumento del 10% dei lipidi insaturi diviso per i lipidi saturi.Vengono mostrate la proiezione del volume delle goccioline lipidiche Raman 3D stimolata nelle cellule guaritrici sotto controllo e le condizioni di eccesso di aminoacidi aromatici. Le analisi quantitative delle goccioline lipidiche 3D hanno mostrato un aumento della contea, ma una riduzione delle dimensioni delle cellule trattate con aminoacidi aromatici rispetto al controllo. I parametri di imaging per l'imaging Raman e l'imaging fluorescente a due fotoni devono essere ottimizzati da un campione all'altro per garantire la migliore qualità di immagine.Gli individui possono accoppiare il nostro sistema con la seconda generazione armonica per studiare la struttura del collagene, che chiarisce i primi cambiamenti metabolici nell'invecchiamento e nelle malattie e comprendere la progressione della neurodegenerazione o del cancro. La nostra tecnologia è la prima di questo tipo a visualizzare la sintesi lipidica e proteica in sistemi biologici ad alta risoluzione subcellulare. La tecnologia può anche essere tradotta in clinica per il rilevamento di malattie non invasive.

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13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Questo protocollo presenta un saggio di assorbimento di aminoacidi radiomarcato, utile per valutare il consumo di aminoacidi sia nelle cellule primarie che nelle ossa isolate.

Valutazione del consumo di aminoacidi in cellule ossee in coltura e alberi ossei isolati

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza l'ibridazione in situ a fluorescenza fototermica ottica a infrarossi (OPTIR-FISH), nota anche come FISH fototermica nel medio infrarosso (MIP-FISH), per identificare le singole cellule e comprenderne il metabolismo. Questa metodologia può essere ampiamente applicata per diverse applicazioni, tra cui la mappatura del metabolismo cellulare con la risoluzione di una singola cellula.

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Utilizzando una piattaforma multimodale che combina modalità di imaging ottico label-free, abbiamo sviluppato un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle dinamiche cellulari e del metabolismo. Attraverso l'imaging tramite fluorescenza multifotone, generazione di seconda armonica e microscopia a scattering Raman stimolato, possiamo generare una panoramica olistica dell'ambiente cellulare e molecolare.

Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare

Questo protocollo integra un sistema di bioreattore personalizzato con spettroscopia NMR iperpolarizzata ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato in tempo reale nelle cellule vive, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica per studi metabolici e applicazioni di screening farmacologico.

Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (TAC).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Scopri un'imaging chimico bioortogonale per visualizzare il metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici. Questa tecnica label-free combina microscopia Raman e fluorescenza a due fotoni per analisi subcellulari ad alta risoluzione.

Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici

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