Utilizzo della nicotina in un modello murino esposto alla silice per promuovere la transizione epitelio-mesenchimale polmonare

Il modello murino impiegato in questo studio simula efficacemente l'effetto dell'ingestione cronica di nicotina e dell'esposizione ripetuta alla silice sulle fibrosi polmonari attraverso la transizione mesenchimale epiteliale negli esseri umani. Il modello della porzione di giuria è stato realizzato mediante iniezione sottocutanea di nicotina e gocciolamento nasale di silice in modo semplice e affidabile. Sospendere la silice cristallina sterile in soluzione salina per preparare una sospensione da 20 milligrammi per litro.

Farlo oscillare in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 25 minuti. Posizionare la sospensione di silice con un oscillatore a vortice per tre minuti. Aspirare la sospensione per mescolarla, quindi utilizzare 50 microlitri per il gocciolamento nasale.

Per iniziare l'esposizione alla silice, per prima cosa, posizionare il topo anestetizzato sul palmo di una mano ed esporre la cavità nasale del topo. Iniettare 50 microlitri di sospensione di silice da una narice entro quattro-otto secondi. Per consentire una rapida penetrazione polmonare della sospensione, premere delicatamente il torace del topo con il dito indice per tre-cinque secondi, ripetendo la pressione da tre a cinque volte al secondo per mantenere la frequenza respiratoria.

Una volta che il topo mostra una respirazione uniforme, mettilo sotto osservazione in una gabbia per tre minuti. Preparare le siringhe di nicotina aspirando aria fino al segno di 0,2 millilitri in una siringa da un millilitro. Quindi, prelevare 125 microlitri di nicotina.

Picchiettare la siringa per riempire l'ago e l'estremità anteriore con nicotina, quindi posizionarla in un vassoio al riparo dalla luce. Con la mano destra, afferra la coda del mouse. Quando il mouse si è rilassato, usa il pollice e l'indice sinistro per applicare una pressione moderata sulla pelle dalla coda al bordo dell'orecchio.

Ora, rilascia la mano destra e usa il sinistro, il piccolo e l'anulare per pizzicare la coda e gli arti posteriori per immobilizzare il mouse. Tenere la siringa per iniezione nella mano destra e perforare la pelle sulla parte posteriore del collo in direzione testa-coda. Iniettare la nicotina a una velocità uniforme.

Fissare il topo anestetizzato su una piastra di prova in schiuma e spruzzare la pelliccia con alcol al 75%. Fai un'incisione lungo la linea mediana dell'addome esponendo la cavità toracica. Fai un piccolo taglio all'apice del lato destro del cuore.

Iniettare 20 millilitri di PBS pre-raffreddato lentamente e uniformemente dall'apice del cuore sinistro, facendo defluire il sangue dall'apertura creata all'apice del cuore destro. Rimuovere l'intero lobo polmonare e conservarlo in frigorifero a meno 80 gradi Celsius. Perfondere i topi rimanenti con 10 millilitri di para-formaldeide al 4%.

Dopo la perfusione PBS, conservare i polmoni in 30 millilitri di soluzione di para-formaldeide. Dopo 72 ore, immergere i polmoni nel fissativo preparato e metterli a bagnomaria ad ultrasuoni. Temperato a 40 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, eseguire la disidratazione mettendo il tessuto in etanolo al 75%, quindi in etanolo al 95% e quindi in etanolo anidro per 50 minuti ciascuno. Immergere il tessuto polmonare nello xilene per 50 minuti due volte per lavare il tessuto. Metti il tessuto in cera di paraffina sciolta per due o tre ore a 55-60 gradi Celsius.

Una volta che la cera si è indurita, utilizzare una sezionatrice per ottenere le fette di polmone di quattro o cinque micrometri di spessore. Riscaldare le sezioni a 45 gradi Celsius in acqua ultrapura. Posizionare le sezioni polmonari su un vetrino da microscopio aderente una volta che la cera si è sciolta.

Gli studi di colorazione con ematossilina ed eosina hanno dimostrato che i topi esposti alla nicotina combinata con la silice avevano un danno polmonare significativamente più grave rispetto a quelli esposti alla sola nicotina o alla sola silice. La colorazione di Masson ha rivelato un aumento della deposizione di fibre di collagene nei polmoni esposti alla combinazione di silice nicotina rispetto agli altri gruppi. Le strutture alveolari sono state distrutte nei topi esposti alla silice.

Gli studi immunoistochimici hanno rivelato un aumento dei macrofagi positivi CD due zero sei e del fattore pro-fibrotico, le cellule TGF beta one positive nei topi esposti alla combinazione di nicotina e silice. L'espressione di vimentina era più alta nei topi sottoposti alla doppia espressione rispetto agli altri gruppi. Gli studi immunoistochimici e la quantificazione delle proteine suggeriscono una grave trasformazione mesenchimale epiteliale.

Per garantire il successo dell'iniezione di nicotina, l'operatore deve acquisire familiarità con la presa dei topi, poiché afferrare la pelle nella parte posteriore del collo potrebbe essere doloroso per loro.