Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Le tecniche qui presentate sono utili per studiare la comunità di funghi endofiti associati a diversi organi vegetali. L'isolamento dei funghi endofiti ne consente l'identificazione ed è prezioso in altre tecniche come la germinazione simbiotica. Per iniziare, preparare piastre di Petri da otto a 10 centimetri di terreno di coltura PDA integrate con tre millilitri per litro di antibiotico.

Verificare la presenza di contaminazioni incubando le piastre di Petri del terreno di coltura a 36 gradi Celsius per 24 ore prima dell'uso. Il giorno successivo, disinfestare superficialmente i frammenti di piante micoeterotrofe sane utilizzando una procedura standard e metterli in una capsula di Petri sterile. Per valutare l'efficacia della disinfestazione superficiale dei campioni, inoculare su PDA alcune gocce di acqua distillata utilizzata durante l'ultimo lavaggio dei campioni.

Successivamente, utilizzando un bisturi fiammeggiato e una pinza, sezionare i campioni in pezzi spessi 0,2 centimetri. Sezionare i campioni per amplificare la superficie da mettere a contatto con il terreno. Posizionare cinque frammenti degli organi sotterranei nella piastra PDA integrata con antibiotici il più lontano possibile senza toccare i bordi della piastra.

Sigilla le piastre di Petri con pellicola trasparente e conservale al buio a 25-27 gradi Celsius per cinque giorni. Un giorno prima della subcoltura, preparare piastre di Petri da cinque centimetri utilizzando da cinque a sette grammi per litro di terreno AA e incubare le piastre a 36 gradi Celsius per 24 ore. Per purificare gli isolati fungini, differenziare le colonie di piastre PDA in base al colore, al modello di crescita, alla consistenza e al formato dei margini.

Quindi delimitare i margini della colonia sul lato inferiore del piatto. Identifica anche le colonie con un codice. Utilizzando la punta di uno stuzzicadenti di legno autoclavato, recuperare una piccola quantità di micelio dai margini della colonia fungina identificata e striare la piastra AA, producendo tre strie a un centimetro l'una dall'altra e dai bordi del piatto.

Etichettare la targhetta AA con il codice appropriato utilizzando carta adesiva e matita. Sigillare le piastre prima di incubarle al buio a 25-27 gradi Celsius per tre giorni. Dopo l'incubazione, osservare meticolosamente le piastre per identificare le ife fini che formano le singole colonie.

Delimitare l'area delle singole colonie utilizzando un pennarello indelebile. Tagliare una porzione del terreno contenente la colonia utilizzando uno stuzzicadenti autoclavato e trasferire il volume tagliato al centro di una nuova piastra di Petri PDA senza antibiotici. Dopo aver etichettato le piastre di Petri con i codici degli isolati, sigillarle con pellicola trasparente e mantenerle al buio a 25-27 gradi Celsius per sette-14 giorni.

Per iniziare la conservazione degli isolati fungini con il metodo di Castellani, aggiungere 0,5 millilitri di acqua distillata alla provetta per microcentrifuga autoclavata da due millilitri. Usando uno stuzzicadenti autoclavato, tagliare un terreno cuboide di 0,5 x 0,5 centimetri dai margini del micelio degli isolati purificati già cresciuti. Posizionare da quattro a sei cubi nelle provette della microcentrifuga con acqua distillata.

Conservare i tubi al buio a 25 gradi Celsius per tutto il tempo necessario. Quando necessario, recuperare un parallelepipedo e posizionarlo al centro di una nuova parabola PDA per far crescere un isolato immagazzinato. Inizia il metodo di montaggio a strappo posizionando una goccia di una macchia blu Toluidina su un vetrino pulito.

In tale tecnica è possibile utilizzare diverse colorazioni. Usando uno stuzzicadenti autoclavato, rimuovere con cura alcune ife dall'isolato cresciuto e posizionarle nella goccia di macchia. Posiziona un vetrino coprioggetto e analizzalo al microscopio ottico.

Per il metodo di montaggio del nastro adesivo, posizionare una goccia di una macchia blu di cotone lattofenolo su un vetrino pulito. Tagliare una striscia di nastro adesivo trasparente di dimensioni che si adattino bene al vetrino e alla goccia di macchia centrale. Dirigi la superficie adesiva della striscia adesiva sulla superficie del micelio e cerca di raccogliere alcune ife senza premere o raccoglierne troppe.

Quindi incolla il nastro sul vetrino, assicurandoti che la macchia sia a contatto con le ife raccolte. Posizionare una goccia d'acqua sopra il nastro e posizionare un vetrino coprioggetto prima di analizzare il vetrino al microscopio ottico. La crescita di piccoli gruppi di miceli filamentosi che emergono dall'interno dei frammenti è stata osservata dopo cinque giorni di inoculazione del frammento di organo vegetale micoeterotrofo sul terreno PDA.

Durante i 7-14 giorni di inoculazione dell'isolato purificato, è stata osservata la crescita centrifuga della colonia isolata fungina pura sul PDA, formando un unico micelio circolare. Le possibili contaminazioni sono state facilmente identificate, compromettendo l'omogeneità della colonia per quanto riguarda l'aspetto della forma di crescita, il colore e la produzione di pigmenti nel substrato. Una colonia isolata dalle radici fusiformi dell'orchidea micoeterotrofica, Wullschlaegelia aphylla, era opaca senza pigmenti diffusibili o essudati nel substrato.

La colonia era da biancastra a grigia sul lato superiore e brunastro sul lato inferiore. I miceli erano aerei e abbondanti, e i margini erano irregolari e aerei. La colonia aveva una tessitura vellutata e una topografia rugosa senza strutture macroscopiche.

Le strutture che non erano facilmente visibili nel micelio non colorato sono state esposte dopo aver colorato il micelio fungino con lattofenolo blu cotone e toluidina blu-O, facilitandone l'identificazione. I metodi di isolamento fungino qui presentati possono essere applicati anche alle piante verdi per l'identificazione degli endofiti fungini. I funghi isolati possono essere utilizzati in prove di germinazione simbiotica.