Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

L'arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche aiuta a delineare il loro contenuto, decifrare le loro fazioni e datare progettando modi per costruire e generare vescicole extracellulari ricombinanti che sfruttano principalmente i candidati vaccini. Sei serie si generano da diverse posizioni della superficie batterica. Non hanno marcatori conservati.

Pertanto, qualsiasi approccio basato sull'affinità può arricchire solo un sottoinsieme delle EV. Al contrario, il nostro metodo cattura tutte le vescicole extracellulari di micobatteri generate. A dimostrare la procedura sarà Mohd Ilyas, uno studente di dottorato del mio laboratorio.

Per iniziare, aggiungere un millilitro di scorta di glicerolo di Mycobacterium smegmatis wild-type o ricombinante a una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente 10 millilitri di brodo 7H9 preriscaldato. Chiudere il coperchio e far roteare la provetta prima di incubare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius tra 200 e 220 giri/min. Il giorno successivo, quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa uno, centrifugare la coltura a 3, 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante in un contenitore di scarto liquido.

Aggiungere un millilitro di terreno Sautons preriscaldato e risospendere delicatamente per ottenere una sospensione uniforme. Portare il volume a 10 millilitri utilizzando i terreni Sautons. Centrifugare di nuovo ed eliminare il surnatante.

Dopo il lavaggio, risospendere le cellule batteriche. in 20 millilitri di terreno Sauton preriscaldato e misurare la densità ottica a 600 nanometri. Inoculare il volume richiesto di sospensione batterica in un matraccio di Erlenmeyer da uno a due litri contenente 330 millilitri di terreno Sautons e incubare a 37 gradi Celsius in 200 giri/min fino a quando la densità ottica raggiunge 0,3.

Il giorno successivo, lavare le celle una volta come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet in 330 millilitri di Sautons contenenti 1/10 di Tween 80. Distribuire 50 millilitri della sospensione cellulare in sei palloni da un litro, ciascuno contenente 280 millilitri di Sauton preriscaldati contenenti 1/10 di Tween 80. Incubare le colture a 37 gradi Celsius a 200 RPM fino a quando la densità ottica raggiunge da due a 2,5.

Aggiungere due litri di colture in fase esponenziale media a sei flaconi da 400 millilitri e centrifugare a 8.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere i palloni o i becher surnatanti e pre-raffreddati in autoclave e conservare un'aliquota del pellet per le procedure analitiche. Il pellet è colorato se le vescicole extracellulari sono ricombinanti per mCherry e marroni se sono wild-type o ricombinanti per proteine non fluorescenti.

Filtrare il surnatante della coltura attraverso un filtro di smaltimento da 0,45 micron, seguito da una filtrazione attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere tutte le tracce di batteri. Successivamente, prelavare i concentratori a membrana da 30 kilodalton con 15 millilitri di acqua bidistillata a 4.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare con 15 millilitri di terreno Sautons freddo pre-filtrato utilizzando le stesse condizioni per rimuovere tutte le tracce di sostanze chimiche.

Dopo il lavaggio, aggiungere 15 millilitri di surnatante coltivato filtrato in un concentratore e concentrare a 4.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il concentrato in una provetta da centrifuga Oak Ridge fredda da 40 millilitri o in una provetta da centrifuga Falcon fresca da 50 millilitri. Una volta concentrati tutti i due litri di filtrato di coltura, trasferire il concentrato in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 millilitri a doppia distillazione, lavata e pre-raffreddata e sottoposta a una centrifugazione in due fasi.

Prima a 4.000 G e poi a 15.000 G.Trasferire il concentrato centrifugato in una provetta da ultracentrifuga da 38,5 millilitri pre-raffreddata e centrifugare a 100.000 G per quattro ore a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in una provetta da centrifuga Falcon fresca da 50 millilitri pre-raffreddata. capovolgere la provetta dell'ultracentrifuga su una carta assorbente fresca e priva di lanugine per rimuovere le tracce del surnatante e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone HEPES.

Stratificare il pellet risospeso sul fondo di una provetta per ultracentrifuga in polipropilene UltraClear pre-raffreddata da 13 millilitri e mescolare delicatamente con quattro millilitri di soluzione inerte di iodixanolo con gradiente di densità al 60%. Quindi sovrapporre con un millilitro ciascuno di 40%, 30%, 20% e 10% di iodiolo. Riempi il tubo aggiungendo quattro millilitri di iodixanolo al 6% nella parte superiore.

Dopo aver pesato accuratamente la provetta in un bicchiere di vetro o in un supporto, trasferirla delicatamente nei secchi oscillanti e poi nel rotore dei secchi oscillanti per l'ultracentrifugazione a 141.000 G per 16 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere con cautela la provetta e raccogliere una frazione di un millilitro in provette per microcentrifuga sterilizzate in autoclave. L'analisi TEM ha mostrato che le vescicole extracellulari micobatteriche sono circolari e l'analisi di nano-tracciamento ha confermato vescicole extracellulari di dimensioni diverse con diametri compresi tra 20 e 250 nanometri.

Quando l'estremità N-terminale di mCherry è stata fusa traslazionalmente con l'estremità C-terminale di CFP-29, una porzione di mEV arricchite di Msm è diventata rosa, indicando la capacità di cf-29 di trasportare una proteina estranea di interesse. CFP-29 è stato quindi utilizzato per valutare la consegna di EsxA negli EV Msm. L'EsxA di Mtb è stato osservato negli EV Msm in basse quantità.

CFP-29 EsxA 3X FLAG è risultato più stabile e si è accumulato a livelli più elevati nelle mEV. L'arricchimento delle vescicole extracellulari da micobatteri cresciuti in condizioni fisiologiche diverse fornisce informazioni sul loro contenuto alterato e sulle funzioni modificate che determinano l'infettività sostenuta, la patogenesi e la diffusione dei patogeni.