Miglioramento dell'enumerazione delle spore di Bacillus subtilis e analisi dell'etichetta nella citometria a flusso
30 giugno 2023
Questo protocollo si concentra sull'uso della citometria a flusso e del conteggio delle microsfere per quantificare le spore batteriche marcate con bromuro di etidio. Il metodo è anche efficiente per analizzare l'accoppiamento covalente di proteine sulla superficie di spore intatte.
Il contatore di cellule di spore di Bacillus subtilis con metodi tradizionali può essere un compito laborioso, poiché questi metodi possono essere completamente manuali e la loro precisione dipende dall'esperienza dell'operatore. Questo protocollo rende possibile l'enumerazione delle spore dormienti e in germinazione. Inoltre, la tecnica consente anche di determinare la percentuale di coping delle proteine fluorescenti sulla sua superficie.
Data la fase di configurazione presente in questo protocollo, la visione dimostra con le strutture e la comprensione tecnica e il dettaglio della cura in questa esecuzione. Inizia accedendo al software del citometro. Nell'area di lavoro del software, selezionare Citometro, seguito da Avvio fluidico.
Quindi scegli Modalità di pulizia. E infine, avvia SIT Flush. Prelevare 50 microlitri di spore in autoclave e incubarle con bromuro di etidio a un fattore di diluizione dello 0,05% volume per volume per 30 minuti al riparo dalla luce.
Lavare le spore tre volte con PBS centrifugando a 17.949 G per 10 minuti e risospendendo in PBS. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di perline seguendo le raccomandazioni del produttore per la diluizione e analizzare il campione utilizzando un citometro a flusso. Definire la strategia di gating in base alle caratteristiche morfometriche e di fluorescenza delle particelle utilizzando come riferimento il controllo negativo.
Quindi mescolare delicatamente il tubo. Collegarlo alla sonda del citometro a flusso e fare clic su Acquisisci. Per impostare la potenza del laser, vai alla scheda dei parametri nella finestra del citometro, regola la dispersione in avanti a 375 e la dispersione laterale a 275.
Quindi selezionare la scheda Soglia e impostarla su 500. Successivamente, analizzare il campione privo di colorante contenente solo spore per eliminare l'autofluorescenza. Nella scheda dei parametri, regolare le tensioni del rivelatore di filtri tre su 603 e le tensioni del rivelatore di filtri cinque su 538 per distinguere tra popolazioni negative e positive utilizzando la fluorescenza nei controlli.
Quindi fare clic su Compensazione e impostare l'offset di impostazione del rilevatore di filtri 5 per 3 su uno. Per configurare il dispositivo per l'acquisizione, selezionare Esperimento, scegliere il layout dell'esperimento e impostare l'acquisizione su 30.000 eventi. Dopo aver regolato i parametri, acquisire i dati per i campioni etichettati e contenenti microsfere nel citometro a flusso.
Centrifugare 50 microlitri di spore a 17,949 G per 10 minuti. Successivamente, risospendere le spore utilizzando 25 microlitri di 1-etil-3-3-dimetilamminopropil carbodiimmide e incubare per 15 minuti. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di N-idrossisolfosuccinimide a una concentrazione di 50 millimolari alla sospensione di spore.
Incubare la sospensione di spore a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le spore tre volte con PBS centrifugando come mostrato in precedenza. Aggiungere proteine fluorescenti ai campioni e incubare per una notte a 15 gradi Celsius.
Aggiungere 10 milligrammi per millilitro di bromuro di etidio diluito da 1 a 50, quindi lasciare i campioni su ghiaccio per un'ora, al riparo dalla luce. Dopo aver lavato le spore e definito i gate come mostrato in precedenza, modificare i parametri per il rilevatore di filtri tre sull'asse x e il rilevatore di filtri cinque sull'asse Y del dot plot. Il metodo delle perle di conteggio ha rilevato due volte 10 al terzo spore per microlitro nei campioni di spore in autoclave.
Una colorazione al bromuro di etidio di campioni di spore in autoclave ha mostrato un'intensità di fluorescenza media più elevata rispetto alla colorazione di spore non sterilizzate in autoclave, indicando una maggiore colorazione del materiale genetico. La superficie delle spore dell'autoclave, accoppiata con l'anticorpo anti-interleuchina 10 umana marcato APC, ha mostrato una maggiore efficienza di accoppiamento rispetto alle spore non sterilizzate in autoclave. La presenza di spore permeabili al bromuro di etidio indicava la possibile presenza di spore germinate nella popolazione totale.
Sulla base delle analisi di citometria a flusso, è stato osservato che l'anticorpo fluorescente mostrava una percentuale maggiore di accoppiamento con le spore dormienti rispetto a quelle germinate. Inoltre, all'aumentare della concentrazione di anticorpi fluorescenti, è stato osservato un aumento della percentuale di spore accoppiate e dell'intensità media della fluorescenza. È importante eseguire un'accurata omogeneizzazione delle perle di corrente per garantire letture precise attraverso la citometria a flusso e l'enumerazione accurata delle spore.
Standardizzando la concentrazione di antigeni attaccati alle spore, gli studi canadesi analizzano l'uso delle spore come anticorpi vaccinali.
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Panoramica
Questo protocollo si concentra sull'uso della citometria a flusso e dei conti dei bead per quantificare le spore batteriche etichettate con bromuro di etidio. Permette un'analisi efficiente del legame covalente delle proteine sulla superficie di spore intatte.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Microbiologia
- Citometria a flusso
- Tecniche di conteggio cellulare
Sfondo
- I metodi tradizionali per contare le spore di Bacillus subtilis richiedono molto lavoro.
- La precisione del conteggio manuale dipende dall'esperienza dell'operatore.
- Questo protocollo permette il conteggio delle spore dormienti e germinanti.
- Valuta anche la percentuale di proteine fluorescenti sulle superfici delle spore.
Obiettivo dello studio
- Semplificare il conteggio delle spore batteriche.
- Migliorare la precisione nel conteggio delle spore.
- Analizzare il legame delle proteine sulle spore usando la citometria a flusso.
Metodi utilizzati
- Citometria a flusso per contare le spore.
- Uso del bromuro di etidio per etichettare le spore.
- Configurazione del software per l'operazione del citometer.
- Analisi del legame delle proteine fluorescenti sulle superfici delle spore.
Risultati principali
- Conteggio efficiente delle spore di Bacillus subtilis raggiunto.
- Valutazione accurata delle spore dormienti e germinanti.
- Determinazione riuscita delle percentuali di legame delle proteine.
- Il protocollo dimostra facilità d'uso e comprensione tecnica.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora l'efficienza del conteggio delle spore.
- Fornisce un metodo affidabile per analizzare le interazioni proteiche.
- La citometria a flusso è uno strumento prezioso negli studi microbiologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate enumeration and surface labeling analysis of Bacillus subtilis spores are critical for biotechnological applications where quantification and antigen display efficiency impact downstream R&D. Flow cytometry-based workflows, leveraging DNA and surface markers, enable standardized, operator-independent spore quantification and facilitate robust assessment of protein coupling. These capabilities support translational research and platform development for spore-based delivery systems and immunological studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of antigen display on spore surfaces for target validation studies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing dormant from germinated spores via DNA labeling.
- Facilitates predictive confidence in spore-based platform development through reproducible enumeration.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-throughput quantification of labeled spores for assay development.
- Improves reproducibility and scalability of spore-based screening assays using counting beads.
- Enables reliable evaluation of coupling efficiency for surface-displayed proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spore quantification with translational biomarker strategies for vaccine and delivery platform studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling precise measurement of spore populations and surface modifications.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models using robust, quantitative readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative, reproducible spore enumeration and surface marker analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antigen display and spore viability through dual labeling strategies.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized quantification for downstream compound or antigen screening.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence and bead-based readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with biomarker and platform development objectives in vaccine and delivery research.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for spore-based quantification and surface analysis across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spore-based applications.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of spore enumeration and labeling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of spore-based platforms and translational studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and gating strategy definition.
- Needs access to cytometry instrumentation and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of labeling protocols and bead handling for reproducibility.
- May require adaptation for different spore types or surface markers based on application.
- Dependent on thorough homogenization and control setup to ensure accurate quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Flow Cytometry Setting and Preparation of Autoclaved Spores for Flow Cytometry
1:47
Analysis Using Flow Cytometry
3:27
Estimation of the Protein Coupling Index on a Spore Surface Using Flow Cytometry
4:52
Results: Fluorescence Coupling Percentage Analysis of Bacillus subtilis Spores
6:08
Conclusion
