The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster
24 febbraio 2023
Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è ampiamente utilizzato per la ricerca biologica e tossicologica. Per espandere l'utilità delle mosche, abbiamo sviluppato uno strumento, l'array di anestesia seriale, che espone simultaneamente più campioni di mosca agli anestetici generali volatili (VGA), rendendo possibile studiare gli effetti collaterali (tossici e protettivi) dei VGA.
La SAA consente un'elaborazione ad alto rendimento per studiare la farmacologia degli agenti volatili in organismi modello invertebrati dotati di un cervello sofisticato e di un vasto repertorio di comportamenti. In combinazione con la cassetta degli attrezzi genetica disponibile in Drosophila melanogaster, questa tecnica consente di studiare la farmacogenetica degli agenti volatili in modo rapido ed economico. Molte persone sono esposte ad agenti volatili come inquinanti o agenti terapeutici.
Oltre all'anestesia, gli anestetici volatili hanno numerosi effetti collaterali tossici e benefici. Il grado di effetto è in parte determinato dalla genetica, che è rimasta in gran parte inesplorata. Dopo aver realizzato il telaio in legno, modificare i tappi del tubo cronaca da 50 millilitri praticando due fori in ciascun cappuccio con una punta da 9/32 pollici.
Carteggiare i fori per pulire la plastica lacera. Carteggiare anche la parte superiore del cappuccio per irruvidire la superficie. Quindi tagliare cinque pipette sierologiche da millilitri a misura incidendo la plastica e rompendola sulla linea segnata.
Carteggiare le estremità delle pipette tagliate o rotte. Successivamente, incollare la rete ai tubi e tagliare la rete alle dimensioni del tubo una volta che l'adesivo si asciuga. Inserire i tubi nei fori dei cappucci conici con entrambi i tubi che si estendono sopra il cappuccio.
Assicurarsi che il tubo di afflusso si estenda più a lungo nel tubo rispetto al deflusso. Applicare la colla sulla parte superiore dei tappi attorno ai tubi per fissare le parti insieme e lasciarle asciugare. Fissare le fascette dei cavi adesivi al telaio.
Fissare i cappucci al telaio usando fascette e tagliare le estremità della cravatta con cerniera corte. Tagliare e collegare la lunghezza del tubo tygon ai tubi di afflusso e deflusso su ciascun tappo modificato. Partendo dall'estremità a monte, collegare il tubo prima all'afflusso, quindi dal deflusso all'afflusso della posizione successiva.
Quindi, aggiungi un indicatore di flusso al maggior afflusso a valle. Metti un tubo conico da 50 millilitri nella prima posizione e segna il segno di riempimento dell'acqua. Rimuovere il tubo.
Riempilo con acqua sotto il tubo di afflusso e rimettilo in posizione. Preparare l'interfacciamento per il vaporizzatore. Rimuovere gli stantuffi, tagliare le tacche da due siringhe erogatrici da 10 millilitri e inserirle nell'afflusso e nel deflusso del vaporizzatore con le tacche rivolte direttamente verso la parte anteriore del vaporizzatore per allinearsi con i fori.
Collega l'intero sistema. Utilizzare tubi tygon per collegare il serbatoio del gas di trasporto con il regolatore, il misuratore di portata specifico del gas, il vaporizzatore e l'SAA. Riempi le posizioni vuote sull'array con tubi cronici vuoti da 50 millilitri.
Ora accendi il serbatoio del gas. Aprire il flussometro a due litri al minuto e accendere il vaporizzatore allo 0%Confermare il flusso di gas attraverso il sistema controllando il flussometro a monte del vaporizzatore e l'indicatore di flusso a valle dell'ultima camera del SAA per il flusso. In alternativa, inserire l'estremità del tubo a valle nell'acqua e cercare le bolle.
24 ore o più prima dell'esposizione anestetica ordinare le coorti di mosche secondo necessità per l'esperimento utilizzando il metodo preferito. Trasferire le mosche dalle fiale di cibo in tubi conici vuoti da 50 millilitri. Contare e registrare eventuali mosche morte prima dell'esposizione.
Smontare e avvitare tubi conici da 50 millilitri con mosche sul SAA. Accendere il gas di trasporto e impostarlo sulla portata desiderata. Impostare il vaporizzatore anestetico alla concentrazione desiderata ed esporre le mosche per la durata desiderata.
Al termine dell'esposizione lavare il sistema con il flusso di gas fresco a 1,5 litri al minuto per cinque minuti, corrispondente a circa 10 volumi del volume totale SAA. Aprire completamente il regolatore di alta pressione, quindi chiuderlo di mezzo giro per garantire il flusso di gas di trasporto. Seguire i tubi per ogni linea fino ai misuratori di portata e al vaporizzatore e controllare il livello di anestetico nei vaporizzatori.
Verificare che quando il gas fluisce, indica il flusso sul flussometro e sull'indicatore di flusso a valle. Alla fine dell'esperimento, lasciare quattro o cinque minuti di flusso d'aria per lavare l'anestetico. Sette linee isolate da una singola popolazione attraverso incontri a coppia singola hanno mostrato variazioni nella mortalità indotta dalla tossicità del fluoro iso a causa della pressione evolutiva nei moscerini ND23 60114.
I moscerini pre-condizionamento con 15 minuti di fluoro al 2% di iso prima della lesione cerebrale traumatica hanno ridotto l'indice di mortalità a 24 ore nei ceppi bianchi 1118 e gialli / bianchi. L'indice di mortalità a 24 ore non era significativamente più basso nelle linee R e Canton S precondizionate dell'Oregon. Durante il montaggio le tacche nelle siringhe modificate devono allinearsi con i fori delle porte del vaporizzatore.
Durante l'esposizione, controllare periodicamente che vi sia flusso attraverso il sistema. Questa procedura può essere seguita per un'ampia varietà di studi comportamentali, di sopravvivenza e molecolari che potrebbero portare a approfondimenti sulla farmacologia degli agenti volatili.
Panoramica
L'array di anestesia seriale (SAA) è uno strumento innovativo progettato per l'elaborazione ad alto rendimento di Drosophila melanogaster allo scopo di studiare la farmacologia degli anestetici generali volatili (VGAs). Questo metodo consente ai ricercatori di esplorare sia gli effetti tossici che protettivi dei VGAs sui moscerini della frutta, sfruttandone la diversità genetica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Farmacologia
- Tossicologia
Sfondo
- Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca biologica.
- Le VGA hanno diversi effetti collaterali che sono influenzati dalla genetica.
- La SAA consente l'esposizione simultanea di più campioni alle VGA.
- Comprendere gli effetti delle VGA può fornire informazioni sulle loro implicazioni terapeutiche e tossicologiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'analisi ad alto rendimento delle VGA nei moscerini della frutta.
- Esplorare la base genetica delle risposte alle VGA.
- Valutare sia gli effetti tossici che protettivi delle VGA su Drosophila.
Metodi Utilizzati
- Costruzione del SAA utilizzando tappi modificati di provette da 50 millilitri e pipette sierologiche.
- Allestimento di un sistema di flusso gassoso per somministrare gli anestetici gassosi volatili ai campioni di moscerini.
- Esposizione di Drosophila agli anestetici gassosi volatili in condizioni controllate.
- Monitoraggio della mortalità e delle risposte comportamentali dei moscerini dopo l'esposizione.
Risultati principali
- È stata osservata una variazione nella mortalità indotta dalla tossicità dell'isoflurano tra diverse linee di moscerini.
- Il precondizionamento con isoflurano ha ridotto la mortalità in determinati ceppi.
- Il metodo SAA consente un testaggio efficiente e riproducibile degli agenti volatili generali (VGAs).
- Le informazioni ottenute potrebbero portare a una migliore comprensione della farmacologia degli agenti volatili.
Conclusioni
- Il SAA è uno strumento efficace per lo studio degli effetti degli VGAs in Drosophila.
- I fattori genetici svolgono un ruolo significativo nella risposta agli VGAs.
- Questa ricerca potrebbe avere implicazioni per la comprensione degli effetti degli VGAs in contesti biologici più ampi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'Array di Anestesia Seriale (SAA) consente un'indagine ad alto rendimento e quantitativa degli anestetici generali volatili (VGAs) in Drosophila, supportando una rapida riduzione del rischio farmacogenetico e meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. Permettendo l'esposizione simultanea e controllata di multipli genotipi o variabili biologiche, l'SAA aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi terapeutici e nel triage del portafoglio per i percorsi di neurofarmacologia e tossicologia. Questa piattaforma soddisfa la necessità di sistemi scalabili e riproducibili per analizzare i determinanti genetici e ambientali della risposta ai farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi sistematica dei determinanti genetici che influenzano la risposta VGA in un sistema in vivo controllato.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica chiarificando le interazioni farmacodinamiche e farmacogenetiche in diversi modelli di drosophila.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio mediante esposizione e misurazione degli esiti riproducibili e parallelizzati.
- Migliora l'affidabilità predittiva per lo sviluppo di programmi di composti neuroattivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi biologici validati e scalabili per lo screening di composti e studi meccanicistici successivi.
- Standardizza le condizioni di esposizione e gli output quantitativi tra diversi gruppi e genotipi.
- Permette una valutazione riproducibile e ad alto rendimento di parametri comportamentali, di sopravvivenza e molecolari.
- Supporta la prontezza del saggio per la valutazione dell'efficacia e della tossicità di composti in modelli geneticamente modificabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i sistemi di modelli preclinici a variabili genetiche e ambientali rilevanti per la malattia.
- Garantisce continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica di ipotesi neurofarmacologiche.
- Permette decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, basate su dati comparativi solidi tra diversi genotipi e condizioni.
- Supporta l'esplorazione di biomarcatori traslazionali nei modelli di neuroinfiammazione e lesione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il SAA si integra nel percorso della scoperta, che va dalla verifica iniziale delle ipotesi e dalla validazione del bersaglio fino all'identificazione del composto attivo e allo sviluppo di modelli preclinici.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi sugli effetti del VGA e sui modificatori genetici in un sistema in vivo scalabile.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per il confronto tra coorti e la valutazione di composti.
- Analisi: Permette l'analisi statistica di parametri di mortalità, comportamentali e molecolari per supportare il processo decisionale.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica modellando variabili genetiche e da lesione rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e riutilizzabile, adattabile a diversi studi farmacologici e genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nello sviluppo di composti neuroattivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la capacità analitica per studi farmacogenetici e tossicologici.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza del capitale consentendo la generazione di dati robusti e comparativi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di asset in neurofarmacologia con un adeguamento al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in genetica di Drosophila, saggi comportamentali e farmacologia.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per vaporizzatore, controllo del flusso gassoso e infrastrutture analitiche per letture quantitative.
- Esige una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di esposizione e dei flussi operativi di analisi dati.
- Adattabile a diversi genotipi, variabili biologiche e punti finali sperimentali.
- I limiti pratici includono la scalabilità ad altri organismi modello e la traducibilità nei sistemi mammiferi.
