Name: Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri come formulare nanodischi per incorporare molecole bioattive idrofobiche e migliorare la solubilità acquosa di composti insolubili. Questo metodo semplice consente applicazioni avanzate nel drug delivery.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R37 HL-64159).

1. Trasformazione, espressione e purificazione della componente proteica dello scaffold
<ol><li>Trasformazione batterica BL21 con plasmide contenente apoE4-NT<ol><li>Scongelare un tubo di cellule competenti BL21 (DE3) sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
		<li>Una volta che tutto il ghiaccio si è sciolto, mescolare delicatamente e accuratamente pipettare 50 μL delle cellule in un tubo di trasformazione su ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 5 μL contenenti 50 ng di DNA plasmidico (per la sequenza, vedere Tabella supplementare 1) alla miscela cellulare. Passare con attenzione il tubo quattro o cinque volte per mescolare. Non vortice.</li>
		<li>Mettere il composto sul ghiaccio per 30 minuti.</li>
		<li>Shock termico della miscela esattamente a 42 °C per 10 s.</li>
		<li>Mettere in ghiaccio per 5 min.</li>
		<li>Pipettare 950 μL di mezzo S.O.C. nel tubo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Posizionare il tubo in un incubatore di agitazione a 37 °C per 60 minuti con oscillazione impostata a 250 giri/min.</li>
		<li>Mescolare accuratamente le cellule sfogliando e capovolgendo, quindi distribuire 100 μL di soluzione cellulare su una piastra di selezione Luria Brodo + Agar da 20 mL trattata con ampicillina ad una concentrazione di 0,1 mg/ml.</li>
		<li>Incubare durante la notte a 37 °C, o fino a quando le colonie visibili sono cresciute.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando un pipettatore elettronico, trasferire 25 mL di terreno sterile NZCYM in un matraccio conico sterile da 250 mL a temperatura ambiente e aggiungere ampicillina ad una concentrazione di lavoro finale di 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, trasferire una singola colonia dalla piastra di selezione contenente il ceppo batterico opportunamente trasformato e aggiungere direttamente al matraccio contenente 25 ml di NZCYM media + ampicillina.</li>
	<li>Introdurre i 25 mL di sementi di coltura NZCYM in un incubatore di agitazione a 37 °C con oscillazione orbitale impostata a 250 giri/min. NOTA: Si raccomanda di coltivare questa coltura di semi durante la notte per raggiungere una concentrazione batterica adeguata (~ 1,5-2,0 unità di densità ottica), misurata utilizzando uno spettrofotometro impostato su lunghezza d'onda = 600 nm.</li>
	<li>Trasferire 250 mL di terreno sterile NZCYM in quattro palloni sconcertati da 1 L e aggiungere l'antibiotico ampicillina ad una concentrazione operativa di 0,1 mg/ml.</li>
	<li>In condizioni sterili, trasferire 5 mL di coltura di semi saturi in ciascuno dei quattro palloni contenenti colture da 250 mL e porli in un incubatore agitatore a 37 °C con oscillazione orbitale impostata a 250 giri/min. NOTA: A questo punto, la coltura verrà indicata come coltura di espansione e la crescita esponenziale verrà monitorata utilizzando uno spettrofotometro UV1800. La crescita può procedere fino a quando la densità ottica della coltura a 600 nm (OD600) raggiunge un valore compreso tra 0,6-0,8.</li>
	<li>Una volta che la coltura di espansione ha raggiunto il valore desiderato di OD600 di 0,6-0,8, aggiungere 59,6 mg di isopropile β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a ciascuna coltura contenente 250 ml di matraccio per una concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione proteica. A questo punto, la cultura dell'espansione viene definita cultura dell'espressione. Iniziare l'espressione per un periodo di 5 ore.</li>
	<li>Al termine del periodo di espressione di 5 ore, prelevare i quattro palloni dall'incubatrice agitatrice e pipettare 125 ml in sei flaconi di centrifuga da 250 ml (750 ml totali).</li>
	<li>Bilanciare ogni flacone della centrifuga per assicurarsi che la massa totale sia entro ±0,5 mg l'uno dall'altro. NOTA: questo passaggio è essenziale per garantire un funzionamento sicuro del dispositivo centrifugo.</li>
	<li>Preparare il dispositivo centrifugo ruotando prima l'interruttore di alimentazione in posizione accesa. Fare clic sul pulsante "Set/Actual" e regolare i parametri su "JA-14", "9.400 x g", 20,00 min e 4 °C utilizzando i quadranti corrispondenti.</li>
	<li>Caricare i sei flaconi bilanciati della centrifuga in un rotore di centrifuga di dimensioni appropriate e inserirli nella centrifuga assicurandosi che vengano rispettati tutti i parametri di sicurezza specifici. NOTA: Continuare questo passaggio fino a quando tutte le colture cellulari batteriche sono state centrifugate e i surnatanti raccolti.</li>
	<li>Filtrare il surnatante batterico isolato attraverso una filtrazione sottovuoto o un apparecchio equivalente dotato di un filtro da 0,45 micron per rimuovere eventuali residui residui.</li>
	<li>Purificazione dell'eparina della proteina scaffold apoE4-NT ricombinante NOTA: La procedura di purificazione della colonna viene condotta a temperatura ambiente.<ol><li>Equilibrare la colonna Hi-trap Eparina applicando 10 volumi di colonna (50 ml) di tampone fosfato di sodio 10 mM, pH 7,2, ed eluendo ad una velocità di 5 mL/min.</li>
		<li>Applicare il mezzo arricchito apoE4-NT alla colonna ad una velocità di 2,5 ml/min fino a quando non è stato applicato l'intero volume di 1 L del fluido ed eliminare il flusso continuo.</li>
		<li>Lavare la colonna con 10 volumi di colonna (50 ml) di tampone fosfato di sodio da 10 mM, pH 7,2, ed eliminare il flusso passante.</li>
		<li>Eluire la proteina apoE4-NT desiderata applicando tre volumi di colonna (15 mL) di tampone di eluizione (10 mM tampone fosfato di sodio + 1,5 M NaCl, pH 7,2) alla colonna e raccogliere l'eluato.</li>
	</ol></li>
	<li>Dialisi dell'eluato apoE4-NT<ol><li>Preparare una sezione di tubi per dialisi (le dimensioni del tubo di dialisi utilizzato erano 22 cm di lunghezza, 12 mm di diametro interno e 10.000 MWCO) immergendo accuratamente in acqua distillata deionizzata (ddi) per 10 minuti.</li>
		<li>Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) (10 mM fosfato di sodio + 150 mM NaCl, pH 7,2) in un becher di plastica da 1 L o equivalente.</li>
		<li>Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che il morsetto sia fissato e che nessun liquido possa fuoriuscire.</li>
		<li>Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e versare i 15 ml di eluato apoE4-NT nel tubo di dialisi. NOTA: è imperativo verificare la presenza di eventuali perdite in questa fase.</li>
		<li>Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.</li>
		<li>Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente 1 L di tampone PBS.</li>
		<li>Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione su "basso", assicurandosi che non si formi un vortice.</li>
		<li>Al termine della dialisi, decantare il retentato in un tubo conico da 50 mL e conservare a -20 °C. NOTA: Si raccomanda di eseguire questa dialisi a 4 °C durante la notte.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Formulazione di un agente bioattivo contenente nanofloppy
<ol><li>Preparazione di aliquote fosfolipidiche<ol><li>Pesare 5 mg di un fosfolipide appropriato (ad esempio, dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC]) e trasferire in una provetta di vetro.</li>
		<li>Sciogliere i 5 mg di fosfolipidi aggiungendo 300 μL di CHCl 3 e 100 μL di CH 3 OH per un rapporto totale di3:1 v/v.</li>
		<li>Evaporare il solvente organico ponendo la provetta di vetro sotto un flusso delicato di gas N2 per 10-15 minuti, in modo tale che un sottile film di fosfolipidi essiccati si formi lungo le pareti della porzione inferiore della provetta.</li>
	</ol></li>
	<li>Liofilizzazione delle aliquote fosfolipidiche<ol><li>Preparare aliquote fosfolipidiche per la liofilizzazione coprendo l'apertura della provetta di vetro con parafilm.</li>
		<li>Forare il parafilm con un ago da 24 G circa 10-15 volte.</li>
		<li>Collocare le aliquote perforate in un contenitore di liofilizzazione appropriato e assicurarsi che il coperchio di gomma sia sigillato correttamente.</li>
		<li>Collegare il contenitore di liofilizzazione al collettore a vuoto situato nella parte superiore della macchina di liofilizzazione e assicurarsi che tutte le altre valvole siano chiuse ermeticamente.</li>
		<li>Accendere la macchina di liofilizzazione ruotando l'interruttore di alimentazione e premendo il pulsante di inizializzazione del vuoto.</li>
		<li>Dopo che il sistema ha raggiunto il vuoto totale, fare clic sul pulsante di inizializzazione della refrigerazione per iniziare il processo di liofilizzazione. NOTA: Si raccomanda di consentire ai campioni di liofilizzarsi durante la notte.</li>
	</ol></li>
	<li>Formulazione di nanodischi di amfotericina-B (amp-B)<ol><li>Pipettare 0,45 mL di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per ~30 s per disperdere il lipide. NOTA: il campione risultante apparirà opaco e torbido.</li>
		<li>Pipettare 50 μL di una soluzione madre di ampB da 20 mg/mL (20 mg di ampB disciolti in 1 mL di dimetilsolfossido [DMSO], conservati a -20 °C in un recipiente ambrato chiuso) nel campione fosfolipidico disperso e nel vortice. NOTA: Quando si seleziona un solvente da utilizzare nella preparazione di una soluzione madre dell'agente bioattivo idrofobo, le due considerazioni generali sono 1) la solubilità dell'agente bioattivo e 2) la miscibilità del solvente con il tampone acquoso utilizzato nella formulazione. Mentre DMSO è spesso usato 15,16,17,18,19, dimetilformammide 20,21 o tetraidrofurano 22 sono stati impiegati con successo anche 23.</li>
		<li>Pipettare 0,5 mL di proteina scaffold apoE4-NT (concentrazione di ~4 mg/ml) nella provetta di vetro contenente il fosfolipide disperso e ampB. Il volume finale del campione deve essere di circa 1 ml.</li>
		<li>Bagno sonicare il campione a 24 °C fino a quando la soluzione non chiarisce (generalmente 10-15 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugazione a nanodischi<ol><li>Trasferire la soluzione chiarificata di ampB-nanodisk in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 ml.</li>
		<li>Posizionare il tubo in un rotore di microcentrifuga da tavolo con l'aggiunta di un tubo di bilanciamento posto direttamente di fronte.</li>
		<li>Stringere il tappo del rotore e chiudere il coperchio della centrifuga.</li>
		<li>Programmare la centrifuga per girare per 10 minuti a ~11.000 x g utilizzando i quadranti corrispondenti situati sulla parte anteriore dell'unità micro-centrifuga. NOTA: A questo punto, potrebbe essere visibile un pellet. Questo pellet è costituito da fosfolipidi non incorporati e/o ampB.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta da microcentrifuga pulita da 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Dialisi del campione di ampB-nanodisk<ol><li>Preparare una sezione di tubi per dialisi (le dimensioni del tubo di dialisi utilizzati erano di 3 cm di lunghezza, 16 mm di diametro interno e 10.000 MWCO) immergendo accuratamente in acqua ddi per 10 minuti.</li>
		<li>Preparare una soluzione tampone PBS da 1 L (10 mM di fosfato di sodio + 150 mM di NaCl, pH 7,2) in un becher di plastica da 1 L o equivalente.</li>
		<li>Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che il morsetto sia fissato e che nessun liquido possa fuoriuscire.</li>
		<li>Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e trasferire il campione di ampB-nanodisk nel tubo di dialisi.</li>
		<li>Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.</li>
		<li>Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente 1 L di tampone PBS.</li>
		<li>Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione su "basso", assicurandosi che non si formi un vortice. Lasciare proseguire la dialisi per tutta la notte a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi spettrale di campioni di ampB-nanodisk
<ol><li>Inizializzazione dello spettrofotometro seguita da spegnimento automatico<ol><li>Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione e collegarlo a un computer di supporto corrispondente premendo il pulsante "PC Control".</li>
		<li>Sul computer di supporto, aprire il software etichettato "UVProbe 2.61" e connettersi allo spettrofotometro facendo clic sul pulsante "Connetti" nell'angolo in basso a sinistra.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Spectrum sulla barra degli strumenti in alto all'interno del software UVProbe.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante con l'etichetta Metodo sulla barra degli strumenti in alto.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Misurazione e immettere "500" nella casella di testo Start situata in "Intervallo di lunghezza d'onda (nm)" e "300" nella casella di testo "Fine".</li>
		<li>Fare clic sul menu a discesa accanto alla scheda denominata Velocità di scansione e impostarla su Media.</li>
		<li>Preparare un campione in bianco trasferendo 1 ml di DMSO in due cuvette di quarzo (QS 1.000).</li>
		<li>Caricare entrambe le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro, fare clic su Autoblank e registrare uno spettro compreso tra 300 e 500 nm facendo clic su Start nell'angolo in basso a sinistra.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione e analisi spettrale dello standard ampB<ol><li>Preparare 20 μg/mL ampB standard rimuovendo la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungendo 20 μL di una soluzione madre da 1 mg/mL di ampB (20 μg di ampB totale).</li>
		<li>Caricare nuovamente la cuvetta nella porta del campione dello spettrofotometro e fare clic su Start per registrare l'assorbanza del campione.</li>
		<li>Rimuovere la cuvetta dalla porta del campione e decantare il contenuto del liquido in un contenitore dei rifiuti opportunamente etichettato.</li>
		<li>Risciacquare accuratamente la cuvetta con tre lavaggi di acqua deionizzata seguiti da tre lavaggi con etanolo al 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione e analisi spettrale di campioni di ampB-nanodisk interrotti<ol><li>Preparare un campione di ampB-nanodisk interrotto (contenente 20 μg/mL come ampB) pipettando 20 μL di uno stock di nanodisk ampB da 1 mg/mL in 1 mL di DMSO. Incubare per almeno 1 minuto prima di registrare lo spettro.</li>
		<li>Caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione dello spettrofotometro e fare clic su Start per registrare l'assorbanza del campione.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione e analisi spettrale di un buffer PBS blank<ol><li>Preparare un buffer PBS bianco trasferendo 1 mL di tampone PBS in due cuvette al quarzo (QS 1.000).</li>
		<li>Caricare le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro, fare clic su Autoblank e registrare lo spettro da 300-500 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione e analisi spettrale di un campione di ampB-nanodisk non interrotto<ol><li>Preparare un campione di ampB-nanodisk non interrotto (contenente 20 μg/mL come ampB) rimuovendo la cuvetta dalla porta anteriore del campione e introducendo 20 μL di un campione di ampB-nanodisk da 1 mg/mL nel buffer PBS.</li>
		<li>Caricare nuovamente la cuvetta nella porta campione dello spettrofotometro, fare clic su Start e registrare lo spettro del campione. NOTA: Tutti i rifiuti chimici devono essere smaltiti in un contenitore per rifiuti opportunamente etichettato seguendo le linee guida accettate.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi del saggio di vitalità del lievito
NOTA: Sono stati eseguiti saggi di vitalità del lievito al fine di valutare l'attività biologica di ampB e determinare se il processo di formulazione o incorporazione in nanodisk, ha influenzato la sua attività di inibizione della crescita del lievito.
<ol><li>Formulare due campioni di ampB-nanodisk (volume finale = 1 mL) per contenere 1 mg di ampB per 5 mg di DMPC e 0,1 mg di ampB per 5 mg di DMPC seguendo il metodo precedentemente descritto (2.3-2.4.1). NOTA: Per preparare un ampB da 1 mg/mL e 0,1 mg/mL per 5 mg di DMPC, pipettare rispettivamente 50 μL e 5 μL di un ampB da 20 mg/mL in DMSO in ciascun flaconcino del campione.</li>
	<li>Preparazione di una coltura di lievito saturo<ol><li>Trasferire 25 ml di terreno sterile di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD) in un tubo conico sterile da 50 ml.</li>
		<li>Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per trasferire una singola colonia di Saccharomyces cerevisiae (BY4741) nei 25 mL di terreno YPD.</li>
		<li>Coltivare il lievito in un incubatore agitatore impostato a 30 °C, con oscillazione impostata a 200 giri / min per 18 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di campioni di test individuali di inibizione della crescita<ol><li>Trasferire 5 ml di terreno YPD sterile in 30 provette sterili da 13 mL.</li>
		<li>Trattare tre serie di provette di coltura aggiungendo 20, 10 e 5 μL del campione di ampB-nanodisk da 1 mg/mL, che rappresentano rispettivamente 20, 10 e 5 μg di ampB.</li>
		<li>Trattare tre serie di provette di coltura aggiungendo 20, 10 e 5 μl del campione di 0,1 mg/mL ampB-nanodisk, che rappresentano rispettivamente 2, 1 e 0,5 μg di ampB.</li>
		<li>Trattare quattro serie di provette di coltura aggiungendo 20 μL di PBS, DMSO, rHDL di controllo (senza ampB) o 20 μg di ampB in DMSO. NOTA: ogni set di provette di coltura rappresenta una replica indipendente. Pertanto, seguendo questo metodo si ottiene un valore n complessivo di n = 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Inizializzazione del saggio di vitalità del lievito<ol><li>Avviare l'esperimento inoculando ogni campione con 100 μL (2% vol/vol) di coltura di lievito saturo</li>
		<li>Coltivare il lievito utilizzando un incubatore agitatore impostato a 30 °C, con oscillazione impostata a 200 rpm per un massimo di 18 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazioni della vitalità del lievito<ol><li>Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione, quindi fare clic sul pulsante Go To WL e impostare il valore su 600 nm.</li>
		<li>Trasferire 1 mL di terreno YPD sterile in due cuvette di plastica, caricare nelle rispettive porte campione sullo spettrofotometro e fare clic su Autoblank.</li>
		<li>Trasferire 1 mL di ciascun campione in una cuvetta di plastica, assicurandosi di cambiare le cuvette ogni volta e caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione dello spettrofotometro.</li>
		<li>Misurare e registrare la densità ottica di ciascun campione a 600 nm e smaltire ogni cuvetta consumata in un contenitore per rifiuti a rischio biologico correttamente etichettato.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li>
<li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li>
<li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks%3A+Implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).</li>
<li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).</li>
<li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La formulazione di un agente bioattivo contenente nanodischi fornisce un metodo conveniente per solubilizzare composti idrofobici altrimenti insolubili. Poiché i nanodischi dell'agente bioattivo prodotto sono completamente solubili in mezzi acquosi, forniscono un utile metodo di rilascio per un'ampia gamma di molecole idrofobiche (Tabella 1). Questi includono piccole molecole, droghe naturali e sintetiche, fitonutrienti, ormoni, ecc. La strategia di formulazione segue solitamente un protocollo standard c...

Le lipoproteine discoidali nascenti ad alta densità (HDL) sono progenitori naturali delle HDL sferiche molto più abbondanti presenti nel sistema circolatorio umano. Queste particelle nascenti, note anche come pre-ß HDL, possiedono proprietà strutturali uniche e distintive1. Infatti, piuttosto che esistere come particella sferoidale, le HDL nascenti sono a forma di disco. Studi approfonditi di caratterizzazione strutturale su HDL discoidali naturali e ricostituite hanno rivelato che sono costituiti da un doppio strato fosfolipidico il cui perimetro è circoscritto da un'apolipoproteina anfipatica scambiabile (apo), come l'apoA-I. Nel metabolismo delle lipoproteine umane, le HDL nascenti circolanti accumulano lipidi dalle cellule periferiche e maturano in HDL sferiche in un processo che dipende da mediatori proteici chiave, tra cui il trasportatore di cassette leganti ATP A1 e lecitina: colesterolo aciltransfere2. Questo processo rappresenta una componente critica della via di trasporto inversa del colesterolo che è considerata protettiva contro le malattie cardiache. Armati di questa conoscenza e della capacità di ricostituire HDL discoidali, i ricercatori hanno impiegato queste particelle come intervento terapeutico per trattare l'aterosclerosi3. In sostanza, l'infusione di HDL ricostituito (rHDL) nei pazienti promuove l'efflusso di colesterolo dai depositi di placca e lo restituisce al fegato per la conversione in acidi biliari e l'escrezione dal corpo. Diverse aziende biotecnologiche/farmaceutiche stanno perseguendo questa strategia di trattamento4.
Allo stesso tempo, la capacità di generare queste particelle in laboratorio ha scatenato una raffica di attività di ricerca che hanno portato a nuove applicazioni e nuove tecnologie. Un'applicazione importante riguarda l'uso di particelle rHDL come membrana in miniatura per ospitare proteine transmembrana in un ambiente nativo5. Ad oggi, centinaia di proteine sono state incorporate con successo nella rHDL discoidale e la ricerca ha dimostrato che queste proteine mantengono sia la conformazione nativa che l'attività biologica come recettori, enzimi, trasportatori, ecc. Queste particelle, denominate "nanodischi", hanno anche dimostrato di essere suscettibili di caratterizzazione strutturale, spesso ad alta risoluzione6. Questo approccio allo studio delle proteine transmembrana è riconosciuto come superiore agli studi con micelle detergenti o liposomi e, di conseguenza, sta rapidamente avanzando. È importante riconoscere che sono stati descritti due metodi distinti che sono in grado di formare un rHDL. Il metodo "dialisi colata"13 è popolare per applicazioni relative all'incorporazione di proteine transmembrana nelbistrato 5 rHDL. Essenzialmente, questo metodo di formulazione prevede la miscelazione di un fosfolipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e la proteina transmembrana di interesse in un tampone contenente il detergente colato di sodio (o desossicolato di sodio; peso molecolare della micella [MW] di 4.200 Da). Il detergente solubilizza efficacemente i diversi componenti della reazione, consentendo di dializzare il campione contro tampone privo di detergente. Durante la fase di dialisi, quando il detergente viene rimosso dal campione, si forma spontaneamente un rHDL. Quando questo approccio viene utilizzato per intrappolare una proteina transmembrana di interesse, le particelle prodotto sono state definite nanodischi5. I tentativi di utilizzare questo metodo per incorporare agenti bioattivi idrofobici a piccole molecole (MW <1.000 Da), tuttavia, sono stati in gran parte infruttuosi. A differenza delle proteine transmembrana, gli agenti bioattivi a piccole molecole sono in grado di fuoriuscire dalla sacca di dialisi insieme al detergente, diminuendo notevolmente la loro efficienza di incorporazione nelle rHDL. Questo problema è stato risolto omettendo i detergenti dalla miscela di formulazione14. Invece, i componenti vengono aggiunti a un tampone acquoso in sequenza, iniziando con il lipide che forma il doppio strato, formando un agente bioattivo stabile contenente rHDL, indicato come nanodisk. Altri hanno utilizzato rHDL per l'incorporazione e il trasporto di agenti di imaging in vivo 7. Più recentemente, rHDL specializzato composto da un'impalcatura di apolipoproteina e il glicerofosfolipide anionico, cardiolipina, sono stati impiegati in studi di legame del ligando. Queste particelle forniscono una piattaforma per studi sull'interazione della cardiolipina con vari ligandi solubili in acqua, tra cui calcio, citocromo c e l'agente antitumorale doxorubicina8.
Il focus del presente studio è sulla formulazione di rHDL che possiedono un agente bioattivo idrofobico stabilmente incorporato (cioè nanodisk). La capacità di questi agenti di integrarsi nell'ambiente lipidico delle particelle rHDL discoidali conferisce loro efficacemente la solubilità acquosa. In quanto tali, i nanodischi hanno il potenziale per applicazioni terapeutiche in vivo . Quando si formulano i nanodisk, sono necessarie specifiche condizioni di incubazione / reazione per incorporare con successo agenti bioattivi idrofobici discreti nella particella del prodotto e l'obiettivo di questo rapporto è fornire informazioni pratiche dettagliate che possono essere utilizzate come modello fondamentale per la creazione di nuove particelle di nanodisk per applicazioni specifiche. Pertanto, nel contesto di questo manoscritto i termini nanodisco e nanodisco non sono intercambiabili. Mentre nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per contenere una proteina transmembrana incorporata nel suo doppio strato lipidico5, il termine nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per incorporare agenti bioattivi idrofobici a basso peso molecolare (< 1.000 Da), come l'amfotericina B14.
Sono disponibili vari metodi per l'acquisizione di proteine di scaffold adatte. È possibile acquistare proteine di scaffold da produttori [ad esempio apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], tuttavia, il costo può essere un fattore limitante. Un approccio preferito è quello di esprimere le proteine dello scaffold ricombinante in Escherichia coli. I protocolli sono pubblicati per l'apoA-I9, l'apoE410 umano e la proteina emolinfatica degli insetti apolipophorin-III11. Ai fini degli esperimenti qui descritti, è stato utilizzato il dominio ricombinante umano apoE4 N-terminale (NT) (amminoacidi 1-183). La sequenza nucleotidica che codifica per l'apoE4-NT umano è stata sintetizzata e inserita in un vettore di espressione pET-22b (+) direttamente adiacente alla sequenza leader pelB codificata da vettori. Questo costrutto porta all'espressione di una proteina di fusione pelB leader sequence-apoE4-NT. Dopo la sintesi proteica, la sequenza leader pelB batterica dirige la proteina appena sintetizzata nello spazio periplasmatico dove la peptidasi leader fende la sequenza pelB. La proteina apoE4-NT risultante, senza tag di sequenza o code, successivamente sfugge ai batteri e si accumula nel terreno di coltura11,12, semplificando l'elaborazione a valle.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11636</td><td>ND Formulazione & Preparazione standard</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP17925</td><td>Trasformazione & Espansione</td></tr><tr><td>ApoE4-NT Plasmide GenScript</td><td></td><td>N/A</td><td>Trasformazione</td></tr><tr><td>Baffled Flask</td> New <td>Brunswick Scientific</td><td>N/A</td><td>Espansione & Espressione</td></tr><tr><td>BL21 competente E coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Trasformazione</td></tr><tr><td>Flaconi per centrifuga</td><td>Nalgene</td><td>3140-0250</td><td>Espressione</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>G607-4</td><td>Formulazione ND DMSO</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>Standard Prepartation</td></tr><tr><td>Dimiristoilfosfatidilcolina</td><td>Avanti Lipids</td><td>850345P</td><td>Formulazione ND</td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer</td><td>Bellco Biotechnology</td><td>N/A</td><td>Espansione & Expression</td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>Sarstedt Ag & Co</td><td>D51588</td><td>Test di vitalità del lievito</td></tr><tr><td>Provette in borosilicato di vetro</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td>Formulazione ND</td></tr><tr><td>GraphPad (Software)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>Saggio di vitalità del lievito</td></tr><tr><td>Bagno di sonicazione riscaldato</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>ND Formulaton</td></tr><tr><td>Modulo di riscaldamento e azoto</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18822</td><td>ND Formulazione</td></tr><tr><td>HiTrap Eparina HP (5 mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0407-03</td><td>Purificazione</td></tr><tr><td>Isopropilico &beta;-D-1-tiogalattopiranoside&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>Espressione</td></tr><tr><td>J-25 Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>J325-IM-2</td><td>Espressione</td></tr><tr><td>JA-14 Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>339247 Espressione</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>7755030</td><td>Formulazione ND</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Formulazione ND</td></tr><tr><td>Azoto gassoso</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>ND Formulazione</td></tr><tr><td>NZCYM media</td><td>RPI Research Products</td><td>N7200-1000.0</td><td>Espansione & Espressione</td></tr><tr><td>Pet-22B vettore</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>Trasformazione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875718</td><td>Trasformazione & Cuvette di quarzo di espansione</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Brand</td><td>14385 928A</td><td>Analisi spettrale</td></tr><tr><td>agitazione incubatore</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1344-0004</td><td>Trasformazione, espansione & Expression</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Boe</td><td>Thermo Scientific</td><td>66430</td><td>Purificazione</td></tr><tr><td>SnakeSkin Tubi per dialisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Purificazione SnakeSkin Tubi per dialisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>88243</td><td>Purificazione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>Purificazione</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Purificazione</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500</td><td>Spettro di purificazione</td></tr> / <tr><td>POR Chiusure ponderate</td><td>Spettro Medical Industries</td><td>132736</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td> di purificazione <td>Shimadzu UV-1800</td><td>220-92961-01</td><td>Centrifuga</td></tr> da <tr><td>tavolo</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Formulazione ND</td></tr><tr><td>UVProbe 2.61 (Software)</td><td>Shimadzu</td><td>N/A</td><td>Analisi spettrale</td></tr><tr><td>Filtro sottovuoto</td><td>Millipore</td><td>9004-70-0</td><td>Espressione & Pompa per vuoto di purificazione</td></tr><tr><td></td><td>GAST Manufacturing Inc</td><td>DOA-P704-AA</td><td>Espressione & Vortice di purificazione</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>ND Formulazione</td></tr><tr><td>Lievito</td><td>N/A</td><td>BY4741</td><td>Saggio di vitalità del lievito</td></tr><tr><td>Estratto di lievito-peptone-destrosio</td><td>BD</td><td>242820</td><td>Saggio di vitalità del lievito</td></tr></tbody></table>

formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Il termine nanodisco si riferisce a un tipo discreto di nanoparticella composto da un lipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e un agente bioattivo integrato. I nanodischi sono organizzati come un doppio strato lipidico a forma di disco il cui perimetro è circoscritto dalla proteina dell'impalcatura, di solito un membro della famiglia delle apolipoproteine scambiabili. Numerosi agenti bioattivi idrofobici sono stati solubilizzati in modo efficiente in nanodischi mediante la loro integrazione nell'ambiente idrofobico del doppio strato lipidico della particella, producendo una popolazione ampiamente omogenea di particelle nell'intervallo di 10-20 nm di diametro. La formulazione di nanodischi richiede un rapporto preciso dei singoli componenti, un'aggiunta sequenziale appropriata di ciascun componente, seguita dalla sonicazione a bagno della miscela di formulazione. La proteina dello scaffold anfipatico contatta spontaneamente e riorganizza il doppio strato disperso formando una miscela di agenti lipidici / bioattivi per formare una popolazione discreta e omogenea di particelle di nanodischi. Durante questo processo, la miscela di reazione passa da un aspetto opaco e torbido a un campione chiarificato che, quando completamente ottimizzato, non produce precipitato dopo la centrifugazione. Gli studi di caratterizzazione riguardano la determinazione dell'efficienza di solubilizzazione dell'agente bioattivo, la microscopia elettronica, la cromatografia a filtrazione su gel, la spettroscopia di assorbanza ultravioletta visibile (UV/Vis) e/o la spettroscopia di fluorescenza. Questo è normalmente seguito da un'indagine sull'attività biologica utilizzando cellule o topi in coltura. Nel caso di nanodischi che ospitano un antibiotico (cioè l'antibiotico macrolide poliene amfotericina B), è possibile misurare la loro capacità di inibire la crescita di lieviti o funghi in funzione della concentrazione o del tempo. La relativa facilità di formulazione, la versatilità rispetto ai componenti, la dimensione delle particelle su scala nanometrica, la stabilità intrinseca e la solubilità acquosa consentono una miriade di applicazioni in vitro e in vivo della tecnologia dei nanodischi. Nel presente articolo, descriviamo una metodologia generale per formulare e caratterizzare i nanodischi contenenti amfotericina B come agente bioattivo idrofobo.

Processo di formulazione di nanodischi di agenti bioattivi Nella procedura di formulazione ampB-nanodisk descritta, la reazione è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro (Figura 1). Questo cambiamento indica che si sono formati nanofloppy e che l'agente bioattivo è stato solubilizzato. Spesso, gli agenti bioattivi assorbono la luce nella regione della lunghezza d'onda visibile (ad esempio, ampB, curcumina, luteina, coenzima Q10</s...

Qui, descriviamo la produzione e la caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodisk. I nanodischi di amfotericina B sono presi come esempio per descrivere il protocollo in modo graduale.

Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Questo protocollo fornisce conoscenze pratiche, utili per formulare particelle su scala nanometrica, cioè nanodischi, che incorporano stabilmente una vasta gamma di molecole bioattive idrofobiche. Questo metodo ha molte applicazioni pratiche.La capacità di conferire solubilità acquosa a composti bioattivi altrimenti insolubili consente l'uso di nanofloppy in applicazioni di somministrazione di farmaci. Il metodo descritto è semplice. Si preferisce condurre studi alla scala descritta, cinque milligrammi di fosfolipidi, due milligrammi di proteina dell'impalcatura, in modo che la formazione di nanodischi sia prontamente monitorata mediante ispezione visiva.A dimostrare la procedura saranno Michael Karo e Matthew Swackhammer, studenti universitari ricercatori nel laboratorio Ryan. Per preparare un'aliquota fosfolipidica, pesare cinque milligrammi di DMPC e trasferirla in una provetta di vetro. Sciogliere il fosfolipide aggiungendo 300 microlitri di cloroformio e 100 microlitri di metanolo per un rapporto di tre a uno.Evaporare il solvente organico ponendo la provetta di vetro sotto un leggero flusso di azoto gassoso per 10-15 minuti, in modo tale che un sottile film di fosfolipidi essiccati si formi lungo le pareti della parte inferiore della provetta. Per formulare amfotericina B o AmpB-Nanodisks, pipettare 450 microlitri di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per 30 secondi per disperdere il lipide. Pipettare 50 microlitri di soluzione di AmpB da 20 milligrammi per millilitro nel campione di fosfolipidi dispersi e nel vortice.Aggiungere 500 microlitri di quattro milligrammi per millilitro di proteina scaffold ApoE4 NT alla provetta di vetro contenente il fosfolipide disperso e AmpB. Bath sonicare il campione a 24 gradi Celsius fino a quando la soluzione non si chiarisce. Per la dialisi AmpB-Nanodisk, preparare una sezione di tubo di dialisi immergendolo accuratamente in acqua deionizzata distillata per 10 minuti.Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che nessun liquido possa fuoriuscire. Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e trasferire il campione di AmpB-Nanodisk nel tubo di dialisi. Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente tampone PBS da un litro appena preparato. Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione al minimo, assicurandosi di non produrre un vortice. Consentire la dialisi per continuare durante la notte a quattro gradi Celsius.Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione e collegarlo a un computer di supporto corrispondente premendo Controllo PC. Sul computer di supporto, aprire il software etichettato UVProbe 2.61 e connettersi allo spettrofotometro facendo clic su "connetti" nell'angolo in basso a sinistra. Fare clic sullo spettro, quindi fare clic su "metodo" nella barra degli strumenti in alto.Fare clic sulla scheda di misurazione e immettere 500 nella casella di testo iniziale" situata sotto l'intervallo di lunghezze d'onda e 300 nella casella di testo "fine". Fare clic sul menu a discesa accanto alla scheda "velocità di scansione" e impostarlo su medio. Preparare un campione bianco trasferendo un millilitro di DMSO in due cuvette di quarzo.Caricare entrambe le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro. Fare clic su "spazio vuoto automatico" e registrare uno spettro da 300 a 500 nanometri facendo clic su "start" nell'angolo in basso a sinistra. Per l'analisi spettrale standard AmpB, rimuovere la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre AmpB.Caricare nuovamente la cuvetta nella scheda campione e fare clic su "start" per registrare l'assorbanza del campione. Dopo aver registrato l'assorbanza del campione, rimuovere la cuvetta e decantare il contenuto liquido in un contenitore per i rifiuti. Risciacquare accuratamente la cuvetta con tre lavaggi di acqua deionizzata, seguiti da tre lavaggi con etanolo al 70%.Per l'analisi spettrale di AmpB-Nanodisk interrotto, preparare il campione pipettando 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di AmpB-Nanodisk stock in un millilitro di DMSO e incubare per un minuto prima di registrare lo spettro. Caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione e fare clic su "start" per registrare l'assorbanza del campione. Per l'analisi spettrale di un bianco tampone PBS, preparare un bianco trasferendo un millilitro di PBS in due cuvette di quarzo.Caricare le cuvette nella porta del campione. Fare clic su "vuoto automatico" e registrare lo spettro da 300 a 500 nanometri. Per l'analisi spettrale di un campione di AmpB-Nanodisk non interrotto, rimuovere la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di campione di AmpB-Nanodisk nel buffer PBS.Caricare nuovamente la cuvetta nella scheda campione. Fare clic su Start" e registrare lo spettro del campione. La reazione di formulazione AmpB-Nanodisk è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro.Viene mostrata la spettroscopia di assorbimento visibile UV di campioni di AmpB in DMSO e PBS. Nel DMSO sono stati osservati tre distinti massimi di assorbanza a 372, 392 e 415 nanometri, picchi indicativi di AmpB. Gli spettri di assorbanza dei nanodischi AmpB in PBS hanno mostrato un singolo picco di assorbanza maggiore a una lunghezza d'onda più corta.In confronto, gli spettri di assorbanza degli AmpB-Nanodisk nel DMSO apparivano simili agli spettri degli AmpB di serie. L'attività biologica di AmpB-Nanodisks è stata eseguita valutando i saggi di inibizione della crescita del lievito. Campioni di controllo come PBS, DMSO e lipoproteine ad alta densità ricostituite hanno dimostrato che i componenti dei nanodischi diversi dall'AmpB non hanno alcun effetto visibile sulla crescita del lievito.Il controllo positivo ha confermato che AmpB è un inibitore efficiente della crescita del lievito. Nel caso dei nanodischi AmpB, è stata osservata un'attività di inibizione della crescita dipendente dalla concentrazione. Non tutti i preparati di nanodisk sono uguali.Alcuni possono richiedere più tempo, lipidi diversi o diverse proteine dell'impalcatura. Esse sono solo indistinguibili è la chiarificazione del campione di nanodisk. Questa tecnica ha portato a nuove nanoparticelle utilizzate per studiare la cardiotossicità indotta da doxorubicina, l'apoptosi, le interazioni dei ligandi e ha fornito numerose molecole bioattive insolubili acquose, tra cui luteina e curcumina.

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