Fabbricazione di microparticelle polimeriche pulsatili che incapsulano l'antigene della rabbia

Il significato di questo approccio è che potrebbe essere utilizzato per somministrare vaccini a dosi multiple in una singola iniezione, salvando potenzialmente milioni di vite, in particolare nei paesi a basso e medio reddito in cui i neonati non sono immunizzati a causa di problemi di accesso. Questo metodo di fabbricazione consente al vaccino antirabbico di mantenere la sua immunità nativa conferendo forma quando incapsulato in microparticelle il cui rilascio imita gli attuali programmi di vaccinazione con una sola iniezione. La rabbia è una malattia fatale, che richiede fino a cinque iniezioni ripetute di vaccino in alcuni casi per prevenire la morte.

Tuttavia, la somministrazione del regime vaccinale completo in una sola visita può migliorare l'aderenza e salvare vite umane. Questa tecnica rappresenta una piattaforma tecnologica in grado di fornire diverse terapie o profilattiche per varie malattie. Per iniziare, trattare la superficie dello stampo principale stampato in 3D posizionandola in una camera a vuoto contenente un vetrino con 40 microlitri di triclorosilano sulla superficie.

Avviare l'aspirapolvere per un'ora. Mescolare la base di prepolimero PDMS e l'agente polimerizzante con un rapporto di massa di 9:1 in un bicchiere di plastica. Quindi, trasferire la soluzione in un tubo da 50 millilitri e centrifugare 300 G per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, assicurarsi che la soluzione sia limpida. Una volta completato il trattamento superficiale, posizionare lo stampo principale in un piatto di alluminio e versare il PDMS non polimerizzato sullo stampo, assicurandosi che le caratteristiche siano completamente sommerse. Posizionare il piatto di alluminio in una camera a vuoto e tirare il vuoto per un'ora per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Dopo aver rimosso il piatto di alluminio, posizionare distanziatori da 800 micrometri a ciascuna estremità dello stampo principale e sovrapporre un vetrino pulito sullo stampo principale, evitando bolle. Utilizzare clip leganti per bloccare lo stampo sui distanziatori da 800 micron. Polimerizzare il prepolimero nel forno a 120 gradi Celsius per quattro ore.

Una volta indurito, rilasciare con cura le clip leganti. Utilizzare una lametta per separare lo stampo principale dallo stampo PDMS polimerizzato. Per preparare il film PLGA, posizionare 450 milligrammi di PLGA su un foglio polimerico antiaderente all'interno di uno spessore ad anello.

Quindi, sovrapporre un secondo foglio di polimero antiaderente sul PLGA e utilizzare un morsetto a C da 101,6 millimetri per comprimere la pila tra due blocchi di alluminio fino a quando non è a tenuta di dita. Posizionare il gruppo bloccato a C in un forno sottovuoto. Dopo 30 minuti nel forno, stringere il morsetto e rimetterlo per altri 30 minuti.

Quindi, trasferire l'assemblaggio in un essiccatore per quattro ore per raffreddare. Una volta raffreddato, allentare il morsetto, rimuovere il film PLGA dai fogli polimerici antiaderenti e posizionarlo in una capsula di Petri etichettata. Conservare la capsula di Petri all'interno di un essiccatore per un uso successivo.

Per generare particelle PLGA, trattare la superficie dello stampo PDMS come dimostrato in precedenza. Utilizzando una pinzetta o un bisturi, tagliare il film PLGA da 250 micron in modo che abbia approssimativamente le dimensioni dell'array di particelle e posizionarlo sullo stampo PDMS trattato. Sovrapporre un vetrino pulito al microscopio sulla pellicola PLGA sopra lo stampo PDMS e fissarli insieme posizionando un morsetto a molla sull'array e sul film PLGA.

Tenere il gruppo stampo bloccato nel forno sottovuoto per un'ora, quindi raffreddarlo a temperatura ambiente per 15 minuti. Una volta raffreddato, applicare delicatamente la pressione utilizzando una lama di rasoio per separare lo stampo PDMS dall'array di particelle PLGA e conservare le particelle PLGA in un essiccatore per un ulteriore utilizzo. Per riempire le particelle con l'antigene concentrato del vaccino antirabbico, preparare il distributore piezoelettrico e posizionare il vetrino contenente le particelle PLGA nell'area di erogazione.

Caricare l'antigene concentrato sulla piastra, quindi inserire i parametri di impostazione di destinazione e fare clic su Esegui. Il robot piezoelettrico riempirà quindi le particelle. Una volta completato, utilizzare uno stereoscopio per verificare che le particelle siano state riempite.

Per sigillare la particella riempita, posizionare un blocco di acciaio inossidabile su una piastra riscaldante e due vetrini paralleli per microscopio sul blocco di acciaio inossidabile. Dopo aver livellato il blocco di acciaio inossidabile, accendere la piastra riscaldante e impostare la temperatura a 205 gradi Celsius. Una volta raggiunta la temperatura superficiale desiderata dell'acciaio inossidabile, sospendere le particelle PLGA riempite sui due vetrini e avviare immediatamente un timer per 18 secondi.

Dopo aver rimosso l'array di particelle sigillato dalla piastra calda, sospenderlo su due vetrini sul banco da laboratorio e raffreddarlo per un minuto. Per raccogliere le particelle sigillate, tenere la lama del bisturi con un angolo di 45 gradi rispetto al vetrino e applicare pressione alla base delle particelle per separarle dal vetrino. Usando un bisturi, spostare le particelle raccolte in un tubo a basso legame proteico da 0,5 millilitri.

Aggiungere 250 microlitri di PBS contenente albumina sierica bovina e glucosio per mantenere la stabilità del vaccino antirabbico Posizionare il campione sotto lo stereoscopio e schiacciare le particelle usando una punta su un paio di pinzette a punta fine. Durante il riempimento delle particelle, è necessario un tempo di asciugatura sufficiente per l'evaporazione completa del solvente o dell'acqua. Dopo l'essiccazione, un deposito di soluto rimane sul fondo del nucleo di particelle.

La morfologia ideale delle particelle è stata osservata tra i tempi di soffitto di 18 e 24 secondi per questo PLGA, poiché le particelle contenenti carico erano completamente sigillate in quei momenti senza perdere la struttura delle particelle. Le particelle erano abbastanza piccole da entrare facilmente in un ago calibro 19 se adeguatamente imballate e sigillate. Inoltre, 10 particelle fluivano costantemente attraverso un ago di gauge 19 quando le iniettavano in una soluzione viscosa, come il 2% di carbossimetilcellulosa.

La micrografia elettronica a trasmissione indicava varianti intatte della rabbia nel campione di antigene concentrato, e queste erano circa 4,4 volte più concentrate rispetto alla soluzione madre di partenza. Dopo la sigillatura, circa il 69% dell'antigene rimane incapsulato nella sua forma bioattiva, suggerendo che lo stress termico causa una perdita significativa durante la sigillatura, ma la maggior parte dell'antigene virale rimane intatto. Il riempimento di microparticelle è uno dei passaggi più critici.

Se le particelle non vengono riempite correttamente, è improbabile che si sigillino correttamente. Per comprendere la stabilità, sarebbe necessario un ulteriore sviluppo di formulazione, compresi eccipienti e altri materiali biologicamente rilevanti nel nucleo delle particelle.