Name: Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Impara l'instillazione intratracheale non invasiva di lipopolisaccaridi nei topi per studiare l'infiammazione polmonare. Questo metodo riduce il trauma chirurgico e consente una somministrazione accurata di LPS ai polmoni.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (No.: 81903902), dalla China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), dal Sichuan Science and Technology Program (No.: 2020YJ0172) e dallo Xinglin Scholar Research Premotion Project dell'Università di Chengdu TCM (No.: QJRC2022053).

Il protocollo di sperimentazione animale è stato esaminato e approvato dal Comitato di gestione dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (record n. 2021-11). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57/BL (20-25 g, 6-8 settimane di età). I topi sono stati tenuti in una camera per animali ed erano liberi di bere e mangiare durante l'esperimento.
1. Preparazione
<ol><li>Assicurarsi che la piattaforma di intubazione sia composta da una base, un montante, una graffetta, due elastici e alcune corde. Prendi una corda, passa la corda attraverso i due fori nella parte superiore del montante e lega le due estremità della corda, rispettivamente, alle piccole sporgenze nella parte superiore del montante. NOTA: lasciare spazio per il passaggio della testa del mouse tra la stringa e i due fori.</li>
	<li>Legare due elastici a ciascuna estremità della graffetta e fissare la graffetta con gli elastici sul retro del montante. Infine, fissare il riser alla base a 90° (Figura 1).</li>
	<li>Selezionare una cannula delle dimensioni e della lunghezza appropriate. Per un topo da 20−30 g, è possibile utilizzare un catetere da 22 G (lungo 2,5−3,8 cm)11. Montare la cannula su una penna a cannula e accendere la luce della penna (Figura 2).</li>
	<li>Preparare una piccola pinza chirurgica e una pipetta Pasteur disinfettandoli con alcool al 70%.</li>
</ol>2. Preparazione della sostanza in esame
<ol><li>Pesare e sciogliere 3 mg di LPS in 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,2) per formare una soluzione di LPS con una concentrazione di 3 mg/ml.</li>
	<li>Pesare e sciogliere 10 mg di pentobarbital sodico in 1 mL di soluzione salina normale per formare una soluzione di pentobarbital sodico all'1%. Filtrare-sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 μm.</li>
</ol>3. Instillazione orofaringea non invasiva
<ol><li>Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% alla dose di 50 mg/kg12,13. Determinare la profondità dell'anestesia da una mancanza di risposta al riflesso raddrizzante.</li>
	<li>Posizionare il topo anestetizzato sulla piattaforma di intubazione. Fissare i denti anteriori superiori con il filo e i due avampiedi con gli elastici (Figura 3).</li>
	<li>Tira fuori la lingua con una pinzetta e tienila con la mano sinistra. Spingere la cannula lentamente, lungo la bocca, con la mano destra verso l'alto, fino all'epiglottide mandibolare. Utilizzare la luce della penna a cannula per trovare la trachea e inserirla lentamente nella trachea (Figura 4).</li>
	<li>Dopo che la cannula è stata inserita nella trachea, ritirare lentamente la penna per intubazione e lasciare la cannula all'interno. Inserire la pipetta Pasteur nel giunto della cannula e premere la testina (Figura 5). NOTA: Se il torace del topo si gonfia, l'intubazione ha esito positivo (Figura 6).</li>
	<li>Dopo aver avuto successo l'intubazione endotracheale, instillare nei topi 3 mg/mL di LPS a 3 mg/kg attraverso la cannula usando una microsiringa a testa piatta14,15 (Figura 7).</li>
	<li>Una volta fatto, rimuovere la cannula e la microsiringa. Rimuovere il mouse dall'impalcatura e posizionarlo in una gabbia separatamente per recuperare. Osservare lo stato respiratorio del topo fino a quando non si è ripreso e ha riacquistato la coscienza. NOTA: A 12 ore dopo l'instillazione tracheale LPS, eutanasia i topi seguendo la procedura approvata dal comitato etico animale. I saggi sierici TNF-α e le misurazioni del peso polmonare secco-umido sono stati eseguiti utilizzando procedure standard.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+human+amnion+epithelial+cells+through+endotracheal+instillation+against+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Xi+Bao+Yu+Fen+Zi+Mian+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice.</a> Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Lab+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).</li>
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<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panaxydol+attenuates+ferroptosis+against+LPS-induced+acute+lung+injury+in+mice+by+Keap1-Nrf2%2FHO-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96(2021).</li>
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<li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+operational+tolerance+and+generation+of+regulatory+cells+after+intratracheal+delivery+of+alloantigen+combined+with+nondepleting+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).</li>
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<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li>
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<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+packaging+IL-1%CE%B2+and+TNF-%CE%B1+enhance+lung+inflammatory+response+to+mechanical+ventilation+in+part+by+induction+of+cofilin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling.</a> International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).</li>
<li>Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Jilin+University%22">Jilin University</a>. , Master's Thesis (2010).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+acute+lung+injury+mice+model+established+by+intranasal+and+intratracheal+instillation+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).</li>
<li>Luckow, B., Lehmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+bronchoalveolar+lavage+in+mice+by+orotracheal+intubation+avoiding+tracheotomy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy.</a> BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Inizialmente, abbiamo guardato all'interno della cavità orale per trovare la posizione della trachea19. Tuttavia, durante questo processo, abbiamo scoperto che la trachea dei topi C57 / BL è stretta, il che rende difficile trovare la posizione corretta con questo metodo senza l'aiuto di apparecchiature come un endoscopio20. Dopo ulteriori esplorazioni, abbiamo scoperto che la luce della lampada dell'intubatore poteva penetrare la superficie del corpo, consentendo all'operat...

Il danno polmonare acuto (ALI) è una sindrome clinica comune. Sotto una varietà di fattori patogeni, la rottura della barriera fisiologica delle cellule epiteliali polmonari e delle cellule endoteliali vascolari porta ad un aumento della permeabilità alveolare, causando così una diminuzione della compliance polmonare, edema polmonare e grave ipossiemia1. La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è la forma più grave di ALI. L'infiammazione incontrollata e il danno da stress ossidativo sono considerati le principali cause di ALI eARDS 2 più grave. Quando le cellule epiteliali alveolari sono direttamente danneggiate a causa di un trauma, viene attivata la catena di risposta infiammatoria dei macrofagi alveolari, portando all'infiammazione nel polmone3. A livello globale, ci sono più di 3 milioni di pazienti con ARDS acuta all'anno e rappresentano circa il 10% dei ricoveri in unità di terapia intensiva; Inoltre, il tasso di mortalità nei casi gravi è pari al 46%4,5,6. Pertanto, è necessario stabilire un modello animale adatto di ALI per studiarne la patogenesi. Il topo è l'animale da esperimento più comunemente usato nello studio di ALI poiché il suo tratto respiratorio può simulare bene il tratto respiratorio umano per gli studi ALI. Inoltre, l'ALI si manifesta come massiccia infiltrazione di cellule infiammatorie, aumento della permeabilità vascolare polmonare ed edema polmonare. Le variazioni delle citochine infiammatorie nel siero e nel rapporto peso secco-umido del polmone riflettono il grado di ALI7.
Allo stato attuale, i principali metodi per la modellazione di ALI indotta da LPS nei topi includono l'intubazione tracheale intranasale e chirurgica 8,9. Qui, proponiamo un nuovo metodo per fornire LPS nella trachea attraverso l'intubazione orofaringea non invasiva. Questo metodo utilizza un intubatore illuminato per trovare la trachea del topo e quindi eroga LPS nella trachea e nel polmone. Questo metodo fornisce LPS ai polmoni in modo più accurato rispetto al metodo di consegna intranasale. Rispetto all'intubazione tracheale chirurgica, questo metodo non richiede un intervento chirurgico, evita di causare ferite e riduce il dolore nei topi10. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per stabilire un modello murino più convincente di ALI.

<table><tbody>Siringhe da microlitri <tr><td>Lipopolisaccaride</td><td>MERK</td><td>L4130</td><td>LPS</td></tr><tr><td></td><td>SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD</td><td></td> 10028505008124 <td>Per fornire</td></tr><tr><td>cannula per topo</td> LPS <td>RWD Life Science</td><td>803-03008-00</td><td>Cannula per topo</td></tr><tr><td>Kit per intubazione per topo</td><td>RWD Life Science</td><td>903-03027-00</td><td>Compreso una base, un montante, un intubatore, una pinza chirurgica e alcuni stringhe</td></tr><tr><td>pipetta Pasteur</td><td>Biosharp scienze della vita</td><td>BS-XG-03</td><td>Per verificare il successo dell'intubazione</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Beijing Chemical Co., Cina</td><td>20220918</td><td>Per anestetizzare i topi</td></tr></tbody></table>

instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

Il modello murino di danno polmonare acuto (ALI) indotto da lipopolisaccaride (LPS) o endotossina è ancora tra i modelli più comunemente usati negli studi sugli animali di danno polmonare acuto o infiammazione acuta. Gli attuali metodi più comunemente usati nei modelli murini di danno polmonare acuto sono un'iniezione intraperitoneale di LPS e tracheostomia per l'infusione tracheale di LPS. Tuttavia, il primo metodo manca di targeting polmonare e danneggia altri organi, e il secondo metodo induce traumi operativi, rischio di infezione e un basso tasso di sopravvivenza. Qui, raccomandiamo un metodo di intubazione endotracheale orofaringea non invasivo per l'instillazione di LPS nei topi. In questo metodo, LPS viene introdotto in modo non invasivo nella trachea attraverso la cavità orofaringea per essere instillato nel polmone con l'aiuto di un apparato per l'intubazione endotracheale. Questo metodo non solo assicura il targeting polmonare, ma evita anche danni e il rischio di morte negli animali. Ci aspettiamo che questo approccio diventi ampiamente utilizzato nel campo del danno polmonare acuto.

Il metodo proposto per l'instillazione di LPS nei topi è stato verificato valutando l'espressione della citochina infiammatoria TNF-α e il rapporto peso secco e umido polmonare 12 ore dopo l'instillazione di LPS. C'erano quattro gruppi nell'esperimento: controllo in bianco (senza alcun trattamento), intubazione chirurgica16, intranasale17,18 e intubazione orofaringea non invasiva (n = 6). Rispetto al gruppo...

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

Il nostro protocollo propone un nuovo metodo di somministrazione non invasivo di LPS dalla trachea al polmone, in modo più accurato. Le persone che stanno provando questo metodo per la prima volta dovrebbero fare molti sforzi per trovare la posizione della trachea. Per preparare la piattaforma di intubazione, passare la corda attraverso i due fori e legare le sue estremità alle piccole sporgenze nella parte superiore del montante.Quindi, attaccare due elastici a ciascuna estremità della graffetta e fissarli sul retro del montante. Infine, fissare il riser alla base con un angolo di 90 gradi. Montare la cannula su una penna cannula e accendere la luce della penna.Quindi, disinfettare le piccole pinze chirurgiche e la pipetta Pasteur usando il 70% di alcol. Per preparare la soluzione composta in esame, aggiungere tre milligrammi di lipopolisaccaride, o LPS, in un millilitro di pH 7,2 PBS. Quindi, sciogliere 10 milligrammi di pentobarbital sodico in un millilitro di soluzione salina normale e filtrare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri.Posizionare il topo anestetizzato sulla piattaforma di intubazione. Quindi fissare i denti anteriori superiori con la corda e i due avampiedi con gli elastici. Usando una pinzetta, estrai la lingua e tienila.Spingere lentamente la cannula lungo la bocca fino all'epiglottide mandibolare. Individuare la trachea con la luce della penna cannula e inserire lentamente la cannula al suo interno. Quindi ritirare la penna per intubazione, lasciando la cannula all'interno.Inserire la pipetta Pasteur nel giunto della cannula e premere la testa. Dopo il successo dell'intubazione endotracheale, utilizzando una microsiringa a testa piatta, instillare la soluzione LPS preparata a tre milligrammi per dose di chilogrammo attraverso la cannula. Una volta terminato, estrarre la microsiringa e la cannula.Rimuovere il mouse dalla piattaforma di intubazione e metterlo in una gabbia separata per recuperare. Osservare lo stato respiratorio del topo fino a quando non recupera e riprende conoscenza. A 12 ore dall'instillazione tracheale di LPS, l'espressione di una citochina infiammatoria, TNF-alfa, e il rapporto peso secco e umido polmonare sono stati valutati e confrontati con altri metodi di instillazione.I livelli sierici di TNF-alfa nel gruppo di intubazione orofaringea non invasiva sono aumentati significativamente rispetto al gruppo di controllo in bianco. Anche il rapporto polmone secco-umido è stato aumentato, raggiungendo lo stesso livello del gruppo di intubazione tracheale chirurgica. È importante non graffiare la trachea nel processo di ricerca della posizione della trachea.La tecnica potrebbe anche essere utilizzata per somministrare altri farmaci che devono raggiungere il polmone in modo non invasivo.

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Instillazioni intratracheale soluti consegnare direttamente nei polmoni. Questa procedura obiettivi la consegna del instillate nelle regioni distali del polmone, ed è quindi spesso incorporati in studi volti a studiare alveoli. Forniamo un protocollo dettagliato di sopravvivenza per l'esecuzione di instillazioni intratracheale nei topi.

Diretta instillazione tracheale di soluti in polmone mouse

Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l'esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Fonte: Radulovic, K., et al. Iniezioni di lipopolisaccaridi nei topi per imitare l'ingresso di prodotti derivati da microbi dopo la rottura della barriera intestinale. J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra una procedura passo dopo passo per iniettare lipopolisaccaridi (LPS) nei topi intraperitonealmente per indurre infiammazione sistemica.

Iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride batterico nei topi per studiare le risposte immunitarie sistemiche

L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Le formulazioni in polvere secca per inalazione hanno un grande potenziale nel trattamento delle malattie respiratorie. Prima di entrare in studi sull'uomo, è necessario valutare l'efficacia della formulazione della polvere secca in studi preclinici. Viene presentato un metodo semplice e non invasivo per la somministrazione di polvere secca nei topi attraverso la via intratracheale.

Somministrazione intratracheale della formulazione di polvere secca nei topi

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Impara l'instillazione intratracheale non invasiva di lipopolisaccaridi nei topi per studiare l'infiammazione polmonare. Questo metodo riduce il trauma chirurgico e consente una somministrazione accurata di LPS ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

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