Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

La tecnica dimostrata utilizza uno strumento a basso costo per elaborare rapidamente il tessuto di agrumi ricco di floema, eliminando la necessità di protocolli ad alta intensità di manodopera e attrezzature di laboratorio specializzate. Ciò consente un rapido rilevamento e gestione a valle di viroidi, virus e batteri degli agrumi. Questo metodo potrebbe aumentare la produttività e migliorare la qualità e l'uniformità dei servizi di analisi, a vantaggio dell'industria agrumicola e potenzialmente aiutando a diagnosticare e trattare le malattie nei vivai e nei campi.

Le piante di agrumi sono infettate da agenti patogeni, causando perdite economiche significative in tutto il mondo. Tecniche avanzate di rilevamento dei patogeni, come il Budwood Tissue Extractor, o BTE, sono necessarie per produrre materiali di propagazione testati per la produzione di alberi su larga scala. Sebbene testato e validato con campioni di agrumi, il metodo può essere applicato nei laboratori diagnostici e nelle operazioni di campo per molte altre colture.

I principianti che eseguono questa tecnica devono familiarizzare con il protocollo, seguire con precisione le istruzioni ed essere pazienti. Per iniziare, usa l'app del telefono Test Tracker per selezionare un albero e tenere un collare tag NFC (Near-Field Communication) sul telefono per caricare le informazioni sull'albero sul tag. Inserire tre o quattro campioni di gemme di agrumi nel supporto per sacchetti di plastica compatibile con l'estrattore di tessuti Budwood, o BTE, e chiuderlo con la clip.

Dopo aver verificato la qualità del campione seguendo i passaggi descritti nel testo, utilizzare l'app del telefono Test Tracker per scansionare il collare NFC tag dell'albero e collegarlo al tag della clip NFC sul sacchetto del campione. All'interno di una cappa aspirante adeguatamente disinfettata, premere l'interruttore sul retro della base dell'estrattore di tessuti. Assicurarsi che l'interruttore sul lato sinistro della scatola sia premuto verso il basso sulla parte superiore e attendere che il LED verde lampeggiante indichi che la camera è pronta.

Per preparare la camera BTE, fissare un sacchetto di campioni vuoto sul retro della camera fissandolo all'ugello posteriore utilizzando un O-ring. Ispezionare la lama per segni di usura o danni, come tagli sulla lama che continuano nella plastica o tagli sulla punta. Assicurarsi che la freccia sulla lama sia allineata con il simbolo del lucchetto singolo e che il rilascio dell'aria sul fondo della camera sia rivolto verso il simbolo O.

Posizionare il coperchio trasparente sull'apertura della camera. Utilizzando il binario a destra della camera, far scorrere la slitta BTE trasparente sulla camera, spingendo il blocco sul fondo della camera il più possibile nella slitta. Assicurarsi che il cappuccio dello stantuffo sia montato sulla parte superiore del vetrino.

Per caricare la camera BTE sulla base BTE, posizionare la camera preparata sulla base con l'ugello della base BTE che sporge nella parte posteriore della camera. Caricare il campione sulla base BTE spostando l'adesivo bianco sulla clip NFC tag con un lento movimento circolare verso una Z sul lato destro della scatola finché la luce gialla non inizia a lampeggiare. Dopo aver attaccato il campione alla base, assicurarsi che la sacca del campione non abbia fori.

Quindi posizionare l'O-ring sulla sacca del campione per fissarla alla parte anteriore dell'ugello BTE. Per caricare il set di siringhe inutilizzato, prima strappare il set di siringhe. Quindi posizionare il set di siringhe non utilizzato sulla torre della bilancia.

Rimuovere il set di siringhe quando una luce rossa inizia a lampeggiare o la bilancia visualizza zero. Rimuovere lo stantuffo con il filtro dalla siringa assicurandosi che il fluido rimanga nella siringa inferiore. Posiziona lo stantuffo su un tovagliolo di carta o sulla torre, dove non tocca alcuna superficie.

Infine, collegare la siringa alla porta di uscita del vetrino premendo la porta di uscita nella siringa e ruotandola di 90 gradi. Per iniziare a elaborare il campione di gemme, premere il pulsante nero in alto per avviare la macchina. Prendi un bastoncino di gemme dal sacchetto e inseriscilo nella parte superiore dell'ugello BTE.

Afferra il bastoncino di gemme sull'altro lato della camera con l'altra mano e scendi lentamente nella lama. Muovi lentamente il bocciolo avanti e indietro mentre lo giri. Quando si sente un leggero ronzio, spostare il ramo più in profondità nella macchina per concentrarsi sul floema.

Dopo aver completato lo stesso per tutti i rami, premere il pulsante nero in alto per interrompere l'elaborazione e attendere che la luce inizi a lampeggiare di nuovo in giallo. Per verificare il peso del campione, ruotare la siringa di 90 gradi e tirarla verso il basso. Riposizionare lo stantuffo sulla siringa e posizionare la siringa sulla torre.

Dopo che la bilancia ha rilevato automaticamente il campione, un LED verde lampeggiante indica che il peso del campione rientra nell'intervallo corretto. Se la spia rossa lampeggia, indicando un peso del campione troppo basso, ripetere l'elaborazione del campione. Se il peso è troppo alto, rimuovere alcuni campioni e il lampeggio del LED giallo diventerà più lento.

Per omogeneizzare il campione, rimuovere lo stantuffo dalla siringa contenente il campione. Spingere il fluido nella siringa e reinserire lo stantuffo. Spingere lo stantuffo per far passare il tampone e la linfa della pianta attraverso il filtro a rete attraverso il tubo di gomma nella siringa vuota.

Mescolare il campione spingendo il tampone e la linfa della pianta avanti e indietro da tre a quattro volte da una siringa all'altra fino a quando il campione non si trasforma in un liquido verde omogeneo. Una volta ben omogeneizzato, spingere il campione di linfa vegetale nella siringa senza il filtro a rete e staccare il tubo di gomma e la siringa con il filtro. Quindi espellere il campione di linfa vegetale dalla siringa in una provetta sterile per microcentrifuga da due millilitri.

Dopo aver etichettato il campione con il numero della sacca utilizzando un pennarello indelebile, conservarlo a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Disinfettare la camera rimovibile BTE dopo che il 10° campione è stato elaborato e il LED verde continua a lampeggiare invece di diventare blu. Per smontare la camera e pulire tutti i contaminanti, rimuovere il coperchio in plastica trasparente, il vetrino trasparente della camera e la porta di intasamento sul vetrino della camera.

Quindi ruotare la valvola di rilascio dell'aria sul fondo della camera fino al segno del lucchetto aperto. Dopo aver posizionato i componenti della camera nel pulitore ad ultrasuoni di configurazione, posizionare la camera nella vasca da bagno con il coperchio sottostante per evitare che il coperchio galleggi. Far funzionare il pulitore ad ultrasuoni per 15 minuti.

Sciacquare i componenti della camera a bagnomaria per almeno 30 secondi prima di spostare i componenti della camera nella stazione di asciugatura. Per iniziare l'asciugatura, posizionare la pistola ad aria compressa in linea con la scanalatura dell'apertura superiore della camera e premere il grilletto della pistola per erogare aria per circa 30 secondi. Ruotare la pistola ad aria compressa verso gli ugelli superiori della camera e, dopo aver premuto il grilletto, tracciare lentamente tre cerchi completi di ciascun ingresso dell'ugello.

Posizionare la pistola ad aria compressa al centro del BTE e, partendo dal punto più interno, tenere premuto il grilletto e muoversi fino a quando la pistola ad aria compressa non punta verso il carrello. Fai scorrere rapidamente l'aria su tutta la camera davanti e dietro per far uscire l'acqua superficiale dall'esterno. Il confronto tra la BTE e il protocollo di laboratorio convenzionale per il trattamento dei tessuti di agrumi ha indicato che le concentrazioni di acido nucleico estratte determinate misurando l'assorbanza a 260 nanometri in entrambi i casi erano comparabili.

La purezza degli acidi nucleici estratti dal BTE, determinata come rapporto tra le assorbanze a 260 e 280 nanometri, era elevata con una bassa contaminazione proteica. L'integrità dell'acido nucleico analizzata mediante RT-qPCR mirata all'mRNA del gene NADH deidrogenasi degli agrumi è risultata molto simile sia per la BTE che per il protocollo manuale standard. La procedura di laboratorio convenzionale richiedeva quasi 7-10 minuti per il taglio manuale per campione e più tempo per la lavorazione dei tessuti, compresa la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione.

Tuttavia, il BTE ha processato ogni campione per un'estrazione di acido nucleico in tre minuti, comprese le fasi di preparazione, pesatura e pulizia. Nessuno dei 72 campioni sani provenienti dal primo trattamento dei campioni BTE ha prodotto curve di amplificazione per i patogeni degli agrumi testati, convalidando così il trattamento BTE del tessuto degli agrumi. Nella seconda elaborazione del campione BTE, con due campioni infetti da mix introdotti, gli acidi nucleici estratti hanno mostrato la presenza di diversi virus e viroidi degli agrumi nei lotti uno e cinque.

Tuttavia, non è stata rilevata alcuna contaminazione incrociata tra le teste, né risultati falsi positivi o negativi. Durante la lavorazione, lasciare il ramo in un posto per troppo tempo potrebbe tagliare troppo in profondità nel ramo, aumentando le possibilità di intasamento e raccogliendo materiale fibroso acellulare. Una volta lavorato, il materiale è pronto per la maggior parte dei protocolli di estrazione e purificazione del DNA e dell'RNA e può essere testato con qualsiasi test di rilevamento molecolare per i patogeni delle piante.

Lo sviluppo dell'estrattore di tessuti Budwood ha aperto le porte all'area ad alta produttività e alla vagliatura dell'intero boschetto. Insieme all'estrattore di tessuti fogliari, consente di lavorare su larga scala tessuti vegetali che in precedenza erano ritenuti difficili da elaborare, come radici e peduncoli.