Name: Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso lingegneria degli strumenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Impara a processare rapidamente i tessuti di gemme di agrumi con il Budwood Tissue Extractor per rilevare agenti patogeni. Questo metodo riduce i costi e aumenta la produttività nel settore agrumicolo.

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Gli autori riconoscono il popolo Cahuilla come i Custodi Tradizionali della Terra su cui è stato completato il lavoro sperimentale. Siamo grati al professor Norman Ellstrand dell'Università della California, Riverside, per aver fornito uno spazio di laboratorio per svolgere attività di ricerca per questo progetto nell'ambito dell'iniziativa UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Questa ricerca è stata supportata dal CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (sovvenzione n. 18-0001-055-SC). Un ulteriore sostegno è stato fornito anche dal progetto CRB 6100; Istituto nazionale per l'alimentazione e l'agricoltura dell'USDA, progetto Hatch 1020106; e il National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) assegnato a Georgios Vidalakis.

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<li>Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+multiplex+RT-qPCR+detects+three+citrus+viroids+from+different+genera+in+a+wide+range+of+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts.</a> Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+future+of+a+century+old+Citrus+tristeza+virus+collection%3A+A+California+citrus+germplasm+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale.</a> Frontiers in Microbiology. 4, 366(2013).</li>
<li>Gergerich, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safeguarding+fruit+crops+in+the+age+of+agricultural+globalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization.</a> Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).</li>
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<li>Yokomi, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Citrus+tristeza+virus+isolates+breaking+resistance+in+trifoliate+orange+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California.</a> Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Con l'avvento della malattia degli agrumi HLB, per ridurre le perdite, l'industria agrumicola, le agenzie di regolamentazione e i laboratori diagnostici sono stati esortati a fare affidamento su metodi di estrazione dell'acido nucleico ad alto rendimento combinati con l'elaborazione manuale dei campioni a basso rendimento e saggi di rilevamento dei patogeni come la qPCR34 per l'analisi dei singoli alberi, in combinazione con le pratiche di gestione delle malattie35. Il tass...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65159">Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering</a>. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6 
Douglas Hill2 
Emily Dang1 
Gerardo Uribe1 
Agustina De Francesco1 
Ryan Milton2 
Anthony De La Torre2 
Axel Mounkam2 
Tyler Dang1 
Sohrab Botaghi1 
Irene Lavagi-Craddock1 
Alexandra Syed1 
William Grover3 
Adriann Okamba4,5 
Georgios Vidalakis2 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside 
2Technology Evolving Solutions (TES) 
3Department of Bioengineering, University of California Riverside 
4Ecole Sup&#233;rieure d&#39;Ing&#233;nieurs L&#233;onard de Vinci ESILV 
5University of California Riverside 
6California Agriculture and Food Enterprise (CAF&#201;), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6 
Douglas Hill2 
Emily Dang1 
Gerardo Uribe1 
Agustina De Francesco1 
Ryan Milton2 
Anthony De La Torre2 
Axel Mounkam2 
Tyler Dang1 
Sohrab Bodaghi1 
Irene Lavagi-Craddock1 
Alexandra Syed1 
William Grover3 
Adriann Okamba4,5 
Georgios Vidalakis1 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside 
2Technology Evolving Solutions (TES) 
3Department of Bioengineering, University of California Riverside 
4Ecole Sup&#233;rieure d&#39;Ing&#233;nieurs L&#233;onard de Vinci ESILV 
5University of California Riverside 
6California Agriculture and Food Enterprise (CAF&#201;), University of California Riverside

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65159">Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

Gli agenti patogeni trasmissibili degli agrumi a basso floema, come viroidi, virus e batteri, hanno causato epidemie devastanti e gravi perdite economiche in ogni area produttrice di agrumi del mondo. I viroidi degli agrumi sono fattori di produzione limitanti a causa delle malattie da esocortis e cachessia che causano in tipi di agrumi economicamente importanti, come trifogliati, ibridi trifogliati, mandarini, clementine e mandarini 1,2,3. In California, questi tipi di agrumi sensibili ai viroidi sono alla base del mercato in crescita e redditizio degli "easy-peelers", seguendo la tendenza mutevole nella preferenza dei consumatori per frutti facili da sbucciare, segmentati e senza semi 4,5,6. Pertanto, i viroidi degli agrumi sono regolamentati dal Dipartimento per l'alimentazione e l'agricoltura della California (CDFA) "Citrus Nursery Stock Cleaning Program-Senate Bill 140" e i laboratori del Plant Pest Diagnostics Branch del CDFA eseguono migliaia di test sui viroidi degli agrumi ogni anno 7,8,9,10 . Il virus Citrus tristeza (CTV) è stato responsabile della morte di oltre 100 milioni di alberi di agrumi dall'inizio dell'epidemia globale negli anni '30 3,9,10,11. In California, la vaiolatura del fusto e gli isolati di resistenza alla rottura trifogliata del virus rappresentano una seria minaccia per l'industria agrumicola californiana da 3,6 miliardi di dollari12,13,14. Di conseguenza, il CDFA classifica il CTV come un parassita delle piante regolamentato di classe A e il laboratorio dell'Agenzia per l'eradicazione della tristeza della California centrale (CCTEA) esegue indagini approfondite sul campo e migliaia di test sui virus ogni anno15,16. Si stima che il batterio "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) e la malattia huanglongbing (HLB) abbiano causato quasi 9 miliardi di dollari di danni economici alla Florida a causa di una riduzione del 40% della superficie coltivata a agrumi, una diminuzione del 57% delle operazioni di agrumi e una perdita di quasi 8.000posti di lavoro. In California, si prevedeva che un'ipotetica riduzione del 20% della superficie coltivata a agrumi a causa dell'HLB avrebbe comportato la perdita di oltre 8.200 posti di lavoro e una riduzione di oltre mezzo miliardo di dollari nel prodotto interno lordo dello stato. Pertanto, il Citrus Pest and Disease Prevention Program spende oltre 40 milioni di dollari all'anno in indagini per testare, rilevare e sradicare CLas dalla California14,17,19,20.
Un elemento chiave della gestione dei viroidi, dei virus e dei batteri degli agrumi è l'uso di materiali di propagazione testati contro i patogeni (ad esempio, gemme) per la produzione di alberi. Le gemme di agrumi testate per i patogeni vengono prodotte e mantenute nell'ambito di programmi di quarantena completi che impiegano tecniche avanzate di eliminazione e rilevamento dei patogeni10,21. Il Citrus Clonal Protection Program (CCPP) presso l'Università della California, Riverside, testa ogni anno migliaia di campioni di gemme di varietà di agrumi importate di recente nello stato e negli Stati Uniti, nonché alberi di origine di gemme di agrumi, per proteggere gli agrumi della California e sostenere le funzioni del National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. Per gestire il grande volume di analisi degli agrumi, i saggi di rilevamento dei patogeni ad alta produttività, affidabili ed economici sono una componente fondamentale per il successo di programmi come il CCPP 7,10,22.
Mentre i saggi di rilevamento dei patogeni su base molecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR) hanno consentito un aumento significativo della produttività nei laboratori diagnostici vegetali, nella nostra esperienza, uno dei colli di bottiglia più critici nell'implementazione di protocolli ad alto rendimento è la fase di elaborazione dei campioni di tessuto vegetale. Ciò è particolarmente vero per gli agrumi perché i protocolli attualmente disponibili per la lavorazione di tessuti ricchi di floema come i piccioli delle foglie e la corteccia delle gemme sono laboriosi, richiedono tempo e attrezzature di laboratorio costose e specializzate. Questi protocolli richiedono la trinciatura manuale, la pesatura, la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione a basse temperature per evitare la degradazione dell'acido nucleico 8,23,24. Ad esempio, presso il laboratorio diagnostico CCPP, l'elaborazione dei campioni comprende (i) la trinciatura manuale (6-9 campioni/h/operatore), (ii) la liofilizzazione (16-24 ore), (iii) la polverizzazione (30-60 s) e (iv) la centrifugazione (1-2 ore). Il processo richiede anche forniture specializzate (ad esempio, tubi con chiusura sicura per impieghi gravosi, sfere di macinazione in acciaio inossidabile, adattatori, lame, guanti) e più costose apparecchiature di laboratorio (ad esempio, congelatore ultra-basso, liofilizzatore, polverizzatore di tessuti, criostazione di azoto liquido, centrifuga refrigerata).
Come in qualsiasi settore, la progettazione delle apparecchiature e l'automazione dei processi sono fondamentali per ridurre i costi, aumentare la produttività e fornire prodotti e servizi uniformi e di alta qualità. L'industria agrumicola ha bisogno di strumenti per il trattamento dei tessuti a basso costo che richiedano competenze minime per funzionare e, in quanto tali, siano facili da trasferire ai laboratori diagnostici e alle operazioni sul campo per consentire un'elevata capacità di elaborazione dei campioni per un rapido rilevamento dei patogeni a valle. Technology Evolving Solutions (TES) e il CCPP hanno sviluppato (cioè progettato e fabbricato) e convalidato (cioè testato con campioni di agrumi e confrontato con le procedure di laboratorio standard) uno strumento a basso costo (cioè ha eliminato la necessità di attrezzature di laboratorio specializzate) per la lavorazione rapida di tessuti di agrumi ricchi di floema (cioè gemme), chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE). Come si vede nella Figura 1, il BTE include un componente di base per l'alimentazione e i controlli, oltre a una camera rimovibile per la lavorazione delle gemme di agrumi. La camera BTE è composta da una mola appositamente progettata per rimuovere i tessuti di corteccia ricchi di floema dal gemma di agrumi. Il tessuto di corteccia sminuzzato viene espulso rapidamente attraverso una porta di scorrimento in una siringa contenente tampone di estrazione, filtrato e reso pronto per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico senza alcuna manipolazione o preparazione aggiuntiva (Figura 1). Il sistema BTE comprende anche un'applicazione di tracciamento dei campioni senza carta e un'applicazione di pesatura integrata, che registrano le informazioni di elaborazione dei campioni in un database online in tempo reale.
Il sistema BTE ha aumentato la capacità diagnostica di laboratorio del CCPP di oltre il 100% e ha prodotto costantemente estratti di tessuto di agrumi adatti alla purificazione di acidi nucleici di alta qualità e al rilevamento a valle di agenti patogeni trasmissibili agli innesti di agrumi utilizzando saggi PCR. Più specificamente, BTE ha ridotto il tempo per l'elaborazione dei tessuti da oltre 24 ore a ~3 minuti per campione, ha sostituito gli strumenti di laboratorio che costano oltre $ 60.000 (Figura 2, passaggi 2-4) e ha consentito l'elaborazione di campioni di dimensioni maggiori.
Questo documento presenta i dati di convalida del trattamento del tessuto di corteccia di agrumi ad alto rendimento BTE, l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento di agenti patogeni con campioni di gemme di agrumi da alberi di origine, inclusi tutti i controlli positivi e negativi appropriati rispettivamente dalla CCPP Rubidoux Quarantine Facility e dalla Lindcove Foundation Facility. Presentiamo anche le variazioni di produttività e tempo di elaborazione rispetto all'attuale procedura di laboratorio (Figura 2). Inoltre, questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e passo-passo per i laboratori di analisi dei patogeni degli agrumi e dimostra come il BTE possa supportare le funzioni dei programmi di nursery clean per i patogeni, l'indagine e l'eradicazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65159/65159fig01.jpg"> Figura 1: Estrattore di tessuto di gemme. Il BTE comprende un componente di base per l'alimentazione e i controlli, oltre a una camera rimovibile per la lavorazione delle gemme di agrumi. La camera BTE è composta da una mola appositamente progettata per rimuovere i tessuti di corteccia ricchi di floema dal legno di agrumi. Il tessuto di corteccia triturato viene espulso rapidamente attraverso una porta scorrevole in una siringa, filtrato e preparato per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico senza alcuna manipolazione o preparazione aggiuntiva. Abbreviazione: BTE = estrattore di tessuti di gemme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65159/65159fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65159/65159fig02.jpg"> Figura 2: Confronto passo dopo passo tra la procedura convenzionale di laboratorio di taglio manuale e la lavorazione BTE. L'elaborazione BTE comporta l'elaborazione del tessuto di corteccia di agrumi ad alto rendimento, l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento di agenti patogeni. Il tempo per ogni passaggio è indicato tra parentesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65159/65159fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Linea di rifinitore esagonale da 0,08"</td><td>PowerCare</td><td>FPRO07065</td><td>necessario per sostituire le lame.</td></tr><tr><td>Compressore d'aria da 1 Hp, 8 gal</td><td>California Air Tools</td><td>8010</td><td>Camere ad asciugatura rapida dopo il risciacquo</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Globe Scientific</td><td>111558B</td><td>Conservare il campione dopo l'agitazione con le siingi</td></tr><tr><td>Set di siringhe da 10 mL Tecnologia</td><td>Soluzioni in evoluzione</td><td>TE006-F1-10A-G1000-E1</td><td>Il materiale della siringa viene tagliato. Flacone da 1 L con tampone tiocianato di guanidina. AVVERTENZA - contiene tiocianato di guanidina, è richiesto il servizio di rifiuti pericolosi - non mescolare con candeggina</td></tr><tr><td>12" Righello</td><td>Westcott</td><td>&lrm; 16012</td><td>Per misurare la linea del rifinitore prima del taglio</td></tr><tr><td>12% di ipoclorito di sodio</td><td>Hasa</td><td>1041</td><td>Disinfetta le camere dopo la</td></tr> <tr><td>lavorazione-20 C Freezer</td><td>Insignia</td><td>NS-CZ70WH0</td><td>Conservare il campione dopo la lavorazione</td></tr> di <tr><td>sacchetti di plastica da 4" x 12"</td><td>Plymor</td><td>FP20-4x12-10</td><td>Sacchetti per contenere i rami durante la spedizione. Gli O-ring attaccano la sacca alla camera BTE per sigillare</td></tr> il <tr><td>batuffolo di cotone da 6"</td><td>Puritan</td><td>806-PCL</td><td>Swab per rimuovere gli intasamenti</td></tr><tr><td>Borsa portaoggetti da 7 galloni</td><td>HDX</td><td>206152</td><td>Contiene una soluzione di ipoclorito di sodio per disinfettare le camere e acqua per risciacquare le camere</td></tr><tr><td>Pistola ad aria compressa</td><td>JASTIND</td><td>&lrm; JTABG103A</td><td>Dirige l'aria nelle camere ad alta pressione</td></tr><tr><td>Black Sharpie</td><td>Sharpie</td><td>&nbsp; S-19421</td><td>Marcatura delle provette da 1,5 mL in modo da poter identificare il campione in un secondo momento</td></tr><tr><td>Erogatore per flacone</td><td>Marca</td><td>Z627569</td><td>Erogatore regolabile per l'erogazione di guandina nella siringa</td></tr> Tecnologia <tr><td>della camera BTE</td><td>Soluzioni in evoluzione</td><td>TE002BB-A05-E1</td><td>Utilizzato per la lavorazione del legno di gemme. Include O-ring, scivolo BTE, stantuffo scorrevole, valvola di scarico, coperchio, set di lame e strumento per la rimozione del set di lame</td></tr><tr><td>Detersivo per piatti</td><td>Dawn</td><td>57445CT</td><td>Surfectant per migliorare la penetrazione dell'ipoclorito di sodio nella camera</td></tr><tr><td>Cappa aspirante con filtro hepa</td><td>Air Science</td><td>P5-36XT-A</td><td>Cappa aspirante con filtro hepa (ASTS-030) per limitare la possibile contaminazione e proteggere da fuoriuscite di sostanze chimiche</td></tr><tr><td>Contenitore</td> <td>di spedizione in schiuma isolataPolarTech</td><td>261/J50C</td><td>Contenitore di spedizione isolato per spedire campioni su ghiaccio dopo che sono stati raccolti</td></tr><tr><td>Camice da laboratorio</td><td>Red Kap</td><td>KP14WH LN 46</td><td>Camice da laboratorio per limitare la possibile contaminazione e proteggere da fuoriuscite di sostanze chimiche</td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Surface Laptop compatibile con Wi-Fi per eseguire TES GUI. Necessario per la configurazione iniziale e fornisce informazioni più approfondite sulla base per la lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Telefono compatibile con NFC Telefono</td><td>Samsung</td><td>Galaxy S9</td><td>per scaricare e utilizzare l'app per telefono TES</td></tr><tr><td>Tag clip NFC</td><td>Tecnologia Soluzioni in evoluzione</td><td>TE005-Clip-E1</td><td>Tag di esempio che può essere collegato con gli alberi. Realizzato per funzionare con l'app per telefono TES</td></tr><tr><td>Tecnologia NFC Collar Tag</td><td>Soluzioni in evoluzione</td><td>TE005-Collar-E1</td><td>Tag attaccato a un albero. Realizzato per funzionare con l'app per telefono TES</td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Usa Scientific</td><td>3915-4400</td><td>Guanti per limitare la possibile contaminazione e proteggere dalle fuoriuscite di sostanze chimiche</td></tr><tr><td>Cuffie antirumore</td><td>3M</td><td>90565-4DC-PS</td><td>Proteggono le orecchie durante il funzionamento del compressore d'aria e della base di lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Tubo flessibile dell'aria di rinculo in poliuretano</td><td>FYPower</td><td>&lrm; 510019</td><td>Collega la pistola ad aria compressa al compressore</td></tr><tr><td>Occhiali Saftey</td><td>Solidwork</td><td>SW8329-US</td><td>Protegge gli occhi dai pericoli chimici e fisici</td></tr><tr><td>Flacone spray</td><td>JohnBee</td><td>B08QM81BJV</td><td>Spray candeggina per deconatinazioni le superfici</td></tr><tr><td>Tecnologia di base dell'estrattore di tessuti</td><td>Soluzioni in evoluzione</td><td>TE001-A-E1</td><td>Sistema per la lavorazione dei tessuti vegetali. Necessita di camere BTE o LTE per funzionare. Include cavo di alimentazione, adattatore per lame e chiave a brugola da 8/32</td></tr>" <tr><td>Bilancia di base per la lavorazione dei tessuti</td><td>Soluzioni in evoluzione</td><td>TE003-A05-200g-01-E1</td><td>Bilancia da 200 g, risoluzione 0,01 che si collega alla base per la lavorazione dei tessuti per applicare gli intervalli di peso e/o collegare i pesi con il campione. Include bilancia, cavo di alimentazione, cavo di collegamento, supporto per siringa da 5 ml, scudo d'aria a torre.</td></tr><tr><td>Vermiculite</td><td>EasyGoProdotti</td><td>B07WQDZGRP</td><td>Necessario per il trasporto di rifiuti pericolosi (tiocianato di guanidina) utilizzando un servizio di smaltimento rifiuti pericolosi</td></tr><tr><td>Tagliafili</td><td>Boenfu</td><td>&lrm; BOWC-06002-US</td><td>Tronchesi per tagliare il filo del rifinitore</td></tr></tbody></table>

automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

Gli agenti patogeni degli agrumi trasmissibili e limitati al floema degli agrumi, come virus, viroidi e batteri, sono responsabili di epidemie devastanti e gravi perdite economiche in tutto il mondo. Ad esempio, il virus della tristeza degli agrumi ha ucciso oltre 100 milioni di alberi di agrumi in tutto il mondo, mentre il "Candidatus Liberibacter asiaticus" è costato alla Florida 9 miliardi di dollari. L'uso di gemme di agrumi testate per i patogeni per la propagazione degli alberi è fondamentale per la gestione di tali patogeni. Il Citrus Clonal Protection Program (CCPP) presso l'Università della California, Riverside, utilizza saggi di reazione a catena della polimerasi (PCR) per testare ogni anno migliaia di campioni di alberi di origine di gemme di agrumi per proteggere gli agrumi della California e per fornire unità di propagazione pulite al National Clean Plant Network. Un grave collo di bottiglia nella rilevazione molecolare ad alto rendimento di virus e viroidi degli agrumi è la fase di elaborazione dei tessuti vegetali.
Una corretta preparazione dei tessuti è fondamentale per l'estrazione di acidi nucleici di qualità e per l'uso a valle nei saggi PCR. La triturazione, la pesatura, la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione a basse temperature dei tessuti vegetali per evitare la degradazione degli acidi nucleici richiedono molto tempo e manodopera e richiedono attrezzature di laboratorio costose e specializzate. Questo documento presenta la convalida di uno strumento specializzato progettato per elaborare rapidamente tessuti di corteccia ricchi di floema da gemme di agrumi, chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE). Il BTE aumenta la produttività del campione del 100% rispetto ai metodi attuali. Inoltre, riduce la manodopera e il costo delle apparecchiature. In questo lavoro, i campioni di BTE avevano una resa del DNA (80,25 ng/μL) paragonabile al protocollo di taglio manuale del CCPP (77,84 ng/μL). Questo strumento e il protocollo di elaborazione rapida dei tessuti vegetali possono avvantaggiare diversi laboratori e programmi diagnostici sugli agrumi in California e diventare un sistema modello per il trattamento dei tessuti per altre colture perenni legnose in tutto il mondo.

Estrazione, purificazione e qualità dell'RNA utilizzando tessuto di agrumi di gemme trattato con BTE e valutazione del tempo per la lavorazione dei tessuti Per questo test sono stati utilizzati campioni di gemme di 255 alberi di agrumi rappresentativi per confrontare la qualità dell'RNA del BTE rispetto alla procedura standard. I campioni sono stati processati dall'estrattore di tessuto di gemme (BTE) (fasi del protocollo 4.1-4.6 e Figura 2, lato destro, fase 1, fase 5 e fase 6) o preparati seguendo i...

Abbiamo progettato, fabbricato e convalidato uno strumento che elabora rapidamente i tessuti di corteccia di agrumi ricchi di floema. Rispetto ai metodi attuali, l'estrattore di tessuti di gemme (BTE) ha aumentato la produttività dei campioni e diminuito i costi di manodopera e attrezzature necessari.

Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

Graft-transmissible, phloem-limited pathogens of citrus such as viruses, viroids, and bacteria are responsible for devastating epidemics and serious ...

La tecnica dimostrata utilizza uno strumento a basso costo per elaborare rapidamente il tessuto di agrumi ricco di floema, eliminando la necessità di protocolli ad alta intensità di manodopera e attrezzature di laboratorio specializzate. Ciò consente un rapido rilevamento e gestione a valle di viroidi, virus e batteri degli agrumi. Questo metodo potrebbe aumentare la produttività e migliorare la qualità e l'uniformità dei servizi di analisi, a vantaggio dell'industria agrumicola e potenzialmente aiutando a diagnosticare e trattare le malattie nei vivai e nei campi.Le piante di agrumi sono infettate da agenti patogeni, causando perdite economiche significative in tutto il mondo. Tecniche avanzate di rilevamento dei patogeni, come il Budwood Tissue Extractor, o BTE, sono necessarie per produrre materiali di propagazione testati per la produzione di alberi su larga scala. Sebbene testato e validato con campioni di agrumi, il metodo può essere applicato nei laboratori diagnostici e nelle operazioni di campo per molte altre colture.I principianti che eseguono questa tecnica devono familiarizzare con il protocollo, seguire con precisione le istruzioni ed essere pazienti. Per iniziare, usa l'app del telefono Test Tracker per selezionare un albero e tenere un collare tag NFC (Near-Field Communication) sul telefono per caricare le informazioni sull'albero sul tag. Inserire tre o quattro campioni di gemme di agrumi nel supporto per sacchetti di plastica compatibile con l'estrattore di tessuti Budwood, o BTE, e chiuderlo con la clip.Dopo aver verificato la qualità del campione seguendo i passaggi descritti nel testo, utilizzare l'app del telefono Test Tracker per scansionare il collare NFC tag dell'albero e collegarlo al tag della clip NFC sul sacchetto del campione. All'interno di una cappa aspirante adeguatamente disinfettata, premere l'interruttore sul retro della base dell'estrattore di tessuti. Assicurarsi che l'interruttore sul lato sinistro della scatola sia premuto verso il basso sulla parte superiore e attendere che il LED verde lampeggiante indichi che la camera è pronta.Per preparare la camera BTE, fissare un sacchetto di campioni vuoto sul retro della camera fissandolo all'ugello posteriore utilizzando un O-ring. Ispezionare la lama per segni di usura o danni, come tagli sulla lama che continuano nella plastica o tagli sulla punta. Assicurarsi che la freccia sulla lama sia allineata con il simbolo del lucchetto singolo e che il rilascio dell'aria sul fondo della camera sia rivolto verso il simbolo O.Posizionare il coperchio trasparente sull'apertura della camera. Utilizzando il binario a destra della camera, far scorrere la slitta BTE trasparente sulla camera, spingendo il blocco sul fondo della camera il più possibile nella slitta. Assicurarsi che il cappuccio dello stantuffo sia montato sulla parte superiore del vetrino.Per caricare la camera BTE sulla base BTE, posizionare la camera preparata sulla base con l'ugello della base BTE che sporge nella parte posteriore della camera. Caricare il campione sulla base BTE spostando l'adesivo bianco sulla clip NFC tag con un lento movimento circolare verso una Z sul lato destro della scatola finché la luce gialla non inizia a lampeggiare. Dopo aver attaccato il campione alla base, assicurarsi che la sacca del campione non abbia fori.Quindi posizionare l'O-ring sulla sacca del campione per fissarla alla parte anteriore dell'ugello BTE. Per caricare il set di siringhe inutilizzato, prima strappare il set di siringhe. Quindi posizionare il set di siringhe non utilizzato sulla torre della bilancia.Rimuovere il set di siringhe quando una luce rossa inizia a lampeggiare o la bilancia visualizza zero. Rimuovere lo stantuffo con il filtro dalla siringa assicurandosi che il fluido rimanga nella siringa inferiore. Posiziona lo stantuffo su un tovagliolo di carta o sulla torre, dove non tocca alcuna superficie.Infine, collegare la siringa alla porta di uscita del vetrino premendo la porta di uscita nella siringa e ruotandola di 90 gradi. Per iniziare a elaborare il campione di gemme, premere il pulsante nero in alto per avviare la macchina. Prendi un bastoncino di gemme dal sacchetto e inseriscilo nella parte superiore dell'ugello BTE.Afferra il bastoncino di gemme sull'altro lato della camera con l'altra mano e scendi lentamente nella lama. Muovi lentamente il bocciolo avanti e indietro mentre lo giri. Quando si sente un leggero ronzio, spostare il ramo più in profondità nella macchina per concentrarsi sul floema.Dopo aver completato lo stesso per tutti i rami, premere il pulsante nero in alto per interrompere l'elaborazione e attendere che la luce inizi a lampeggiare di nuovo in giallo. Per verificare il peso del campione, ruotare la siringa di 90 gradi e tirarla verso il basso. Riposizionare lo stantuffo sulla siringa e posizionare la siringa sulla torre.Dopo che la bilancia ha rilevato automaticamente il campione, un LED verde lampeggiante indica che il peso del campione rientra nell'intervallo corretto. Se la spia rossa lampeggia, indicando un peso del campione troppo basso, ripetere l'elaborazione del campione. Se il peso è troppo alto, rimuovere alcuni campioni e il lampeggio del LED giallo diventerà più lento.Per omogeneizzare il campione, rimuovere lo stantuffo dalla siringa contenente il campione. Spingere il fluido nella siringa e reinserire lo stantuffo. Spingere lo stantuffo per far passare il tampone e la linfa della pianta attraverso il filtro a rete attraverso il tubo di gomma nella siringa vuota.Mescolare il campione spingendo il tampone e la linfa della pianta avanti e indietro da tre a quattro volte da una siringa all'altra fino a quando il campione non si trasforma in un liquido verde omogeneo. Una volta ben omogeneizzato, spingere il campione di linfa vegetale nella siringa senza il filtro a rete e staccare il tubo di gomma e la siringa con il filtro. Quindi espellere il campione di linfa vegetale dalla siringa in una provetta sterile per microcentrifuga da due millilitri.Dopo aver etichettato il campione con il numero della sacca utilizzando un pennarello indelebile, conservarlo a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Disinfettare la camera rimovibile BTE dopo che il 10° campione è stato elaborato e il LED verde continua a lampeggiare invece di diventare blu. Per smontare la camera e pulire tutti i contaminanti, rimuovere il coperchio in plastica trasparente, il vetrino trasparente della camera e la porta di intasamento sul vetrino della camera.Quindi ruotare la valvola di rilascio dell'aria sul fondo della camera fino al segno del lucchetto aperto. Dopo aver posizionato i componenti della camera nel pulitore ad ultrasuoni di configurazione, posizionare la camera nella vasca da bagno con il coperchio sottostante per evitare che il coperchio galleggi. Far funzionare il pulitore ad ultrasuoni per 15 minuti.Sciacquare i componenti della camera a bagnomaria per almeno 30 secondi prima di spostare i componenti della camera nella stazione di asciugatura. Per iniziare l'asciugatura, posizionare la pistola ad aria compressa in linea con la scanalatura dell'apertura superiore della camera e premere il grilletto della pistola per erogare aria per circa 30 secondi. Ruotare la pistola ad aria compressa verso gli ugelli superiori della camera e, dopo aver premuto il grilletto, tracciare lentamente tre cerchi completi di ciascun ingresso dell'ugello.Posizionare la pistola ad aria compressa al centro del BTE e, partendo dal punto più interno, tenere premuto il grilletto e muoversi fino a quando la pistola ad aria compressa non punta verso il carrello. Fai scorrere rapidamente l'aria su tutta la camera davanti e dietro per far uscire l'acqua superficiale dall'esterno. Il confronto tra la BTE e il protocollo di laboratorio convenzionale per il trattamento dei tessuti di agrumi ha indicato che le concentrazioni di acido nucleico estratte determinate misurando l'assorbanza a 260 nanometri in entrambi i casi erano comparabili.La purezza degli acidi nucleici estratti dal BTE, determinata come rapporto tra le assorbanze a 260 e 280 nanometri, era elevata con una bassa contaminazione proteica. L'integrità dell'acido nucleico analizzata mediante RT-qPCR mirata all'mRNA del gene NADH deidrogenasi degli agrumi è risultata molto simile sia per la BTE che per il protocollo manuale standard. La procedura di laboratorio convenzionale richiedeva quasi 7-10 minuti per il taglio manuale per campione e più tempo per la lavorazione dei tessuti, compresa la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione.Tuttavia, il BTE ha processato ogni campione per un'estrazione di acido nucleico in tre minuti, comprese le fasi di preparazione, pesatura e pulizia. Nessuno dei 72 campioni sani provenienti dal primo trattamento dei campioni BTE ha prodotto curve di amplificazione per i patogeni degli agrumi testati, convalidando così il trattamento BTE del tessuto degli agrumi. Nella seconda elaborazione del campione BTE, con due campioni infetti da mix introdotti, gli acidi nucleici estratti hanno mostrato la presenza di diversi virus e viroidi degli agrumi nei lotti uno e cinque.Tuttavia, non è stata rilevata alcuna contaminazione incrociata tra le teste, né risultati falsi positivi o negativi. Durante la lavorazione, lasciare il ramo in un posto per troppo tempo potrebbe tagliare troppo in profondità nel ramo, aumentando le possibilità di intasamento e raccogliendo materiale fibroso acellulare. Una volta lavorato, il materiale è pronto per la maggior parte dei protocolli di estrazione e purificazione del DNA e dell'RNA e può essere testato con qualsiasi test di rilevamento molecolare per i patogeni delle piante.Lo sviluppo dell'estrattore di tessuti Budwood ha aperto le porte all'area ad alta produttività e alla vagliatura dell'intero boschetto. Insieme all'estrattore di tessuti fogliari, consente di lavorare su larga scala tessuti vegetali che in precedenza erano ritenuti difficili da elaborare, come radici e peduncoli.

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Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

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