Name: Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Impara l'isolamento e l'identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley per la rigenerazione pancreatica e le terapie contro il diabete.

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Gli autori sono grati all'Istituto messicano di sicurezza sociale (IMSS) e all'ospedale pediatrico del Messico, Federico Gomez (HIMFG) e allo staff Bioterio del Coordinamento della ricerca IMSS, per il supporto dato alla realizzazione di questo progetto. Ringraziamo il Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia per la borsa di studio AOC (815290) e Antonio Duarte Reyes per il supporto tecnico nel materiale audiovisivo.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite seguendo le linee guida messicane per la cura degli animali, basate sulle raccomandazioni dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio internazionale (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Messico). Il protocollo è stato rivisto, approvato e registrato dal Comitato etico per la ricerca sanitaria dell'Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Rimozione del tessuto adiposo dai ratti mediante resezione chirurgica
<ol><li>Preparare due provette coniche con 20 ml di soluzione sterile tamponata con fosfato tampone salino-antibiotico antimicotico (PBS-AA) (1x PBS, gentamicina [20 μg/ml] e amfotericina [0,5 μg/ml]) e mantenere su ghiaccio.</li>
	<li>Selezionare due ratti maschi adulti di Sprague Dawley (R. norvegicus) in buone condizioni di salute. Assicurarsi che i ratti abbiano tra i 3-4 mesi e abbiano un peso coporale di 350-450 g.</li>
	<li>Procedere alla sedazione con 20 mg/kg di xilazina cloridrato e, 5 minuti dopo, somministrare un anestetico con una dose di 120 mg/kg di ketamina cloridrato per via intraperitoneale. Lubrificare entrambi gli occhi con un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione. Quindi, confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale.</li>
	<li>Rasare e disinfettare la regione addominale e inguinale con una soluzione di iodio. Applicare teli chirurgici per mantenere la sterilità. Quindi, effettuare un'incisione longitudinale mediana dallo sterno alla regione testicolare.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto adiposo che circonda sia l'epididimo che i reni con una pinza sterile e posizionare nella soluzione 1x PBS-AA. Conservare i campioni sul ghiaccio.</li>
	<li>Suturare l'incisione chiusa se richiesto dalle linee guida istituzionali ed eutanasia gli animali con una dose intracardiaca di 40 mg/kg di pentobarbital di sodio. Una volta confermata la morte, smaltire la carcassa seguendo la procedura o le procedure istituzionali. NOTA: La morte provoca meccanismi di segnalazione che influenzano l'immunofenotipo, la capacità di differenziazione e l'effetto paracrino delle cellule mesenchimali. Quindi, la raccolta dei tessuti viene eseguita prima dell'eutanasia. </li>
</ol>2. Isolamento di cellule mesenchimali dal tessuto adiposo
<ol><li>Rimuovere il tessuto adiposo con una pinza sterile all'interno di un armadio di biosicurezza e posizionarlo su carta da filtro sterile in una piastra di Petri di 100 mm di diametro per assorbire il PBS in eccesso.</li>
	<li>Trasferire il tessuto adiposo in un'altra piastra di Petri ed eseguire tre lavaggi per 5 minuti ciascuno con 10 ml di soluzione 1x PBS-AA utilizzando una pipetta da 10 ml.</li>
	<li>Disaggregare meccanicamente il tessuto in frammenti di circa 1 cm2 usando forbici e bisturi.</li>
	<li>Preparare la collagenasi di tipo IV (0,075%) in 20 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) non integrato. Filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e conservare a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di collagenasi (20 ml) preparata al punto 2.4 in un becher di cristallo con il tessuto frammentato e una barra magnetica. Sigillare il contenitore e incubare sotto agitazione lenta e continua a 37 °C. NOTA: La digestione enzimatica richiede circa 90 minuti (mantenere una lenta agitazione per preservare l'integrità delle membrane cellulari).</li>
	<li>Filtrare l'omogenato attraverso un filtro in acciaio inossidabile, 40 mesh, apertura 0,38 mm su una piastra di Petri da 100 mm e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 50 ml.</li>
	<li>Aggiungere 20 ml di DMEM riscaldato e integrato (siero bovino fetale al 10% [FBS], 2 mM di glutammina, 2 mM di piruvato di sodio, 100x soluzione di aminoacidi non essenziali e 100x soluzione antibiotica antimicotica [AA]). Sospendere con attenzione la frazione vascolare stromale (SVE).</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 290 x g per 10 minuti, eliminare il surnatante con una pipetta da 25 ml e lavare delicatamente le cellule con 40 ml di un mezzo DMEM non integrato.</li>
	<li>Ripetere questo passaggio. Utilizzare un nuovo tubo conico sterile tra i passaggi per trascinare la minima quantità di detriti cellulari e grasso.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 5 ml di DMEM integrato con una pipetta da 5 ml e trasferire in un flacone T-25 cm2 . Incubare per 24 ore a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno seguente, eseguire tre lavaggi con 5 ml di 1x PBS-AA riscaldato e due lavaggi con DMEM non integrato per rimuovere i detriti cellulari e le cellule non aderenti. Aggiungere 5 ml di DMEM fresco, riscaldato e integrato con una pipetta da 5 ml e cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni.</li>
</ol>3. Mantenimento ed espansione delle colture primarie ASC
<ol><li>Una volta che le cellule raggiungono il 90% -100% di confluenza (8 ± 2 giorni), lavare due volte con 5 ml di DMEM non integrato. Aggiungere 1 mL di acido etilendiamminotetraacetico riscaldato allo 0,025% (EDTA) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Quando il monostrato cellulare è staccato, aggiungere 4 ml di DMEM integrato e disaggregare delicatamente la sospensione cellulare.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml, aggiungere 5 ml di DMEM riscaldato e integrato e sospendere delicatamente per omogeneizzare.</li>
	<li>Centrifugare a 290 x g per 5 min. Scartare il surnatante e mescolare delicatamente il pellet in 1 mL di DMEM integrato. Contare le cellule in una camera Neubauer dopo la colorazione con blu di Trypan.</li>
	<li>Infine, seminare 2,5 x 103 cellule/cm2 con un rapporto di divisione di 1:4 in boccette T-75. Questo passaggio garantisce la formazione di colonie e un alto tasso di proliferazione.</li>
</ol>4. Caratterizzazione morfologica di colture primarie ASC
<ol><li>Osservare la morfologia delle ASC al microscopio invertito. NOTA: Prima del montaggio per l'istologia e l'identificazione ASC, trattare i vetrini con una soluzione di gelatina all'1%. Irradiare con UV per 15 min.<ol><li>Rimuovere i vetrini di copertura dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarli asciugare per 5 minuti.</li>
		<li>Immergere i vetrini in una soluzione sterile di gelatina all'1%, scolarli e asciugarli a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Posizionare ogni coprivetrino in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e irradiare le piastre con luce UV per 15 minuti.</li>
		<li>Seminare una goccia contenente 25 x 103 cellule al centro del pozzetto, attendere 1 minuto e aggiungere 1 ml di mezzo DMEM integrato. Incubare per 96 ore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
		<li>Rimuovere il fluido ed eseguire tre lavaggi con 1x PBS-AA utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Aggiungere 1 ml di formalina neutra al 3,5% a ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a RT. Rimuovere con attenzione la formalina e aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 70% in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Sigillare la piastra con parafilm fino all'uso, per evitare l'essiccazione. NOTA: La morfologia cellulare delle ASC viene valutata anche mediante colorazione dell'ematossilina-eosina durante diversi passaggi.</li>
		<li>Rimuovere l'etanolo al 70% da ciascun pozzetto e idratare le cellule per 5 minuti con acqua distillata. Nel frattempo, filtrare le soluzioni coloranti.</li>
		<li>Rimuovere l'acqua e macchiare le cellule sotto lenta agitazione per 15 minuti con la soluzione di ematossilina di Harris.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione colorante ed eseguire due lavaggi con 1x PBS.</li>
		<li>Colorare le cellule con la soluzione di eosina sotto lenta agitazione per 1 minuto. Quindi, rimuovere la soluzione ed eseguire due lavaggi con 1x PBS.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione i coperchi da ciascun pozzetto e montare i vetrini su una goccia di soluzione di montaggio PBS-glicerolo (1: 1 v / v).</li>
		<li>Posizionare una linea di smalto per unghie attorno al coprivetrino e osservare i vetrini istologici al microscopio ottico.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Marcatori di espressione di ASCs mediante immunofluorescenza
<ol><li>Preparare il tampone di lavaggio contenente 1x PBS-0,05% Tween 20. Eseguire i lavaggi a RT e con agitazione lenta. Lavare le piastre tre volte con 2 ml di tampone/pozzetto (incubare per 3 minuti per ogni lavaggio).</li>
	<li>Introdurre 1 mL di reagente bloccante (1:10) e incubare agitando lentamente per 20 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL (diluizione 1:50) dei seguenti anticorpi primari a ciascun pozzetto: CD9 (topo monoclonale), CD34 (coniglio policlonale) e anti-CD63 (capra policlonale). Incubare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Lavare nuovamente le piastre tre volte e incubare con 200 μL (diluizione 1:50) dei seguenti anticorpi secondari: capra coniugata IgG FITC antitopo, capra anticapra IgG DyeLight 550 e capra anti coniglio IgG Cy3.</li>
	<li>Lavare tre volte con 1x PBS-0,05% Tween 20 e controcolorare i nuclei cellulari con 100 μL di DRAQ-7 (diluizione: 17 μL in 1 mL di acqua bidistillata) per 20 min.</li>
	<li>Lavare altre tre volte e montare i vetrini secondo i passaggi 4.1.12-4.1.13. Conservare i campioni al riparo dalla luce e congelati fino all'uso.</li>
	<li>Visualizza i campioni al microscopio confocale a epifluorescenza utilizzando le impostazioni e il software appropriati consigliati per questa apparecchiatura.</li>
</ol>6. Marcatori di espressione di ASCs mediante citometria a flusso
<ol><li>Regolare una sospensione di una singola cellula da cellule tripsinizzate o scongelate (sottopassaggi 3 o 4) ad una concentrazione di 1 x 106 cellule / ml di 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL con 100.000 cellule in provette da centrifuga da 1,5 ml. Utilizzare un'aliquota senza etichettatura per il controllo dell'autofluorescenza.</li>
	<li>Aggiungere a riposo tutte le quantità appropriate di Anti-CD105 AF-594 e Anti-CD31 AF-680, secondo le istruzioni del produttore. Incubare al buio per 20 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Lavare la macchia in eccesso con 1 mL di 1x PBS-5% FBS mediante centrifugazione a 250 x g per 5 minuti e sospendere in 300 μL di formalina all'1%.</li>
	<li>Eseguire l'acquisizione del campione su un citometro a flusso. La strategia di gating delle celle si basa su FSC-A vs. SSC-A gating, singole celle gated utilizzando SSC-H vs. SSC-A seguito da FSC-A vs. FSC-H.</li>
	<li>Utilizzare il rilevatore Y610-mCherry-A per CD105 AF-594 e R660-APC-A per CD31 AF-680.</li>
</ol>7. Differenziazione delle ASC nella linea adipogena
<ol><li>In una piastra a 6 pozzetti, seminare 1 x 10 4 cellule (P-4) per cm 2 e incubare a 37 °C, 5% CO2, fino alla confluenza del 60-80% (~72-96 h). Indurre la differenziazione, applicando direttamente al terreno di coltura: 4 μM di insulina, 1 μM di desametasone 21-acetato (Dxa) e 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Cambia il mezzo di differenziazione ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Preparare una soluzione madre di 800 μM di insulina in 2 ml di acqua ultrapura sterile (aggiungere 20 μL di 1 N HCl per garantire la completa dissoluzione) e conservare a -20 °C. Aggiungere 10 μL di scorte di insulina, precedentemente diluita 1:100, e applicare 10 μL ad un volume finale di 2 mL per pozzetto.</li>
	<li>Preparare una soluzione madre di 1 mM Dxa in 5 mL di acqua ultrapura sterile (notare che non si verifica la dissoluzione completa). Conservare a 4 °C. Aggiungere 40 μL/pozzetto di una diluizione 1:4 del brodo di Dxa.</li>
	<li>Preparare una scorta di 100 mM di MIX in 2,5 mL di 0,1 N NaOH, vortice, e aggiungere 40 μL di 1 N NaOH per la completa dissoluzione. Conservare a -70 °C. Aggiungere 10 μL/pozzetto di materiale MIX.</li>
	<li>Filtrare le soluzioni madre attraverso un filtro a siringa sterile da 0,22 μm prima della conservazione.</li>
	<li>Il giorno 12, lavare le cellule tre volte con 1x PBS e incubare con 500 μL di formalina al 4% per 1 ora a RT. Lavare ogni pozzetto due volte con acqua distillata seguita, con isopropanolo al 60% per 5 minuti e lasciare asciugare.</li>
	<li>Aggiungere lo 0,5% di olio rosso O diluito in isopropanolo al 60% (500 μL/pozzetto) e incubare per 20 minuti a RT. Lavare con 1 mL di acqua distillata tre volte e osservare al microscopio invertito. NOTA: per i reagenti, le attrezzature e i materiali richiesti, fare riferimento alla Tabella dei materiali.</li>
</ol>

Isolamento e caratterizzazione di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo

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<li>Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).</li>
<li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation%2C+characterization+and+expansion+of+human+adipose-derived+stem+cells+%28ASCs%29%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).</li>
<li>Yu, B., Zhang, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).</li>
<li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+human+adipose+stromal+cells%3A+localization%2C+morphology%2C+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li>
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<li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Negli ultimi quattro decenni dalla scoperta delle MSC, diversi gruppi di ricercatori hanno descritto procedure per ottenere MSC da diversi tessuti e specie. Uno dei vantaggi dell'utilizzo dei ratti come modello animale è la loro facile manutenzione e il rapido sviluppo, nonché la facilità di ottenere MSC dal tessuto adiposo. Diverse fonti tissutali sono state descritte per ottenere ASC, come il grasso viscerale, perirenale, epididimico e sottocutaneo 12,13,14,15,16.</s...

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno fortemente influenzato la medicina rigenerativa grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento, proliferazione, migrazione e differenziazione in diverse linee cellulari 1,2. Attualmente, una grande quantità di ricerca si sta concentrando sul loro potenziale per il trattamento e la diagnosi di varie malattie.
Esistono diverse fonti di cellule mesenchimali: midollo osseo, muscolo scheletrico, liquido amniotico, follicoli piliferi, placenta e tessuto adiposo, tra gli altri. Sono ottenuti da diverse specie, tra cui esseri umani, topi, ratti, cani e cavalli3. Le MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) sono state utilizzate per molti anni come fonte importante di cellule staminali nella medicina rigenerativa e come alternativa all'uso di cellule staminali embrionali4. Tuttavia, le MSC di derivazione adiposa, o cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC), sono un'alternativa importante con grandi vantaggi grazie alla loro facilità di raccolta e isolamento, nonché alla resa di cellule ottenute per grammo di tessuto adiposo 5,6. È stato riportato che il tasso di raccolta degli ASC è generalmente superiore a quello dei BMSC7. Inizialmente è stato proposto che la capacità riparativa/rigenerativa delle ASC fosse dovuta alla loro capacità di differenziarsi in altre linee cellulari8. Tuttavia, la ricerca negli ultimi anni ha rafforzato il ruolo primario dei fattori paracrini rilasciati dalle ASC nel loro potenziale riparativo 9,10.
Il tessuto adiposo (AT), oltre ad essere una riserva energetica, interagisce con i sistemi endocrino, nervoso e cardiovascolare. È anche coinvolto nella crescita e nello sviluppo postnatale, nel mantenimento dell'omeostasi dei tessuti, nella riparazione e nella rigenerazione dei tessuti. L'AT è composto da adipociti, cellule muscolari lisce vascolari, cellule endoteliali, fibroblasti, monociti, macrofagi, linfociti, preadipociti e ASC. Questi ultimi hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa della loro bassa immunogenicità11,12. Le ASC possono essere ottenute mediante digestione enzimatica e lavorazione meccanica o mediante espianti di tessuto adiposo. Le colture primarie di ASC sono facili da mantenere, coltivare ed espandere. La caratterizzazione fenotipica delle ASC è essenziale per verificare l'identità delle cellule valutando l'espressione di specifici marcatori di membrana utilizzando metodi quali l'immunofluorescenza e la citometria a flusso13. L'International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e l'International Society for Cellular Therapy (ISCT) hanno definito che le ASC esprimono CD73, CD90 e CD105, mentre mancano dell'espressione di CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR14. Questi marcatori, sia positivi che negativi, sono quindi considerati affidabili per la caratterizzazione delle ASC.
Questo progetto si è concentrato sulla descrizione di una procedura per l'isolamento e l'identificazione di cellule mesenchimali adulte estratte dall'AT dei ratti, poiché questa fonte di cellule non presenta sfide etiche, a differenza delle cellule staminali embrionali. Ciò consolida la procedura come un'opzione praticabile a causa della facilità di accesso e del metodo minimamente invasivo rispetto alle cellule staminali derivate dal midollo osseo. 
Le cellule mesenchimali provenienti da questa fonte tissutale hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa delle loro capacità immunomodulatorie e del basso rigetto immunitario. Pertanto, il presente studio è una parte fondamentale della ricerca futura sul loro secretoma e sulla loro applicazione come terapia rigenerativa in diverse malattie, comprese le malattie metaboliche come il diabete.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>HyClone</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Sartorius</td><td>AX224</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD9 (C-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-13118</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD34 (C-18)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-7045</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-C63</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-5275</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18838A594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18916AF680</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Capra anti-rabbia IgG (H+L) Cy3 </td><td>Novus</td><td>NB 120-6939</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Asino anti-capra IgG (H+L) DyLight 550 </td><td>Invitrogen</td><td>SA5-10087</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo IgG FITC capra coniugata F (ab&acute;)</td><td>Sistemi RD.</td><td>No. F103B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per flaconi Sterile</td><td>CORNING</td><td>10718003</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per colture cellulari e tissutali</td><td>BIOFIL</td><td>170718-312B</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule Ematocitometro a linea chiara con vetrini per camera di conteggio delle cellule</td><td>SIGMA Aldrich </td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Pozzetti per cellule: 6 pozzetti con coperchio</td><td>CORNING</td><td>25810</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> <td>coniche per centrifugaHeTTICH</td><td>ROTANA460R</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga eppendorf</td><td>Fischer Scientific</td><td>M0018242_44797</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV </td><td>Worthington</td><td>LS004186</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>SPL Life Science</td><td>43112</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura</td><td>Greiner Bio-One </td><td>191180</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert 2.0</td><td>Beckman Coulter</td><td>Versione</td><td></td> gratuita</tr><tr><td>Citometro CytoFlex LX</td><td>Beckman Coulter</td><td>FLOW-2463VID03.17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA Aldrich</td><td> 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>DraQ7 Dye</td><td>Thermo Sc. </td><td>D15106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosina giallastra</td><td>Hycel</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon 15 mL</td><td>Greiner Bio-One </td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon 50 mL</td><td>Greiner Bio-One </td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino </td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>128111163</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>GIBCO</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>Glicerina-Alta Purezza</td><td>Herschi Trading </td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>AMRESCO </td><td>0701-25G</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 Incubatore </td><td>Thermo Sc.</td><td></td><td></td>50116047</tr><tr><td>Ketamin Pet (ketamina cloridrate)</td> <td>Aranda</td><td>SV057430</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina </td><td>GIBCO / Thermo Sc. </td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Software LSM Zen 2009 V5.5</td><td></td><td>Versione</td><td></td>gratuita</tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica Classe II</td><td>NuAire</td><td>12082100801</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente </td><td>Zeiss Axiovert 100M</td><td>21.0028.001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito </td><td>Olympus CK40</td><td>CK40-G100 </td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali 100X</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette 2 mL </td><td>Sarstedt </td><td>72695400</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette 1,5 mL</td><td>Sarstedt </td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 0,2-2 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>E97743</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2-20 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>F54167</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20-200 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>G32419</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100-1000 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>FJ39895</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto liquido</td><td>Taylor-Wharton</td><td>681-021-06</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>SLBC3029V</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Streptomicina </td><td>GIBCO / Thermo Sc. </td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Piastra di Petri Coltura cellulare</td><td>CORNING Inc</td><td>480167</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-03-201</td><td></td></tr><tr><td>Pisabental (pentobarbital sodico)</td><td>PISA Agropecuaria</td><td>Q-7833-215</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio </td><td>J.T.Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>J.T Baker</td><td>2139900</td><td></td></tr><tr><td>S1 Pipette Filler</td><td>Thermo Sc</td><td>9531</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica 5 mL</td><td>PYREX</td><td>L010005</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica 10 mL</td><td>PYREX</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>J.T Baker</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio </td><td>J.T.Baker</td><td>15368426</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico anidro</td><td>J.T Baker</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>GIBCO BRL</td><td>11840-048</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Sterile</td><td>CORNING</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>PerkinElmer Lambda 25</td><td>L6020060</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre per titoli</td><td>LAB-LINE</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Samco/Thermo Sc</td><td>728NL</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue colorante</td><td>GIBCO</td><td>1198566</td><td></td></tr><tr><td>tripsina dal pancreas suino</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>102H0234</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante universale 10x</td><td>BioGenex</td><td>HK085-GP</td><td></td></tr><tr><td>Xilapet 2% (xilazina cloridrato)</td><td>Pet' s Pharma</td><td>Q-7972-025</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti sprague dawley

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Le cellule mesenchimali adulte hanno rivoluzionato la biologia molecolare e cellulare negli ultimi decenni. Possono differenziarsi in diversi tipi di cellule specializzate, oltre alla loro grande capacità di auto-rinnovamento, migrazione e proliferazione. Il tessuto adiposo è una delle fonti meno invasive e più accessibili di cellule mesenchimali. È stato anche segnalato per avere rese più elevate rispetto ad altre fonti, così come proprietà immunomodulatorie superiori. Recentemente sono state pubblicate diverse procedure per ottenere cellule mesenchimali adulte da diverse fonti tissutali e specie animali. Dopo aver valutato i criteri di alcuni autori, abbiamo standardizzato una metodologia applicabile a scopi diversi e facilmente riproducibile. Un pool di frazione vascolare stromale (SVF) proveniente da tessuto adiposo perirenale ed epididimo ci ha permesso di sviluppare colture primarie con morfologia e funzionalità ottimali. Le cellule sono state osservate aderire alla superficie plastica per 24 ore e hanno mostrato una morfologia simile ai fibroblasti, con prolungamenti e tendenza a formare colonie. Sono state utilizzate tecniche di citometria a flusso (FC) e immunofluorescenza (IF) per valutare l'espressione dei marcatori di membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. La capacità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) di differenziarsi nella linea adipogena è stata valutata anche utilizzando un cocktail di fattori (4 μM di insulina, 0,5 mM di 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM di desametasone). Dopo 48 ore, è stata osservata una graduale perdita della morfologia fibroblastoide e, a 12 giorni, è stata confermata la presenza di goccioline lipidiche positive alla colorazione rosso olio. In sintesi, viene proposta una procedura per ottenere colture ASC ottimali e funzionali per l'applicazione in medicina rigenerativa.

Il tessuto adiposo è stato ottenuto da ratti adulti Sprague Dawley di età compresa tra 3 e 4 mesi e con un peso corporeo di 401 ± 41 g (media geometrica ± DS). Un valore medio di 3,8 g di tessuto adiposo epididimo e perirenale corrispondeva all'analisi di 15 estrazioni sperimentali. Dopo 24 ore di coltura, le popolazioni cellulari sono rimaste aderenti alla superficie plastica e hanno mostrato una morfologia eterogenea. Il primo passaggio è stato realizzato a 8 ± 2 giorni, con una resa di 1,4 ± 0,6 x 106 celle...

Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.

Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Le cellule staminali mesenchimali hanno un ruolo molto ampio nella comunicazione cellulare a causa della loro funzione paracrina. Questo protocollo ottiene cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa con funzionalità morfologiche, immunofenotipiche e adeguate da utilizzare nello studio di terapie per la rigenerazione pancreatica e il diabete. C'è stato un aumento dell'uso di terapie cellulari nel trattamento del diabete.Queste terapie includono trapianti allogenici di cellule pancreatiche, prodotti derivati da cellule staminali autologhe di cellule produttrici di insulina e tessuto pancreatico stampato in 3D utilizzando inchiostri biologici. La maggior parte delle ricerche ha studiato principalmente i componenti del secretoma e il ruolo nella regolazione di diversi processi cellulari. Nuove tecniche come i microarray e il sequenziamento di prossima generazione possono studiare la funzione dei miRNA.Una sfida in quest'area è quella di ottenere una maggiore stimolazione delle cellule mesenchimali, raggiungendo una precisa composizione molecolare nel secretoma e indirizzandolo al trattamento di una condizione specifica. Valuteremo come un miRNA contribuisce alla degenerazione del tessuto pancreatico esposto allo stress ossidativo. Lo studio comporterà l'utilizzo di cellule staminali dal tessuto adiposo.

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Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule staminali derivate dalla cresta neurale (ADSC) derivate da creste neurali marcate in modo fluorescente da tessuto adiposo dell'arco periaortico murino. Dopo l'isolamento, le NCADSC vengono rilevate, selezionate utilizzando la smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza e successivamente coltivate su una piastra, promuovendo la proliferazione cellulare.

Isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa da tessuto adiposo periaortico murino

Questo protocollo descrive una tecnica di isolamento per ottenere cellule mesenchimali stromali residenti polmonare primaria da ratti, attraverso l'uso di digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità, aderenza plastica e CD146 + selezione perlina magnetica.

Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa di maiale (pADSC) da tessuti adiposi sottocutanei con esame della multipotenza. I pADSC multipotenti vengono utilizzati per delineare i processi di differenziazione degli adipociti e studiare la transdifferenziazione in più linee cellulari di mesenchima mesodermico o ulteriori linee di ectoderma ed endoderma per studi rigenerativi.

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Questo protocollo fornisce un metodo privo di enzimi per isolare le cellule staminali mesenchymal da campioni di abdominoplastica e lipoaspirati utilizzando un metodo explant. L'assenza di enzimi duri o passaggi di centrifugazione prevede cellule staminali clinicamente rilevanti che possono essere utilizzate per studi in vitro o trasferite di nuovo alla clinica.

Un metodo privo di enzimi per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali mesenchimale derivate dall'Adipo

In questo articolo, descriviamo l'isolamento delle cellule staminali derivate dal macaco rhesus (ADSC) utilizzando un protocollo di digestione enzimatica dei tessuti. Successivamente, descriviamo la proliferazione ADSC che include il distacco cellulare, il conteggio e la placcatura. Infine, la differenziazione dell'ADSC è descritta utilizzando specifici agenti induttori adipogeni. Inoltre, descriviamo le tecniche di colorazione per confermare la differenziazione.

Isolamento, proliferazione e differenziamento di cellule staminali derivate dall'adiposio del macaco rhesus

Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere una potenziale fonte di MSC che si differenziano in cellule produttrici di insulina (IPC). In questo protocollo, forniamo passaggi dettagliati per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC epididimali di ratto, seguiti da un protocollo semplice e breve per la generazione di IPC dallo stesso Rat Ad-MSCs.

Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina

Il tessuto adiposo è un'ottima fonte di cellule staminali mesenchimali. Qui, portiamo l'estrazione, la coltivazione e la caratterizzazione passo dopo passo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) da topi svizzeri tessuto adiposo epididimale.

Isolamento, espansione in vitro e caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo epididimo di topo

Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del &gt;90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.

Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.

L&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate

Impara l'isolamento e l'identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley per la rigenerazione pancreatica e le terapie contro il diabete.

Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

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