Name: Saggi indipendenti dallossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Scopri saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nelle cellule di mammiferi in condizioni di ipossia. Questi metodi utilizzano spettrometria di massa e tracciamento con isotopi stabili per analizzare i metaboliti.

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Tracciamento di isotopi stabili e analisi LC-MS per misurare le attività di DHODH e SDH

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<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
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<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
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<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
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<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
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<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
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<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da segnalare.

Poiché la ricerca emergente dimostra che i mitocondri dei mammiferi possono funzionare senza consumare ossigeno molecolare, è della massima importanza per i ricercatori impiegare saggi ortogonali, oltre alle misurazioni OCR, per quantificare con precisione la funzione mitocondriale. Qui, abbiamo compilato una serie di saggi che possono essere utilizzati per valutare direttamente le attività del complesso I, complesso II, complesso V e DHODH misurando l'equilibrio mitocondriale NAD + / NADH, l'utilizzo di accettori di elettroni terminali adattivi, la produzione di ATP, la biosintesi de novo pirimidina e ROS derivato dai mitocondri. In particolare, questi test misurano più direttamente la funzione mitocondriale rispetto alle misurazioni OCR. Inoltre, questi saggi forniscono ai ricercatori modi trattabili per quantificare la funzione mitocondriale durante l'ipossia, per la quale le misurazioni OCR sono in gran parte irrilevanti a causa del fumarato utilizzato come accettore di elettroni terminale preferito. Infine, i metodi basati sulla proliferazione qui descritti sono più convenienti rispetto ai classici esperimenti di respirometria, fornendo così un modo ampiamente accessibile per studiare la funzione mitocondriale nei sistemi dei mammiferi.
Ci sono considerazioni chiave quando si utilizzano questi saggi per misurare la funzione mitocondriale nelle cellule in coltura. Per quanto riguarda i saggi di proliferazione, è importante regolare il numero di cellule seminate per il tasso di raddoppio di ciascuna linea cellulare. Le cellule dovrebbero essere seminate ad almeno il 10% di confluenza e con spazio sufficiente per consentire tre o quattro raddoppi in modo che le differenze di proliferazione possano essere quantificate. Un'altra considerazione per ogni test è la concentrazione delle piccole molecole utilizzate come controlli per le attività di ciascun complesso ETC. Poiché diverse linee cellulari possono mostrare sensibilità diverse a questi inibitori, è fondamentale testare la dose di queste piccole molecole per identificare la concentrazione ottimale.
Una limitazione universale dei saggi che studiano la funzione mitocondriale in vitro, comprese le misurazioni OCR e tutti i saggi qui descritti, è la composizione metabolica del terreno di coltura. Il terreno di coltura cellulare standard tende a polarizzare i sistemi in livelli superficialmente elevati di funzione mitocondriale. Ad esempio, i livelli soprafisiologici di glutammina aumentano la sua anaplerosi del ciclo TCA25, che alimenta la sintesi mitocondriale di NADH e, di conseguenza, aumenta la fosforilazione ossidativa. Allo stesso modo, la pressione parziale dell'ossigeno varia tra 3 mmHg e 100 mmHg (circa 0,1%-13% O2) nei tessuti dei mammiferi, ma è atmosferica (140 mmHg, circa il 21%) in vitro26,27. Questo eccesso di O2 massimizza la capacità respiratoria mitocondriale e la produzione di superossido28. Recentemente, sono stati fatti sforzi per progettare terreni di coltura per essere più fisiologici29,30. In particolare, la coltura di cellule in terreni simili al plasma umano diminuisce la respirazione mitocondriale in alcune linee cellulari tumorali30, i ROS mitocondriali nelle cellule T 31 e gli adattamenti mitocondriali alle terapie antitumorali32. Pertanto, è fondamentale essere consapevoli della composizione dei terreni di coltura utilizzati e capire come può influire sulla funzione mitocondriale.
Un'altra limitazione importante e universale nell'interpretazione della funzione mitocondriale è il potenziale di differenze nel numero di mitocondri. È quindi fondamentale misurare il contenuto mitocondriale attraverso la quantificazione del mtDNA33, la misurazione della massa mitocondriale con coloranti insensibili al potenziale di membrana34 o il western blotting dei marcatori mitocondriali. Questo è un controllo critico in modo che una diminuzione del numero di mitocondri non venga scambiata per una diminuzione della funzione mitocondriale.
Esistono anche limitazioni specifiche e risoluzione dei problemi che si applicano ai test descritti qui. In primo luogo, dato che le cellule differenziate non proliferano, i saggi basati sulla proliferazione non saranno utili per valutare la funzione mitocondriale in questo contesto. Una limitazione chiave del protocollo di tracciamento 13C 4-aspartato per misurare l'attività DHODH è che l'assorbimento di aspartato nelle cellule può essere estremamente inefficiente35. Per superare questa potenziale limitazione, i ricercatori possono sovraesprimere il trasportatore dell'aspartato, SLC1A3, per facilitare l'assorbimento di 13C 4-aspartato35.
Una limitazione del protocollo che utilizza il tracciamento di 13C 5-glutammina per misurare l'attività SDH è che questo test richiede alle cellule di utilizzare la via di carbossilazione riduttiva per arricchire gli isotopologhi M + 3 al fine di misurare l'attività inversa. Alcune linee cellulari sono incapaci di flusso di carbossilazione riduttivo a causa della bassa espressione di ATP citrato liasi36, insufficiente stabilizzazione HIF 37 o un rapporto α-KG:citrato troppo basso38. Per superare questa limitazione, si potrebbe utilizzare il tracciamento 13C 4-aspartato per misurare le attività SDH avanti e indietro7. In questo test, l'attività diretta dell'SDH può essere misurata dal rapporto tra il fumarato M+2:succinato M+2 e la reazione inversa del succinato M+4:fumarato M+4. In particolare, questo tracciamento aggira la maggior parte degli enzimi nella via di carbossilazione riduttiva.
Una limitazione del complesso test di attività I che utilizza la riduzione DCPIP come lettura è che i mitocondri non sono strutturalmente intatti. Il processo di congelamento-scongelamento dei mitocondri per consentire il loro assorbimento di NADH per il test può certamente offuscare l'integrità strutturale della membrana mitocondriale39. Questo test deve essere eseguito in parallelo con saggi come il saggio di proliferazione del complesso I per garantire che i cambiamenti nell'attività del complesso I osservati siano veri anche con cellule intatte.
In studi futuri, alcune di queste tecniche possono essere adattate per misurare le funzioni mitocondriali in vivo utilizzando organismi modello come topi e Caenorhabditis elegans. Gli attuali metodi utilizzati per misurare la funzione mitocondriale in vivo sono centrati sull'OCR a livello di organismo, in particolare sul tasso di scambio respiratorio quando si utilizzano modelli murini. Una chiara limitazione di questo metodo è che l'ossigeno svolge molte funzioni biochimiche e di segnalazione al di là del suo ruolo di onnipresente accettore di elettroni terminali nell'ETC mitocondriale. Ad esempio, l'ossigeno viene "consumato" dall'attività catalitica degli enzimi della famiglia delle diossigenasi. Sebbene questi enzimi contribuiscano al tasso di consumo di ossigeno cellulare, non partecipano, regolano o riflettono la funzione mitocondriale. Gli esperimenti di respirometria classica in vitro controllano tipicamente l'"OCR non mitocondriale", mentre gli esperimenti sul rapporto di scambio respiratorio (RER) dell'organismo non possono controllare questo, limitando l'interpretazione della RER come metrica per la funzione mitocondriale in vivo. Tuttavia, è possibile adattare i protocolli per misurare l'attività del DHODH tramite il tracciamento di 13 C 4-aspartato, l'attività del complesso II tramite il tracciamento della 5-glutammina 13C, l'attività del complesso I sui mitocondri purificati dai tessuti e i ROS mitocondriali utilizzando composti compatibiliLC-MS come MitoB per misurare la funzione mitocondriale in vivo . Questi saggi diretti per interrogare le funzioni mitocondriali, in combinazione con i classici esperimenti di respirometria, forniscono ai ricercatori una valutazione più completa e accurata della funzione mitocondriale nelle cellule e nei tessuti dei mammiferi.

La funzione mitocondriale è una metrica critica della salute cellulare, in quanto sostiene le principali funzioni biosintetiche, bioenergetiche e di segnalazione nelle cellule di mammifero1. La stragrande maggioranza delle funzioni mitocondriali richiede il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) e le interruzioni del flusso di elettroni nell'ETC causano gravi malattie mitocondriali2. L'ETC è composto da una serie di reazioni di riduzione e ossidazione (redox) che sono incorporate nella membrana mitocondriale interna e queste reazioni di trasferimento di elettroni rilasciano energia libera che può essere sfruttata per supportare la sintesi di ATP, processi fisiologici come la termogenesi, vie biosintetiche come la biosintesi de novo delle pirimidine e l'equilibrio dello stato redox di co-fattori come il NADH. I complessi I e III di ETC producono specie reattive dell'ossigeno (ROS)3,4,5, che, a loro volta, regolano le vie chiave di segnalazione come HIF, PI3K, NRF2, NFκB e MAPK 6. Di conseguenza, le metriche del flusso di elettroni nell'ETC sono classicamente utilizzate come proxy per la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero.
Gli esperimenti di respirometria sono frequentemente impiegati per misurare la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero. Poiché O2 è l'accettore di elettroni terminale più diffuso per l'ETC dei mammiferi, la sua riduzione viene utilizzata come proxy per la funzione mitocondriale. Tuttavia, prove emergenti dimostrano che i mitocondri dei mammiferi possono impiegare il fumarato come accettore di elettroni per sostenere le funzioni mitocondriali che dipendono dall'ETC, tra cui la biosintesi de novo della pirimidina 7, l'ossidazione del NADH7 e la disintossicazione dell'idrogeno solforato8. Pertanto, in alcuni contesti, specialmente in ambienti ipossici, le misurazioni del tasso di consumo di O2 (OCR) non forniscono un'indicazione precisa o accurata della funzione mitocondriale.
Qui, delineiamo una serie di saggi che possono essere impiegati per misurare la funzione mitocondriale indipendentemente dall'OCR. Forniamo saggi per misurare direttamente l'ossidazione complessa del NADH I-mediata, la biosintesi de novo pirimidina mediata dalla diidroorotato deidrogenasi, la sintesi complessa di ATP V-dipendente, la direzionalità netta del complesso succinato deidrogenasi (SDH) e i ROS derivati dai mitocondri. Questi test sono pensati per essere eseguiti su cellule di mammifero in coltura, anche se molti possono essere adattati per studiare le funzioni mitocondriali in vivo. In particolare, i saggi descritti in questo protocollo sono misurazioni più dirette delle funzioni mitocondriali rispetto all'OCR. Inoltre, consentono la misurazione della funzione mitocondriale nell'ipossia, un contesto in cui l'OCR non è una misurazione indicativa. Nel loro insieme, questi test, in combinazione con i classici esperimenti di respirometria, forniranno ai ricercatori una valutazione più completa della funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Provetta da 1,5 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>provetta da 2,0 mL</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti</td><td>Cell Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutammine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>piatto per coltura tissutale da 150 mm</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- diclorofenolindofenolo</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per bottiglie 500 mL, 0,22 e micro; m, PES 9 Diametro della membrana 9 mm</td><td>Cell Treat</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Cold Trap</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore completo della proteasi Compresse</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Coulter Counter Cups</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubichinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Gibco senza glucosio</td><td></td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM senza glutammina</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grado 35% idrossido</td> <td>di ammonioThermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio di grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico di grado HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo di grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>MeOH di grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Acqua di</tr><tr><td>grado HPLC</td><td>900688 Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di osteosarcome umano 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampone isotonico</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Rosso</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Matita Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Grinder per tessuti, misura 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Terreni DMEM privi di piruvato</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa Exactive Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver Incubatore</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto da banco Centrivap refrigerato</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; m 150 x 2,1 mm colonna analitica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC kit di protezione</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, pellet</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di terz-butile idroperossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coltro Conteggio e dimensione delle particelle analizzatore</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Il flusso di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (ETC) supporta funzioni biosintetiche, bioenergetiche e di segnalazione multiformi nelle cellule di mammifero. Poiché l'ossigeno (O 2) è l'accettore di elettroni terminale più diffuso per l'ETC dei mammiferi, il tasso di consumo di O2 viene spesso utilizzato come proxy per la funzione mitocondriale. Tuttavia, la ricerca emergente dimostra che questo parametro non è sempre indicativo della funzione mitocondriale, poiché il fumarato può essere impiegato come accettore di elettroni alternativo per sostenere le funzioni mitocondriali nell'ipossia. Questo articolo compila una serie di protocolli che consentono ai ricercatori di misurare la funzione mitocondriale indipendentemente dal tasso di consumo di O2. Questi test sono particolarmente utili quando si studia la funzione mitocondriale in ambienti ipossici. In particolare, descriviamo metodi per misurare la produzione mitocondriale di ATP, la biosintesi de novo delle pirimidine, l'ossidazione del NADH da parte del complesso I e la produzione di superossido. In combinazione con i classici esperimenti di respirometria, questi saggi ortogonali ed economici forniranno ai ricercatori una valutazione più completa della funzione mitocondriale nel loro sistema di interesse.

Le attività di DHODH, complesso I e complesso V possono essere valutate utilizzando saggi di proliferazione. Dopo la privazione di uridina dal terreno di coltura, le cellule diventano più dipendenti dalla via de novo per la biosintesi della pirimidina. Pertanto, quando le cellule sono state sfidate a proliferare in un mezzo privo di uridina, erano più sensibili all'inibizione dell'attività di DHODH da parte di brequinar rispetto alle cellule coltivate in un mezzo contenente uridina (Figura 6A). Allo stesso modo, la privazione di piruvato dal terreno di coltura rende le cellule più dipendenti dall'attività complessa I per la proliferazione. Pertanto, quando le cellule sono state sfidate a proliferare in un mezzo privo di piruvato, erano più sensibili all'inibizione dell'attività del complesso I da parte del rotenone rispetto alle cellule coltivate in un mezzo contenente piruvato (Figura 6B). L'attività V complessa può essere valutata sfidando le cellule a proliferare in un mezzo contenente galattosio anziché glucosio. Poiché il galattosio produce ATP netto zero nella glicolisi, le cellule che crescono in questo combustibile dipendono maggiormente dalla sintesi di ATP mitocondriale attraverso l'attività V complessa. Pertanto, le cellule proliferanti in un mezzo contenente galattosio erano più sensibili all'inibizione del complesso V da parte dell'oligomicina rispetto alle cellule che proliferavano in un mezzo contenente glucosio (Figura 6C).
L'attività SDH può essere misurata utilizzando il tracciamento di 13C 5-glutammina e monitorando la sua incorporazione negli isotopologhi del fumarato e del succinato. In condizioni trattate con veicolo, il complesso SDH ha favorito l'attività in avanti e l'incorporazione di 13 C 4-succinato in 13 C4-fumarato è stata superiore all'incorporazione di 13 C 3-fumarato in 13C 3-succinato (Figura 7). In condizioni trattate con antimicina, il complesso SDH ha favorito l'attività inversa e l'incorporazione di 13 C 3-fumarato in 13 C3-succinato è stata maggiore dell'incorporazione di 13 C 4-succinato in 13C 4-fumarato (Figura 7).
La produzione di superossido all'interno dei mitocondri può essere misurata utilizzando il reporter fluorescente MitoSox, che genera 2-idrossi-mitoethidium dopo reazione con superossido. In questo studio, le cellule trattate con MitoSox in presenza di perossido di idrogeno terbutile avevano livelli più elevati di 2-idrossi-mitoethidium in un modo che è stato soppresso dall'aggiunta di NAC, un antiossidante che estingue i ROS cellulari (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Figura 1: Basi meccanicistiche per il saggio di proliferazione V complessa. Ossidazione del glucosio e del galattosio tramite glicolisi. Il glucosio produce due ATP netti dalla glicolisi, mentre il galattosio produce ATP netto zero perché la sintesi di UTP è necessaria per UDP-galattosio. Pertanto, le cellule coltivate nel galattosio sono più dipendenti dalla sintesi mitocondriale di ATP a causa della mancanza di ATP prodotta dalla glicolisi. Abbreviazioni: GALK = galattochinasi; GALT = galattosio-1-fosfato uridiltransferasi; PGM1 = fosfoglucomutasi 1; GPI = glucosio-6-fosfato isomerasi, UGP = UDP-glucosio pirofosforilasi; GALE = UDP-galattosio-4-epimerasi; NDK = nucleotide difosfato chinasi; UMPK = uridina monofosfato chinasi; HK = esochinasi; PFK = fosfofruttochinasi; ALDO = aldolasi; TPI = triosefosfato isomerasi; GAPDH = gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi; PGK = fosfoglicerato chinasi; PGM = fosfoglucomutasi; ENO = enolasi; PK = piruvato chinasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Figura 2: Basi meccanicistiche per il saggio di proliferazione I complessa. Schema delle vie metaboliche che vengono alterate in seguito all'inibizione dell'attività I complessa. Nei mezzi ad alto contenuto di piruvato, l'inibizione del complesso I viene bypassata tramite ossidazione del NADH mediata da LDH. Nei mezzi a basso contenuto di piruvato, questo adattamento è meno fattibile, rendendo le cellule più dipendenti dall'attività del complesso I per riossidare il NADH. Abbreviazioni: LDH = lattato deidrogenasi; Ciclo TCA = ciclo dell'acido tricarbossilico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Figura 3: Schema della reazione DHODH sul tracciato di 4-aspartato 13C. Brequinar inibisce l'ossidazione del diidroorotato a orotato, impedendo così la sintesi a valle di UMP. 13Il 4-aspartato C è incorporato in 13C3-UMP tramite attività DHODH. Abbreviazioni: OMM = membrana mitocondriale esterna; IMM = membrana mitocondriale interna; DHODH = diidroorotato deidrogenasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Figura 4: Misurazione dell'attività II del complesso 13C5. Per misurare l'attività del complesso II (a sinistra), viene monitorata l'incorporazione di 13 C 5-glutammina in 13 C 4-succinato e 13C 4-fumarato. Per misurare l'attività inversa del complesso II (a destra), viene monitorata l'incorporazione di 13 C 5-glutammina in 13 C 3-succinato e 13C 3-fumarato. Abbreviazioni: SDH = succinato deidrogenasi; CytC = citocromo C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Figura 5: Reazione di MitoSox Red con superossido. La reazione di MitoSox con superossidi mitocondriali per formare 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Figura 6: Saggi basati sulla proliferazione per misurare la funzione mitocondriale (A) Proliferazione di cellule di osteosarcoma 143B trattate con 5 uM brequinar, un inibitore del DHODH, in mezzo con ±100 ug/mL di uridina. I dati sono medi ± SEM; N = 3 per condizione. (B) Proliferazione di cellule di osteosarcoma 143B trattate con rotenone 2 uM, un inibitore del complesso I, in terreno con ±5 mM di piruvato. I dati sono medi ± SEM; N = 3 per condizione. (C) Proliferazione di cellule di osteosarcoma 143B trattate con l'oligomicina 5 uM, un inibitore V complesso, in mezzo con 10 mM di glucosio o 10 mM di galattosio come unica fonte centrale di carbonio. I dati sono medi ± SEM; N = 3 per condizione. * indica p &lt; 0,05 utilizzando un test ANOVA unidirezionale in Graphpad Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Figura 7: 13C 5-glutammina tracciante per misurare l'attività del complesso II. Ossidazione del succinato e riduzione del fumarato (SDH reverse) in DMSO e cellule Caki1 e DLD1 trattate con antimicina A 500 nM. I dati rappresentano la media ± SEM; N = 3 per condizione. indica p &lt; 0,05 utilizzando un t-test spaiato in GraphPad Prism. Abbreviazioni: SDH = ossidazione del succinato; SDH inverso = riduzione del fumarato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Figura 8: Saggio MitoSox basato su LCMS per rilevare il superossido. Cromatogramma ionico estratto di 2-OH-Mito E2+ isolato da cellule Caki1 trattate con MitoSox per 30 minuti in presenza di tBuOOH ± NAC. Abbreviazioni: LCMS = cromatografia liquida-spettrometria di massa; NAC = N-acetil cisteina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella 1: Composizione dei reagenti, dei tamponi e dei mezzi utilizzati in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

La nostra ricerca si concentra su come i mitocondri percepiscono e si adattano ai fattori di stress metabolico. Un fattore di stress metabolico chiave è l'ipossia, che si verifica quando le cellule sono affamate di ossigeno. Stiamo sviluppando saggi migliori per studiare la funzione mitocondriale in ambienti a basso contenuto di ossigeno.La spettrometria di massa ad alta risoluzione è stata impiegata per studiare i livelli di metaboliti cellulari e tissutali. Abbiamo utilizzato studi di tracciamento isotopico stabile per tracciare il destino di metaboliti specifici e scoprire nuovi percorsi metabolici rilevanti per la fisiologia dei mammiferi sani e malati. Il gruppo ha scoperto che i mitocondri dei mammiferi possono sostenere funzioni critiche in ambienti a basso contenuto di ossigeno.Meccanicamente, impiegano il fumarato come scettro elettronico alternativo per la catena di trasporto degli elettroni. Questo protocollo compila diversi saggi che i ricercatori possono utilizzare per valutare meglio la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero. È importante sottolineare che questi protocolli possono essere utilizzati per studiare la funzione mitocondriale nell'ipossia, poiché gli esperimenti classici di respirometria non saranno sufficienti.

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Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Abbiamo sviluppato un protocollo pratico e un approccio analitico per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità di trasferimento di elettroni negli omogeneizzati tumorali freschi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare varie funzioni mitocondriali che contribuiscono all'inizio, alla progressione e alla risposta al trattamento del cancro.

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.

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Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.

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Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

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