Name: Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Impara a isolare e coltivare macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina. Questo metodo semplice e riproducibile garantisce alta purezza cellulare per studiare i meccanismi patogenici dell'artrite reumatoide.

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Gli autori ringraziano lo staff della Division of Medical Research Support, l'Advanced Research Support Center (ADRES) e i membri della Division of Integrative Pathophysiology, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, per la loro assistenza tecnica e il loro utile supporto. Questo studio è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (a NS) e JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (a YI); sovvenzioni della Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (to NS); e una sovvenzione per la ricerca medica della Takeda Science Foundation, una sovvenzione per progetti UCB Japan (UCBJ) e la sovvenzione JSBMR Frontier Scientist 2019 (a YI).

Gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati dall'Animal Experiment Committee dell'Università di Ehime e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Università di Ehime per gli esperimenti sugli animali (37A1-1 * 16).
1. Preparazione di strumenti, reagenti e terreno di coltura
<ol><li>Preparare il terreno di coltura come segue: integrare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con siero bovino fetale al 10% (FBS) e soluzione antibiotico-antimicotica all'1% (anti-anti).</li>
	<li>Preparare il mezzo di digestione come segue: integrare il terreno di coltura con 1 mg/ml di collagenasi di tipo IV. Regolare la concentrazione di collagenasi appena prima dell'uso.</li>
	<li>Diluire il collagene di tipo I-C ad una concentrazione di 0,15 mg/ml con 1 mM di soluzione di HCl. Piatti di coltura alluvionale (diametro di 40 o 60 mm) con la soluzione di collagene diluito. Dopo 6-12 ore a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di collagene dai piatti e asciugare a temperatura ambiente. I piatti rivestiti di collagene possono essere conservati a temperatura ambiente per almeno 1 settimana. Lavare le stoviglie pre-rivestite con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) o terreno prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare strumenti chirurgici sterili, come forbici, pinzette con punte seghettate e pinzette a punta fine. Immergere in etanolo al 70% prima dell'uso.</li>
</ol>2. Preparazione del tessuto sinovite nei topi ( Figura 1A)
<ol><li>Preparare un topo con artrite infiammatoria nelle zampe posteriori. NOTA: Per questo protocollo 8 sono stati utilizzati topi femmina C57BL / 6 (18-20 g),7-8 settimane postnatali, con artrite indotta da anticorpi collagene (CAIA) o artrite da trasferimento sierico K / BxN (STA). Isolare le SM da tessuto non gonfio (cioè sano) potrebbe essere difficile, poiché il numero di cellule è insufficiente.</li>
	<li>Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg di ketamina e 16 mg/kg di xilazina. Pulire i topi con etanolo al 70%.</li>
	<li>Tagliare la regione pettorale con le forbici per esporre il cuore. Tagliare il padiglione auricolare destro del cuore con le forbici, quindi inserire un ago a farfalla da 23 G nel ventricolo sinistro attraverso l'apice del cuore, seguito da un reflusso di 15-20 ml di PBS sterile usando una siringa per rimuovere manualmente il sangue periferico (circa 1 ml / 2 s).</li>
	<li>Decorticare le zampe posteriori tagliando la pelle con le forbici e tirando la pelle usando una pinzetta con punte seghettate. NOTA: dopo questo passaggio, si consiglia l'uso di pinzette per la manipolazione dei campioni. Non toccare il tessuto decorticato con le dita, per evitare l'attaccamento di peli murini.</li>
	<li>Dislocare le articolazioni metatarso-falangee tirando, seguito tagliando i legamenti delle articolazioni usando le forbici per rimuovere le dita dei piedi.</li>
	<li>Tagliare i tendini dei muscoli della parte inferiore della gamba vicino alla caviglia usando le forbici. Afferrare il tendine con una pinzetta e sbucciare i muscoli prossimalmente nella parte inferiore della gamba per esporre la tibia. Rimuovere il perone.</li>
	<li>Dislocare l'articolazione del ginocchio tirando, seguita dal taglio dei legamenti delle articolazioni usando le forbici per staccare la tibia con la zampa posteriore gonfia. Conservare i campioni in terreno di coltura ghiacciato (0,3 ml/cm2) fino alla lavorazione fino alla fase 3.1.</li>
</ol>3. Digestione del tessuto sinovite ( Figura 1B)
<ol><li>Aspirare il terreno di coltura, evitando il campione, quindi aggiungere terreno di coltura fresco (0,3 mL/cm2). Ripetere il processo di lavaggio tre o quattro volte. NOTA: da questa fase, la manipolazione dei campioni deve essere eseguita in modo asettico in un banco pulito o in un armadio di sicurezza.</li>
	<li>Dislocare tutte le giunture dei campioni tirando usando una pinzetta a punta fine nel terreno di coltura sotto uno stereomicroscopio (con ingrandimento 10x-20x). Le pinzette a punta fine sono convenienti in questo passaggio. Rimuovere la tibia e il maggior numero possibile di vasi, tendini e legamenti. Fare attenzione a non rompere le ossa durante la dislocazione.</li>
	<li>Preparare due provette da 15 ml per campione. Trasferire le ossa lussate con tessuti molli al primo tubo da 15 ml usando una pinzetta. Aggiungere 4 ml di terreno di digestione per campione, ottenuto da entrambe le zampe posteriori, nel tubo.</li>
	<li>Per raccogliere cellule residue e frammenti di tessuto, trasferire il mezzo in cui il campione è stato contenuto nella seconda provetta da 15 ml. Centrifugare il terreno a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet con 1 mL di terreno di digestione e trasferire la soluzione di frammento cellulare e tissutale al primo tubo da 15 mL contenente quasi tutto il tessuto (totale di 5 mL di mezzo di digestione/zampe posteriori).</li>
	<li>Digerire il campione per 60-120 minuti a 37 °C agitando in forno di ibridazione. NOTA: Il momento ottimale per digerire i campioni deve essere deciso. Il tempo dipende dal grado di gonfiore alle caviglie e alle collagenasi. Nella maggior parte dei casi, 60-120 minuti sono sufficienti. Dopo 60 minuti di incubazione, raccogliere una parte del campione digerito mediante pipettaggio e osservare al microscopio. Se la digestione è insufficiente, l'incubazione dovrebbe continuare e la digestione controllata ogni 30 minuti.</li>
	<li>Pipet la soluzione bene. Filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare (dimensione dei pori di 40 μm) in un tubo da 50 ml.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di terreno di coltura al tubo da 50 ml attraverso il filtro cellulare. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere con 10 ml di terreno di coltura. Ripetere la centrifugazione. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere con 2 ml di terreno di coltura.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig01.jpg"> Figura 1: Procedura di campionamento del tessuto dell'artrite murina e della digestione della collagenasi . (A) (i) Zampa posteriore murina con artrite infiammatoria. ii) Rimozione della pelle della zampa posteriore. (iii) Dislocazione delle articolazioni metatarso-falangee e rimozione delle dita dei piedi. iv) Taglio dei tendini della caviglia. (v) Rimozione dei muscoli nella parte inferiore delle gambe. (vi) Dislocazione dell'articolazione del ginocchio. (b) sinistra; gambe asportate in terreno di coltura. A destra; Tarso e metatarso dislocati in terreno di coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
4. Isolamento dei fibroblasti sinoviali ( Figura 2A)
<ol><li>Seminare tutte le sospensioni cellulari ottenute da entrambe le caviglie sul piatto rivestito di collagene. NOTA: Se si utilizzano caviglie con gonfiore debole o moderato per ottenere le cellule, viene applicato un piatto di 40 mm di diametro. La dimensione del piatto rivestito di collagene può essere modificata in un piatto di 60 mm di diametro se entrambe le caviglie hanno un grave gonfiore.</li>
	<li>Aggiungere terreno di coltura (circa 222 μL/cm2). Incubare per 1 h a 37 °C in atmosfera umidificata con 5% di CO2.</li>
	<li>Raccogliere le celle non aderenti usando un pipet (usare al punto 5.1). Lavare il piatto rivestito di collagene con terreno di coltura e raccogliere il terreno. Coltura delle cellule aderenti in terreno fresco (Figura 2B,i). La maggior parte delle cellule che aderiscono rapidamente al piatto rivestito di collagene mostrano una morfologia fibroblastoide (a forma di fuso).</li>
	<li>Passaggio di cellule subconfluenti mediante trattamento con tripsina allo 0,05% nella soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS). In questo metodo, la contaminazione di altre cellule è limitata, anche se nell'espansione iniziale. Se sono necessarie più cellule simili ai fibroblasti purificate, eseguire passaggi ripetuti per consentire il miglioramento della purezza; tuttavia, si osserva anche l'espansione del citoplasma delle cellule in adesione (Figura 2B,ii). Poiché passaggi eccessivi influenzano la perdita di caratteristiche ingenue nelle cellule, utilizzare cellule con meno di 5 passaggi.</li>
</ol>5. Isolamento dei macrofagi sinoviali ( Figura 2A)
<ol><li>Seminare tutte le cellule non aderenti dal punto 4.4 su piatti (diametro di 40 o 60 mm) che non sono stati rivestiti di collagene. NOTA: Le cellule non aderenti includono macrofagi, altri linfociti e fibroblasti residui dal tessuto sinovite.</li>
	<li>Coltivare le celle bulk per 1 giorno a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.</li>
	<li>Per rimuovere i linfociti non aderenti, aspirare il terreno coltivato e quindi aggiungere terreno di coltura fresco. Ripetere questo processo due o tre volte (Figura 2B,iii).</li>
	<li>Coltura delle cellule di massa aderenti per 1-2 settimane in terreno di coltura, con variazioni del terreno ogni 2 giorni mantenendo la confluenza (Figura 2B,iv). NOTA: Il numero di SM aumenta lentamente in condizioni di co-coltura con FS. Pertanto, il periodo di co-coltura dovrebbe essere adeguato secondo necessità.</li>
	<li>Lavare con PBS o HBSS due volte. Trattare con tripsina allo 0,05% in HBSS (circa 55 μL/cm2) per 3 minuti a 37 °C in atmosfera umidificata con CO2 al 5%. I fibroblasti si staccano facilmente dal piatto di coltura con il trattamento con tripsina e i macrofagi mostrano resistenza al trattamento con tripsina. Utilizzare questa proprietà per la selezione dei macrofagi sinoviali.</li>
	<li>Aggiungere delicatamente terreno di coltura (circa 222 μL/cm2) allo 0,05% di tripsina in HBSS. Dopo questo passaggio, non versare il mezzo direttamente sulle cellule.</li>
	<li>Per rimuovere le cellule distaccate, aspirare il terreno di coltura e quindi aggiungere delicatamente terreno di coltura fresco. Ripeti questo processo due o tre volte. Mantenere le cellule rimanenti sul piatto in terreno di coltura fresco fino all'uso (Figura 2B,v). NOTA: Dopo il trattamento con tripsina, le cellule aderenti presentano caratteristiche morfologiche simili ai macrofagi.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig02.jpg"> Figura 2: Separazione delle frazioni ricche di macrofagi e fibroblasti dal tessuto dell'artrite infiammatoria. (A) Schema della procedura per separare le cellule ricche di macrofagi e ricche di fibroblasti dal tessuto artrite. (B) Immagini rappresentative di contrasto di fase delle fasi della procedura, da (i) a (v) nella figura 2A. La barra della scala rappresenta 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Svelare l'artrite infiammatoria: esplorare le funzioni delle cellule sinoviali

<ol><li>Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).</li>
<li>Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+tissue+macrophages%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Synovial tissue macrophages: friend or foe.</a> RMD Open. 3 (2), (2017).</li>
<li>Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophages%3A+from+ordinary+eaters+to+extraordinary+multitaskers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers.</a> Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).</li>
<li>Alivernini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synovial+tissue+macrophage+subsets+regulate+inflammation+and+remission+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis.</a> Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).</li>
<li>Saeki, N., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+synovial+macrophage+metabolism+by+synovial+fibroblasts+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).</li>
<li>Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+normal+and+arthritogenic+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts.</a> Protocol Exchange. , (2009).</li>
<li>Saeki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulator+UHRF1+orchestrates+proinflammatory+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+in+a+suppressive+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).</li>
<li>Midwood, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+an+endogenous+activator+of+Toll-like+receptor+4+that+is+essential+for+maintaining+inflammation+in+arthritic+joint+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease.</a> Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).</li>
<li>You, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+engineered+stem+cell-derived+exosomes+to+regulate+macrophage+heterogeneity+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis.</a> Science Advances. 7 (23), 0083(2021).</li>
<li>Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+propagation+method+for+resident+macrophages+by+co-culture+and+subculture%2C+and+their+isolation+from+various+organs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs.</a> BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).</li>
<li>Andrä, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+T-cell+functionality+after+flow+cytometry+sorting+revealed+p38+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).</li>
<li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+%28SICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).</li>
<li>Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+rheumatoid+arthritis%3A+dangerous+liaisons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons.</a> Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).</li>
<li>Croft, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+subsets+drive+inflammation+and+damage+in+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis.</a> Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).</li>
<li>Wei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+drives+synovial+fibroblast+identity+and+arthritis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology.</a> Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questo metodo sviluppato qui migliora le tecniche precedenti per isolare sia le SF dall'artrite murina che i macrofagi residenti da un certo numero di organi 7,11. Il metodo modificato può isolare sia i macrofagi che i fibroblasti dalla sinovia infiammatoria con elevata purezza ed è semplice e riproducibile. Poiché il metodo non richiede strumenti complessi come uno smistatore cellulare, chiunque può condurlo. Inoltre, la presente tecnica evita preoccupazioni ass...

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune caratterizzata da iperplasia della sinovia, che porta alla distruzione articolare 1,2. I macrofagi e i fibroblasti residenti nei tessuti sono presenti nella sinovia sana per mantenere l'omeostasi articolare. Nei pazienti con AR, i fibroblasti sinoviali (SF) proliferano e le cellule immunitarie, compresi i monociti, si infiltrano nella sinovia e nel liquido articolare, processi associati all'infiammazione 1,3,4. I macrofagi sinoviali (SM), che comprendono i macrofagi residenti e i macrofagi derivati dai monociti del sangue periferico, e i SF sono attivati in modo aberrante e hanno ruoli importanti nella patogenesi dell'AR. Studi recenti hanno suggerito che le interazioni cellula-cellula tra SM e SF contribuiscono sia all'esacerbazione che alla remissione di RA 5,6.
Per comprendere la patogenesi dell'AR, sono stati utilizzati diversi modelli di roditori di artrite infiammatoria, tra cui l'artrite da trasferimento del siero K / BxN, l'artrite indotta dal collagene e l'artrite indotta da anticorpi al collagene. I saggi basati sulle cellule sono generalmente necessari per chiarire le funzioni molecolari nell'artrite. Pertanto, sono state isolate cellule primarie da modelli animali di artrite. Il metodo per isolare le SF dal tessuto dell'artrite murina è ben consolidato, e queste cellule hanno contribuito alla delucidazione dei meccanismi molecolari nella patogenesi dell'artrite 7,8. D'altra parte, i macrofagi derivati dal midollo osseo, i macrofagi derivati dai monociti del sangue e le linee cellulari dei macrofagi sono stati spesso utilizzati come risorse macrofagiche per gli studi sull'artrite 9,10. Poiché i macrofagi possono acquisire funzioni associate al loro microambiente, le fonti generali di macrofagi possono mancare di risposte specifiche al tessuto artrite. Inoltre, è difficile ottenere abbastanza cellule sinoviali mediante selezione, poiché la sinovia murina è un tessuto molto piccolo anche nei modelli di artrite. La mancanza di utilizzo di macrofagi sinoviali per studi in vitro è stata una limitazione negli studi sull'artrite. L'istituzione di un protocollo per isolare ed espandere i macrofagi sinoviali sarebbe un vantaggio per la delucidazione dei meccanismi patologici nell'AR.
Nel metodo precedente per isolare le SF, gli SM sono stati scartati7. Oltre a ciò, è stato riportato un metodo per isolare ed espandere i macrofagi residenti da alcuni organi11. Pertanto, i protocolli esistenti sono stati modificati in combinazione. La modifica mira a raggiungere la cultura primaria sia di SM che di SF con elevata purezza. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare ed espandere sia SM che SF dal tessuto di artrite murina.

<table><tbody><tr><td>5,0 g/L di tripsina/5,3 mmol/L di soluzione di EDTA</td><td>nacalai tesque</td><td>35556-44</td><td>Diluito con antibiotico HBSS</td></tr><tr><td>... antimicotico (anti/anti)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ago a farfalla</td><td>TERUMO</td><td>SV-23DLK</td><td>23G</td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro; m poro, Nylon</td></tr><tr><td>Cellmatrix Tipo I-C</td><td>Gelatina Nitta</td><td>637-00773</td><td>Collagene Tipo I-C</td></tr><tr><td>Provetta Centriguge 15</td><td>TPP</td><td>91014</td><td>Provetta da 15 mL Provetta</td></tr><tr><td>Centriguge 50</td><td>TPP</td><td>91050</td><td>Provetta da 50 mL</td></tr><tr><td>Collagenasi da C. Histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>Tipo IV collagenasi</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>SIGAM</td><td>173012</td><td>È stata eseguita l'inattivazione del calore</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI28-1525A</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale 40</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale 60</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>KFI</td><td>1-9749-31</td><td>Pinzette a punta fine</td></tr><tr><td></td><td>Bio Research Center</td><td>PRI28-1522</td><td>Punta seghettata</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>ZEISS</td><td>STEMI305-EDU</td><td>Stereomicroscopio</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

L'artrite reumatoide è una malattia autoimmune che porta all'infiammazione cronica delle articolazioni. I macrofagi sinoviali e i fibroblasti sinoviali hanno ruoli centrali nella patogenesi dell'artrite reumatoide. È importante comprendere le funzioni di entrambe le popolazioni cellulari per rivelare i meccanismi alla base della progressione patologica e della remissione nell'artrite infiammatoria. In generale, le condizioni sperimentali in vitro dovrebbero imitare il più possibile l'ambiente in vivo . Le cellule primarie derivate dai tessuti sono state utilizzate in esperimenti che caratterizzano i fibroblasti sinoviali nell'artrite. Al contrario, negli esperimenti che studiano le funzioni biologiche dei macrofagi nell'artrite infiammatoria, sono state utilizzate linee cellulari, macrofagi derivati dal midollo osseo e macrofagi derivati dai monociti del sangue. Tuttavia, non è chiaro se tali macrofagi riflettano effettivamente le funzioni dei macrofagi residenti nei tessuti. Per ottenere macrofagi residenti, i protocolli precedenti sono stati modificati per isolare ed espandere sia i macrofagi primari che i fibroblasti dal tessuto sinoviale in un modello murino di artrite infiammatoria. Queste cellule sinoviali primarie possono essere utili per l'analisi in vitro dell'artrite infiammatoria.

I topi femmina C57BL / 6 a 7-8 settimane di età sono stati sottoposti ad artrite indotta da anticorpi collagene. Le cellule simili ai macrofagi e le cellule simili ai fibroblasti sono state isolate indipendentemente dal tessuto dell'artrite infiammatoria secondo la procedura sopra descritta (Figura 2A, B). Le cellule simili ai macrofagi sono state immediatamente utilizzate dopo la fase 5.7. Le cellule simili ai fibroblasti sono state inizialmente coltivate per essere sub-con...

Il presente studio fornisce un protocollo modificato per isolare i macrofagi sinoviali e i fibroblasti dal tessuto dell'artrite infiammatoria murina.

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

Sono necessari saggi basati su cellule per chiarire le funzioni molecolari. Negli studi sull'artrite, il metodo per isolare le cellule primarie è ben consolidato nei fibroblasti sinoviali, ma non nei macrofagi sinoviali. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare ed espandere sia i macrofagi sinoviali che i fibroblasti sinoviali dai modelli di artrite.I fibroblasti sinoviali primari del tessuto dell'artrite murina hanno contribuito alla delucidazione dei meccanismi molecolari nella patogenesi dell'artrite. D'altra parte, i macrofagi derivati dal midollo osseo, i macrofagi derivati dai monociti del sangue e le linee cellulari dei macrofagi sono stati spesso utilizzati come risorse macrofagiche per gli studi sull'artrite. Poiché i macrofagi possono acquisire funzioni associate al loro microambiente, le fonti generali di macrofagi possono mancare di risposte specifiche al tessuto artrite.Inoltre, è difficile ottenere abbastanza cellule sinoviali mediante selezione, poiché la sinovia murina è un tessuto molto piccolo anche nei modelli di artrite. Nel metodo precedente per isolare i fibroblasti sinoviali, i macrofagi sinoviali sono stati scartati. Oltre a ciò, è stato riportato un metodo per isolare ed espandere i macrofagi residenti da alcuni organi.Pertanto, i protocolli esistenti sono stati modificati in combinazione per isolare ed espandere sia i macrofagi sinoviali che i fibroblasti sinoviali dal tessuto dell'artrite murina. Questo metodo può isolare sia i macrofagi che i fibroblasti dalla sinovia infiammatoria con elevata purezza ed è semplice e riproducibile. Questo metodo consente l'espansione dei macrofagi sinoviali in co-coltura con fibroblasti sinoviali.Inoltre, il metodo fornisce un vantaggio, in quanto i fibroblasti sinoviali possono essere utilizzati con meno passaggi. Il protocollo stabilito sarebbe un vantaggio per chiarire i meccanismi patologici nell'artrite reumatoide.

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Questo video mostra una terapia cellulare per l'artrite autoimmune nei topi. Le cellule T regolatorie derivate da iPSC che esprimono recettori specifici per l'ovoalbumina vengono iniettate con albumina sierica bovina metilata (mBSA) emulsionata in un adiuvante. Le cellule presentanti l'antigene (APC) murino elaborano e presentano l'mBSA alle cellule T, provocando l'attivazione e la migrazione delle cellule T verso la membrana sinoviale dell'articolazione del ginocchio. Le iniezioni successive...

Una terapia cellulare per l'artrite autoimmune in un modello murino

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali indotte pluripotenti-umani da sinoviociti fibroblasti come derivati ​​da pazienti, utilizzando un sistema lentivirale senza cellule di alimentazione.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell&#39;artrite reumatoide pazienti

Viene presentato un protocollo che stabilisce cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal liquido sinoviale e dal midollo osseo di maialini e raccolte in modo non invasivo mediante aspirazione a siringa. La fenotipizzazione cellulare è stata eseguita utilizzando la citometria a flusso dopo l'isolamento cellulare e la coltura in vitro di midollo osseo e liquidi sinoviali derivati da MSC.

Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Questo articolo presenta un protocollo semplice ed economico per il semplice isolamento e purificazione delle cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale di coniglio bianco di Nuova Zelanda.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

È stato sviluppato un metodo criogenico di polverizzazione per la trattamento delle zampe murine utilizzando un congelatore liquido congelatore di azoto per migliorare la resa e la qualità dell'RNA o delle proteine estratte dai tessuti e consentire l'analisi dei profili molecolari associati agli infiammatori Risposte.

Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Abbiamo sviluppato un sistema transwell ex vivo umano in grado di valutare cambiamenti infiammatori acuti, infettivi e strutturali nella sinovia.

Un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate

Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

Epatociti primari costituirà un valido strumento per valutare le funzioni biochimiche, molecolari e metaboliche in un sistema fisiologicamente rilevante sperimentale. Noi descriviamo un protocollo affidabile per la perfusione di fegato di ratto in situ, che genera costantemente epatociti vitali fino to1.0 ×...

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

In questa pubblicazione, si descrive una procedura rapida e conveniente per l'isolamento e la coltura primaria cellule pancreatiche acinose del pancreas murino. Questo metodo costituisce un valido approccio per studiare la fisiologia delle cellule esocrine del pancreas freschi primarie normali / non trasformata.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

Impara a isolare e coltivare macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina. Questo metodo semplice e riproducibile garantisce alta purezza cellulare per studiare i meccanismi patogenici dell'artrite reumatoide.

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

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