Name: Utilizzo del cervello dellembrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri l'analisi del comportamento delle cellule di glioblastoma umano utilizzando il cervello dell'embrione di pulcino come modello in vivo ed ex vivo. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale dell'invasività tumorale.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte da una sovvenzione al DSG del National Cancer Institute (R03CA227312) e da una generosa sovvenzione della Lisa Dean Moseley Foundation. I campioni vivi di GBM sono stati ottenuti con il consenso del paziente attraverso il Tissue Procurement Center dell'Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Il finanziamento ad A.R. è stato fornito dal National Center for Research Resources e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Le borse di ricerca universitarie estive a N.P., A.L., Z.W. e K.S. sono state fornite dal programma di ricerca universitaria dell'Università del Delaware.

Utilizzo del cervello embrionale di pollo come modello per studiare il comportamento delle cellule di glioblastoma umano

<ol><li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+stimulation+of+human+glioma+cell+motility+correlates+with+FAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation.</a> Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).</li>
<li>Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+stimulates+glioma+cell+motility+and+proliferation+through+the+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).</li>
<li>Anderson, H. J., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+FGFR%2C+integrins+and+FAK+selectively+decrease+L1CAM-stimulated+glioblastoma+cell+motility+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation.</a> Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).</li>
<li>Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+L1CAM+stimulates+glioblastoma+cell+motility%2C+proliferation%2C+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982(2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Aaberg-Jessen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+primary+glioma-+and+cell+line-derived+spheroids+implanted+into+corticostriatal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+and+anti-invasion+research+of+glioma+cells+in+an+improved+model+of+organotypic+brain+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture.</a> Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).</li>
<li>Fayzullin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+phenotyping+of+invasive+glioma+cells+ex+vivo+reveals+subtype-specific+movement+patterns+guided+by+tumor+core+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).</li>
<li>Jensen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+tumor+stem+cell-based+glioblastoma+invasion+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model.</a> PloS One. 11 (7), e0158746(2016).</li>
<li>Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glioblastoma+tumour-host+cell+interactions+using+adult+brain+organotypic+slice+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435(2018).</li>
<li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spatiotemporal+dynamics+of+human+glioma+stem+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion.</a> Molecular Brain. 12 (1), 45(2019).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+based+on+in+ovo+electroporation+for+chicken+embryonic+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).</li>
<li>Murrell, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+multipotent+stem+cells+from+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain.</a> PloS One. 8 (8), e71334(2013).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li>
<li>Shoin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+assay+as+chemosensitivity+test+for+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma.</a> Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Balciūniene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+human+glioblastoma+transplanted+on+chicken+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane.</a> Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).</li>
<li>De Magalhães, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+new+In+vivo+tumor+spheroid+based+shell-less+chorioallantoic+membrane+3-D+model+in+bioengineering+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Applications of a new In vivo tumor spheroid based shell-less chorioallantoic membrane 3-D model in bioengineering research.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 3 (1), 20-26 (2010).</li>
<li>Szmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+human+glioblastoma+model+cultured+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology of human glioblastoma model cultured in ovo.</a> Journal of Veterinary Research. 56 (2), 261-266 (2012).</li>
<li>Jaworski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+tumor+morphology+and+structure+from+U87+and+U118+glioma+cells+cultured+on+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).</li>
<li>Yuan, Y. J., Xu, K., Wu, W., Luo, Q., Yu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+in+neurosurgery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of the chick embryo chorioallantoic membrane in neurosurgery disease.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (12), 1275-1281 (2014).</li>
<li>Urbańska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+silver+nanoparticles+%28AgNPs%29+on+proliferation+and+apoptosis+of+in+ovo+cultured+glioblastoma+multiforme+%28GBM%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">The effect of silver nanoparticles (AgNPs) on proliferation and apoptosis of in ovo cultured glioblastoma multiforme (GBM) cells.</a> Nanoscale Research Letters. 10, 98(2015).</li>
<li>DeBord, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+as+a+versatile+patient-derived+xenograft+%28PDX%29+platform+for+precision+medicine+and+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research.</a> American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).</li>
<li>Han, J. M., Jung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anticancer+effect+of+a+combination+of+berbamine+and+arcyriaflavin+A+against+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells.</a> Molecules. 27 (22), 7968(2022).</li>
<li>Ruiz-Ontañon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+confers+migratory+and+invasive+advantages+to+a+population+of+glioblastoma-initiating+cells+that+infiltrate+peritumoral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue.</a> Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+human+medulloblastoma+dissemination+in+the+developing+chick+embryo+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).</li>
<li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanked+glioblastoma+patient-derived+organoids+as+a+precision+medicine+model+to+study+inhibition+of+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720(2021).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse.

I passaggi critici nel protocollo per l'iniezione di cellule nel ventricolo del mesencefalo (tectum ottico) includono non danneggiare i vasi sanguigni nella membrana corioallantoica nell'uovo o circondare l'embrione prima e durante l'iniezione, sebbene la membrana amnionica immediatamente circostante l'embrione possa essere delicatamente tirata e tenuta per posizionare la testa quando si iniettano le cellule nel mesencefalo. L'amnione è relativamente duro e può essere tirato con una pinza sottile per posizionare la testa e tenerla ferma con una mano, per l'iniezione di cellule con l'altra mano nel tectum ottico, che è la grande struttura rotonda nel mezzo del cervello. Generalmente, la vitalità degli embrioni iniettati varia dal 25% al 75%, a seconda di fattori sconosciuti, e praticamente ogni embrione che sopravvive contiene almeno un piccolo tumore nel tectum ottico. I passaggi critici nella generazione di fette di cervello vitali includono la cancellazione del tessuto di liquido in eccesso in modo che l'agarosio aderisca al cervello durante il taglio e per mantenere il tessuto e le fette fredde fino a quando non vengono posizionate sull'inserto della membrana. Poiché diversi tipi di cellule formano sferoidi in modo diverso (in velocità e dimensioni), la densità cellulare placcata su piastre di poli-HEMA e il periodo di tempo prima della raccolta degli sferoidi dovrebbero essere ottimizzati per ciascun tipo di cellula.
Il lavoro qui non è stato oggetto di uno studio longitudinale formale della vitalità delle fette di cervello. Yang et al. hanno usato colture di fette di cervello di embrione di pulcino simili a quelle utilizzate qui e hanno mostrato una buona vitalità delle fette per almeno 7 giorni16. Il lavoro precedente ha dimostrato che quando il tessuto OT è stato mantenuto in mezzi subottimali, molti nuclei picnotici sono apparsi nel tessuto, che non si sono verificati nelle fette nel lavoro qui. Inoltre, quando le fette degenerano in condizioni non ottimali, i vasi sanguigni si frammentano e appaiono come file di sfere positive alla laminina (non mostrate). Pertanto, sebbene la vitalità qui non sia stata verificata con metodi come l'elettrofisiologia o l'espressione attiva della caspasi-3, nessuno degli indicatori di morte cellulare che sono stati osservati in condizioni di coltura non ottimali è apparso qui.
L'OT è stato focalizzato per esperimenti di tumore cerebrale in vivo perché è la regione più facilmente iniettabile con il ventricolo più grande. A E5, che è l'ultimo giorno in cui l'embrione è abbastanza piccolo da rimanere accessibile sopra il tuorlo, le iniezioni devono essere fatte in un ventricolo, poiché tutte le regioni del cervello non sono altro che una sottile zona ventricolare. Tuttavia, queste iniezioni provocano con successo tumori incorporati con cellule che invadono il parenchima cerebrale. A volte, i tumori risultanti si trovano nel proencefalo o nel cervelletto, ma questo non è comune. Fette ex vivo di tectum ottico E15 sono state utilizzate principalmente per esperimenti qui, in modo che i risultati della co-coltura ex vivo possano essere correlati con gli esperimenti di iniezione in vivo . Tuttavia, anche le fette del proencefalo sono adatte e hanno una superficie più ampia e un ventricolo molto sottile rispetto al tectum ottico, il che potrebbe rendere il proencefalo più adatto per co-colture ex vivo che non sono correlate con iniezioni in vivo .
È stato dimostrato qui che le iniezioni in vivo, seguite dalla fissazione dei tessuti, dal sezionamento vibrante dell'affettatrice tissutale e dall'immunocolorazione per la laminina e altri marcatori, hanno portato a immagini ad alta risoluzione delle cellule GBM e delle GSC nel tessuto cerebrale in prossimità dei vasi sanguigni. La capacità di determinare le interrelazioni tra cellule tumorali e vasi sanguigni è stata notevolmente facilitata dalla creazione di rendering di volumi 3D da z-stack di sezioni ottiche confocali utilizzando il software confocale e le istruzioni del produttore. Era possibile l'imaging time-lapse utilizzando la microscopia a fluorescenza a largo campo di cellule marcate con GFP, mCherry e DiD; Tuttavia, le cellule in migrazione che si trovavano in prossimità degli sferoidi altamente fluorescenti erano talvolta oscurate dal "bagliore" dello sferoide. Questo effetto indesiderato può essere in qualche modo ridotto al minimo regolando attentamente i tempi di esposizione per la raccolta di immagini a campo ampio. L'imaging time-lapse utilizzando z-stack confocali nel tempo (4D) ha eliminato il bagliore fuori fuoco dagli sferoidi e ha portato a cellule migratorie nettamente definite con uno sfondo scuro. Questo non è stato descritto nel protocollo, ma è stato eseguito in modo simile all'imaging time-lapse a campo ampio, che è stato eseguito mentre le fette di cervello erano sugli inserti della membrana trasparente in una piastra di plastica a 6 pozzetti. Sebbene l'imaging time-lapse confocale produca immagini marcatamente più chiare delle singole cellule e del loro comportamento, un esperimento time-lapse multi-punto che raccoglie pile z di 10 piani z / punto, a intervalli di 10 minuti su un periodo di 20 ore, è un uso estensivo dei galvanometri a testa di scansione. Poiché ciò potrebbe ridurre significativamente la durata della vita dei galvanometri, questo metodo viene utilizzato con giudizio.
Sebbene il sistema embrionale di pulcino sia molto adatto sia per l'iniezione in vivo che per gli esperimenti di co-coltura ex vivo che studiano il comportamento delle cellule GBM, ci sono diverse limitazioni a questo sistema modello. Come con qualsiasi sistema di xenotrapianto, l'ambiente in cui vengono impiantate le cellule umane non è il cervello umano, ma il comportamento delle cellule GBM sembra imitarlo nei modelli di roditori e nei pazienti umani. Dopo aver eseguito esperimenti di iniezione in vivo su E5, i tumori sono normalmente autorizzati a formarsi per 10 giorni, fino a E15. Questo chiaramente non è abbastanza tempo per studiare tutti gli aspetti della tumorigenesi e dell'invasione cellulare. Tuttavia, è stato dimostrato qui che i tumori solidi si formano nel parenchima cerebrale, le cellule interagiscono e si riorganizzano all'interno del tumore e si verificano significative invasioni cerebrali sia lungo i vasi sanguigni che diffusamente in questo periodo di tempo relativamente breve. Un'altra limitazione al sistema embrionale di pulcino in vivo è che non è adatto per farmaci o altri trattamenti a causa del grande tuorlo e del sistema circolatorio extraembrionale che opera durante lo sviluppo dell'embrione di pulcino. I trattamenti topici con farmaci liquidi si tradurrebbero in una concentrazione altamente variabile e sconosciuta nel cervello a causa della diffusione lontano dall'embrione nella massa di tuorlo molto più grande. Allo stesso modo, l'iniezione endovenosa di farmaci nel delicatissimo sistema circolatorio extraembrionale fuoriuscirebbe o diffonderebbe dai vasi sanguigni e provocherebbe anche concentrazioni sconosciute nel cervello. Questo è uno dei motivi principali per cui è stato adottato il metodo di coltura a fetta ex vivo , in modo che non solo il comportamento cellulare potesse essere osservato e monitorato tramite microscopia time-lapse, ma anche in modo che i trattamenti che hanno avuto successo nell'alterare il comportamento delle cellule GBM in un piatto4 potessero essere testati in un ambiente di tessuto cerebrale più rilevante.
Lo sviluppo del sistema modello di tumore cerebrale ortotopico dell'embrione di pulcino è visto come un'aggiunta significativa ai sistemi e agli strumenti disponibili per lo studio della formazione del tumore GBM e del comportamento cellulare invasivo. È probabile che le uova di gallina fecondate siano prontamente disponibili nella maggior parte delle aree, sono poco costose rispetto ai roditori, non ci sono costi di cura degli animali, gli embrioni sono molto resistenti e resistenti alle infezioni (cioè, la maggior parte del lavoro viene svolto su un banco), gli embrioni sono altamente manipolabili e possono essere coltivati in coltura senza guscio19 e gli embrioni di pulcino non sono considerati animali vertebrati e quindi non richiedono l'approvazione IACUC dalle linee guida NIH (requisiti istituzionali può variare). Pertanto, questi molteplici vantaggi rendono il sistema embrionale di pulcino molto attraente se si limitano le loro domande ed esperimenti a quelli che rientrano nei suoi limiti. Diversi studi sulle cellule GBM sono stati eseguiti da altri utilizzando l'embrione di pulcino, ma questi hanno utilizzato quasi esclusivamente la membrana corioallantoica (CAM) dell'embrione 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 e gemma degli arti 30, e non il cervello. C'è stato anche un rapporto che ha impiantato il medulloblastoma nel cervello del pulcino su E231. Indubbiamente, l'uso dell'embrione di pulcino come sistema modello di xenotrapianto ortotopico, come descritto qui, dovrebbe produrre risultati molto più significativi per la biologia tumorale del GBM umano rispetto agli studi che utilizzano la CAM.
Sebbene questi studi abbiano appena iniziato a utilizzare pienamente il sistema modello di tumore cerebrale dell'embrione di pulcino per studi sulle cellule GBM umane e sul comportamento delle GSC, si spera che altri estenderanno gli usi e troveranno ulteriori potenziali applicazioni. Si potrebbe immaginare che non solo questo sistema scoprirà i meccanismi che regolano la formazione del tumore GBM e il comportamento cellulare, ma consentirà anche test preclinici di farmaci e sostanze specifici su cellule di pazienti specifici. Ad esempio, se le colture di fette di cervello sono state impostate in anticipo, le cellule tumorali, i pezzi di resezioni tumorali chirurgiche o gli organoidi GBM32 derivati dal paziente potrebbero essere collocati direttamente in co-coltura ex vivo e vari trattamenti potrebbero essere valutati in pochi giorni. Allo stesso modo, le cellule dissociate del paziente potrebbero essere iniettate direttamente nei mesencefalo E5 in ovo per valutare la loro capacità di formare tumori e invadere il parenchima cerebrale. Pertanto, si spera che le descrizioni dei metodi e dei risultati rappresentativi qui facilitino e incoraggino un maggiore uso di questo sistema altamente sottoutilizzato per la ricerca sul cancro al cervello.

Gli studi in vitro sui comportamenti delle cellule tumorali sono spesso utilizzati per analizzare i potenziali meccanismi che operano durante il comportamento più complesso che si osserva durante la formazione del tumore e l'invasione cellulare nei modelli di xenotrapianto in vivo. Ad esempio, con il glioblastoma (GBM), studi in vitro hanno scoperto meccanismi di come L1CAM opera potenzialmente durante la formazione del tumore e l'invasione cerebrale in un nuovo modello di tumore cerebrale xenotrapianto di embrione di pulcino 1,2,3,4,5. Sebbene gli esperimenti in vitro e in vivo si completino a vicenda in modi utili, lasciano una lacuna sostanziale nel modo in cui i risultati possono essere correlati. Ad esempio, le analisi meccanicistiche della motilità delle cellule GBM su un piatto sono una situazione altamente artificiale e i modelli di xenotrapianto in vivo possono rivelare solo analisi statiche del punto temporale o dell'endpoint della formazione del tumore e del comportamento cellulare. Gli studi in vivo che utilizzano embrioni di roditori o pulcini non si prestano facilmente al monitoraggio del comportamento cellulare mentre le cellule invadono il tessuto cerebrale in questi modelli di xenotrapianto. Tuttavia, il modello di xenotrapianto di embrioni di pulcino ha dimostrato che la proteina di adesione L1CAM svolge un ruolo stimolante nella capacità invasiva delle cellule umane T98G GBM 2,5.
Una soluzione adeguata a questo problema può essere raggiunta collegando metodi sia in vivo che in vitro utilizzando un modello organotipico di coltura di fette di cervello, indicato come modello ex vivo . In questo modello ex vivo, il tessuto cerebrale vivo può essere mantenuto a uno spessore di diverse centinaia di micron per un massimo di alcune settimane, rendendo possibile l'impianto di cellule tumorali, osservare il loro comportamento nel tessuto reale nel tempo e quindi eseguire un'analisi dei marcatori più dettagliata all'endpoint dell'esperimento.
Un popolare metodo di coltura organotipica è stato quello di coltivare una fetta di cervello spessa diverse centinaia di micron sopra una membrana porosa traslucida o trasparente, lasciando il tessuto esposto all'aria, ma consentendo ai mezzi nutritivi di sostenere il tessuto da sotto la membrana (fare riferimento a Stoppini et al.6). Diverse varianti di questo metodo sono state utilizzate per diversi studi, incluso l'utilizzo di diversi mezzi o diversi inserti di membrana. Diversi inserti di membrana includono un inserto a membrana poroso (0,4 μm) di diametro 30 mm in un piatto di coltura da 35 mm 6 e inserti di coltura cellulare (0,4 μm) per piastre a6 pozzetti7. Diversi mezzi includono 50% MEM / HEPES + 25% siero di cavallo inattivato dal calore + 25% di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)8, 50% di media sierici ridotti + 25% di siero di cavallo + 25% di HBSS9, così come altri. Se viene utilizzata una membrana traslucida o trasparente insieme a cellule GBM marcate con fluorescenza, tali colture possono essere visualizzate dal basso utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo invertito o confocale 10,11,12,13,14,15.
Mentre molti modelli di xenotrapianto di tumore cerebrale ortotopico in vivo e di coltura di fette di cervello organotipiche ex vivo sono stati stabiliti utilizzando roditori, come citato sopra, l'embrione di pulcino (Gallus gallus) è stato sottoutilizzato per questi scopi. Tuttavia, è stato dimostrato che l'embrione di pulcino può essere utilizzato come modello di xenotrapianto ortotopico in vivo per lo studio dell'invasione del glioma sia umano che di ratto 1,2,5. Le cellule xenotrapiantate nel cervello di embrioni di pulcino hanno mostrato modelli di invasione simili a quelli osservati nei modelli di roditori, supportando ulteriormente l'uso di embrioni di pulcino come modello in vivo per l'analisi delle cellule tumorali GBM. Gli embrioni di pulcino sono anche poco costosi, possono essere mantenuti più facilmente dei roditori (cioè nei loro gusci d'uovo in un incubatore di laboratorio) e sono molto più facili da lavorare, rendendoli un'opzione attraente per studi GBM in vivo a breve termine. Un recente articolo ha descritto l'uso di colture di fette di cervello di embrione di pulcino per la formazione e la crescita degli assoni durante il normale sviluppo del cervello in cui le fette erano vitali per almeno 7 giorni16. Tuttavia, manca l'uso di tali colture di fette di cervello di embrione di pulcino per l'analisi ex vivo del comportamento delle cellule GBM in un ambiente tissutale. In questo articolo, sono descritti sia il trapianto di cellule GBM umane e cellule staminali GBM (GSC) nel cervello precoce dell'embrione di pulcino in vivo, sia l'introduzione di cellule GBM su colture di cellule di cervello di embrioni di pulcino vivo ex vivo. Vengono inoltre forniti alcuni esempi rappresentativi dei tumori risultanti e dei modelli di invasione cellulare ottenuti da questi preparati.

<table><tbody><tr><td>Perforatore di carta con foro quadrato da 1 cm x 1 cm</td><td>Birabira</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penna da trapano per biopsia da 1 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>20335</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di inserimento a 6 pozzetti (Corning Transwell)</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3450</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur monouso da 9</td>" <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-9</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423-500</td><td>per l'inclusione di cervelli fissi</td></tr><tr><td>Alexafluor 488-coniugato GAM IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-605-146</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 647-coniugato GAM IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-146</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>ReynoldsWrap</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9518</td><td></td></tr><tr><td>anti-integrina alfa-6 anticorpo monoclonale GOH3</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-19622</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-L1CAM UJ127</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53386</td><td></td></tr><tr><td>anti-laminina Anticorpo monoclonale</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-nestina 10c2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-Sox2 E-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27 senza vitamina A</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bisbenzimmide (Hoechst 33258)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>colorante nucleare</td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Incubatore</td><td></td><td>CO2 umidificato standard</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td> Microscopio confocale <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>C2si+</td><td>Con camera dell'incubatore cellulare su misura</td></tr><tr><td>Lenti dell'obiettivo per microscopio confocale</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Lenti Plan Apo, tranne S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA obiettivo per imaging time-lapse confocale</td></tr><tr><td>Software per microscopio confocale</td><td>Nikon Instruments</td><td>NIS Elements</td><td>Versione 5.2</td></tr><tr><td>Foreceps curvi</td><td>World Precision Instruments</td><td>504478</td><td></td></tr><tr><td>Forbici curve</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatola curva</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Krazy Colla</td><td>KG-585 12R</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DiD colorante fluorescente rosso lontano</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td>Vybrant DiD</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)</td><td>Incubatrice per uova Sigma Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nastro isolante Humidaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 mil di spessore/254 &; m)</td><td>Scotch</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Colorante FCF verde veloce</td><td>Avocado Research Chemicals</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-products</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>carta da filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Dynarex</td><td>3353</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro per microiniezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher BioReagenti</td><td>BP228-1</td><td>per il montaggio</td></tr><tr><td>di terreni GSC (cellule staminali di glioblastoma umano)</td><td>Non applicabile</td><td></td><td>Isolato da campioni di GBM del paziente nel laboratorio Galileo in terreni GSC e poi trasdotto con un vettore lentivirale codificante GFP.&nbsp; Le celle utilizzate erano tra il passaggio 10 e il 30.</td></tr><tr><td>Hanks Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>Emacitometro</td><td>Hausser scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2524-100</td><td></td></tr><tr><td>tampone HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo (HI)</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 umano</td><td>BioVision</td><td>4037-1000</td><td></td></tr><tr><td>TGF umano-&alfa;</td><td>BioVision</td><td>4339-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td>per la visualizzazione di routine di cellule in coltura</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola da laboratorio</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labquake Shaker</td><td>LabIndustries</td><td>T400-110</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut:Pen:Strep</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1360</td><td>per l'inclusione di cervelli vivi</td></tr><tr><td>Matrix</td><td>Corning Matrigel</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Blocco vibratomo</td><td></td><td></td><td></td>in metallo</tr><tr><td>Puntali per micropipette (20, 200, 1.000 &; L)</td><td>Micropipettatori Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20, 200, 1.000 &; L)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Coverglass (n. 1,5 spessore)</td><td>Fisherbrand</td><td>12544A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 + H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Millipore Sigma</td><td>526-M</td><td></td></tr><tr><td>N-propil gallato</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P3130</td><td>per supporti di montaggio</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td> Paraformaldehyde <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Matita</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio semplici Fisherbrand</td><td></td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in plastica da 35 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>pneumatica picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-idrossietilmetacrilato)&nbsp; (poli-HEMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3932</td><td></td></tr><tr><td>lama di rasoio - doppio filo</td><td>PACE</td><td></td><td>per il taglio di fette fisse di cervello</td></tr><tr><td>coltello in zaffiro</td><td>Delaware Coltelli</td><td></td><td>diamantati per il taglio di fette di cervello vive</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>TruMed</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di sodio cacodilato 0,2 M pH 7,4</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Camera per campioni per vibratomo</td> Microscopio da dissezione stereo <td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td>Dotato di epifluorescenza</td></tr><tr><td>foreceps diritte</td><td>Strumenti di precisione mondiale</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>forbici diritte</td><td>Strumenti di scienza</td><td></td><td></td>raffinata</tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Mallinckrodt</td><td>7723</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescenza time-lapse microscopio (fluorescenza a campo largo)</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-E</td><td>Con camera di incubazione cellulare su misura (vedi Fotos et al., 2006)</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale polistirene 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td>per la coltura cellulare Piatto per</td></tr><tr><td>coltura tissutale polistirene 60 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353004</td><td>per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>American Central Scientific Co.</td><td>FFP011</td><td></td></tr><tr><td>Nastro trasparente</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%) + 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>U-118 MG linea cellulare GBM umana</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td>Le cellule sono state trasdotte con un vettore lentivirale che codifica l'intera sequenza dell'ectodominio della proteina di adesione L1CAM e quindi con vettore lentivirale pCodifica ultra-calda mCherry.&nbsp; I numeri di passaggio sono sconosciuti.</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07532-40</td><td>"Air Cadet"</td></tr><tr><td>Affettatrice vibrante</td><td>per tessuti Vibratome</td><td>3000</td><td>per il taglio di fette di cervello vive e fisse</td></tr></tbody></table>

utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

L'embrione di pulcino è stato un sistema modello ideale per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, in particolare per le manipolazioni sperimentali. L'uso dell'embrione di pulcino è stato esteso per studiare la formazione di tumori cerebrali di glioblastoma umano (GBM) in vivo e l'invasività delle cellule tumorali nel tessuto cerebrale circostante. I tumori GBM possono essere formati mediante iniezione di una sospensione di cellule marcate fluorescentmente nel ventricolo del mesencefalo E5 (tectum ottico) in ovo. 
A seconda delle cellule GBM, i tumori compatti si formano casualmente nel ventricolo e all'interno della parete cerebrale e gruppi di cellule invadono il tessuto della parete cerebrale. Sezioni di tessuto spesso (350 μm) di tecta fissa E15 con tumori possono essere immunocolorate per rivelare che le cellule invasori spesso migrano lungo i vasi sanguigni quando analizzate dalla ricostruzione 3D di immagini confocali z-stack. Le fette vive di mesencefalo e proencefalo E15 (250-350 μm) possono essere coltivate su inserti di membrana, dove le cellule GBM marcate con fluorescenza possono essere introdotte in posizioni non casuali per fornire co-colture ex vivo per analizzare l'invasione cellulare, che può anche verificarsi lungo i vasi sanguigni, per un periodo di circa 1 settimana. Queste co-colture ex vivo possono essere monitorate mediante microscopia time-lapse a fluorescenza a campo largo o confocale per osservare il comportamento delle cellule vive. 
Le fette co-coltivate possono quindi essere fissate, immunocolorate e analizzate al microscopio confocale per determinare se l'invasione si è verificata o meno lungo i vasi sanguigni o gli assoni. Inoltre, il sistema di co-coltura può essere utilizzato per studiare potenziali interazioni cellula-cellula posizionando aggregati di diversi tipi e colori cellulari in diverse posizioni precise e osservando i movimenti cellulari. I trattamenti farmacologici possono essere eseguiti su colture ex vivo , mentre questi trattamenti non sono compatibili con il sistema in ovo . Questi due approcci complementari consentono analisi dettagliate e precise del comportamento delle cellule GBM umane e della formazione del tumore in un ambiente cerebrale vertebrato altamente manipolabile.

Gli embrioni di pulcino sono utilizzati per studiare i tumori cerebrali del glioblastoma umano (GBM) in ovo e in co-colture di fette cerebrali ex vivo. Il comportamento delle cellule GBM può essere registrato mediante microscopia time-lapse in co-colture ex vivo, ed entrambi i preparati possono essere analizzati all'endpoint sperimentale mediante analisi confocale 3D dettagliata.

Utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...

Lo scopo della nostra ricerca è cercare di scoprire i meccanismi che promuovono la diffusione delle cellule di glioblastoma nel tessuto cerebrale. Domande specifiche ruotano attorno alle differenze nei tipi o negli stati delle cellule di glioblastoma e ai meccanismi molecolari che promuovono queste cellule ad essere altamente invasive. Ad esempio, in che modo l'espressione di L1CAM promuove l'invasività?Sia i modelli in vitro che in vivo sono insufficienti per analizzare accuratamente il comportamento delle cellule di glioblastoma. I modelli in vitro quasi certamente modificano e semplificano eccessivamente i comportamenti delle cellule in vivo. Mentre i modelli in vivo non consentono una facile osservazione dei comportamenti mentre si verificano, consentendo invece analisi dopo che i comportamenti si sono verificati.Abbiamo dimostrato che il cervello dell'embrione di pulcino è un buon modello per studiare il comportamento delle cellule tumorali del cervello umano sia in vivo che in colture di fette ex-vivo. Abbiamo anche stabilito che l'espressione di L1CAM da parte delle cellule di glioblastoma può avere effetti profondi sulla proliferazione cellulare, l'invasione e la disposizione all'interno del tumore. Oltre ai numerosi vantaggi dell'utilizzo di embrioni di pulcino, il nostro protocollo sferoidale ex-vivo introduce cellule su fette vive senza ulteriori danni, mentre altri metodi di introduzione cellulare comportano il piercing del tessuto e l'impianto di cellule.Inoltre, il protocollo consente l'imaging time-lapse dal vivo che le tecniche in vivo non fanno. I nostri risultati suggeriscono che l'embrione di pulcino è un buon modello per la ricerca sul cancro, in particolare il cancro al cervello, ed è estremamente vantaggioso per la comunità scientifica, in quanto è molto più facilmente disponibile per coloro che potrebbero non avere i fondi, le strutture o le competenze per i modelli di roditori. Continueremo a concentrarci sui meccanismi molecolari che controllano l'invasività delle cellule di glioblastoma nel tessuto cerebrale, in particolare lungo i vasi sanguigni.Un'altra questione cruciale è se le cellule staminali del glioblastoma siano un fenotipo distinto e stabile o uno stato funzionale che può essere adottato quando necessario. Ciò ha enormi implicazioni per i trattamenti.

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Utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

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