Name: Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato con BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Questo metodo consente la ricostruzione tridimensionale e la discriminazione efficace tra steatosi micro e macrovesicolare.

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Questa ricerca è stata finanziata da fondi nazionali ed europei attraverso la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), il Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) e il Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP / 04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Gli autori desiderano ringraziare il supporto di iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, una struttura della Facoltà di Medicina dell'Università di Coimbra e membro dell'infrastruttura nazionale PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), nonché il supporto di FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Tutte le procedure animali eseguite in questo studio sono state approvate dall'Istituto di Coimbra per la ricerca clinica e biomedica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, # 9/2018) e conformi alle direttive nazionali ed europee sulla cura degli animali e alle linee guida ARRIVE.
1. Progettazione sperimentale
<ol><li>Coppia di ratti Wistar maschi di 13 settimane in gabbie ventilate in condizioni ambientali controllate di temperatura (22 °C ± 1 °C), umidità (50%-60%) e luce (ciclo luce-buio 12 ore) e con accesso ad libitum all'acqua del rubinetto e al chow standard per roditori.</li>
	<li>Dopo un periodo di acclimatazione di 2 settimane, assegnare arbitrariamente i ratti in due gruppi.</li>
	<li>Alimentare i gruppi di controllo (CTRL, n = 6) e dieta ricca di grassi (HFD, n = 6) con chow standard e una dieta ricca di grassi (45% kcal / grasso), rispettivamente, per 24 settimane.</li>
	<li>Monitorare il peso corporeo (BW) settimanalmente. Registrare il consumo giornaliero di cibo e bevande per gabbia.</li>
</ol>2. Preparazione del campione di fegato
<ol><li>Dissezione epatica<ol><li>Preparare la pompa peristaltica: far passare il 70% di etanolo attraverso il tubo, collegare un ago da 27 G all'estremità di uscita del tubo e innescare il tubo con soluzione salina ghiacciata (4 °C) tamponata con fosfato (PBS, pH ~ 7,4) (ad esempio, 200 giri / min su una pompa peristaltica con tubo in silicio ID da 1,6 mm, mini set di gocciolamento IV). Regolare il peso corporeo (ad esempio, per un ratto di 100-150 g, utilizzare una portata di circa 10-12 ml / min).</li>
		<li>Anestetizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale utilizzando un protocollo di anestesia (la concentrazione finale di ketamina = 75 mg/kg e la concentrazione finale di medetomidina = 1 mg/kg). NOTA: Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato utilizzando il metodo di risposta al pizzico della punta.</li>
		<li>Posizionare il topo sul vassoio di dissezione.</li>
		<li>Disinfettare accuratamente la pelliccia con etanolo al 70% e asciugarla con un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Usando le forbici, fai un'incisione a forma di "U" attraverso la pelle e taglia sotto il diaframma. Quindi, tagliare la gabbia toracica rostralmente sui bordi per esporre il cuore.</li>
		<li>Mentre il PBS 1x è in esecuzione, passare l'ago attraverso il ventricolo sinistro nell'aorta ascendente e morsetto. Quindi, l'atrio destro viene tagliato per consentire il drenaggio una volta iniziata la perfusione. NOTA: Il fegato dovrebbe iniziare a sbiancarsi quando il sangue viene sostituito con PBS.</li>
		<li>Usando forbici e pinze Dumont, rimuovere accuratamente il fegato e risciacquare con 1x PBS.</li>
		<li>Trasferire il fegato su una capsula di Petri e pesarlo.</li>
		<li>Utilizzando un bisturi, raccogliere campioni di tessuto epatico di 5 mm di spessore dal lato laterale (1 cm dal bordo) del lobo sinistro del fegato per il processo di incorporazione. NOTA Il tessuto rimanente può essere conservato a -80 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporazione del tessuto epatico<ol><li>Preparare un contenitore di ghiaccio secco ed etichettare correttamente i criostampi con l'ID e l'orientamento del campione.</li>
		<li>Posizionare alcune gocce di matrice di crioincorporazione al centro del criomold per ottenere la temperatura di taglio ottimale (OCT).</li>
		<li>Assicurarsi che il campione di tessuto sia correttamente orientato per una sezione trasversale. NOTA: Assicurarsi che il lato che tocca la parte inferiore del criomold sia il lato che verrà sezionato per primo.</li>
		<li>Rilasciare con cautela più OCT sul criomold fino a quando non è completamente coperto. Cerca di evitare la formazione di bolle d'aria. Se necessario, con una pinza semplice, rimuovere eventuali bolle all'interno dello Pt.</li>
		<li>Posizionare rapidamente il criomold con il campione coperto di OCT in un contenitore di ghiaccio secco. NOTA: I tessuti possono essere conservati a -80 °C per 3 anni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sezionamento di tessuti congelati
<ol><li>Regolare la temperatura del criostato (camera: -21 °C; campione: -18 °C) e inserire una nuova lama sterile.</li>
	<li>Posizionare i campioni nel criostato per 30 minuti prima di consentire l'equilibrio della temperatura.</li>
	<li>Creare un singolo strato di OCT sul disco del campione per consentire l'adesione del campione. Lasciare congelare lo Strumento di personalizzazione di Office e montare il campione di tessuto nell'orientamento desiderato. NOTA: la superficie di taglio deve essere parallela alla lama. Per mantenere una buona adesione, posizionare l'estrattore di calore sulla parte superiore del campione. I passaggi precedenti possono anche essere eseguiti in un contenitore di ghiaccio secco con ghiaccio secco.</li>
	<li>Posizionare il campione nella testa del campione e tagliare la superficie del tessuto (alcune sezioni di campione di tessuto da 30 μm).</li>
	<li>Una volta che la regione di interesse è accessibile per il sezionamento, tagliare sezioni spesse 12 μm e posizionarle su vetrini da microscopio etichettati mantenuti a temperatura ambiente (RT). NOTA: per raccogliere la sezione, spostare lentamente il vetrino verso la sezione del tessuto. Ogni vetrino può raccogliere due sezioni di fegato.</li>
	<li>Lasciare asciugare i vetrini per 10 minuti a RT. NOTA: I vetrini possono essere conservati a -20 °C per 6-12 mesi o a -80 °C per un massimo di 3 anni.</li>
</ol>4. Colorazione BODIPY
<ol><li>Scongelare i vetrini in un sistema di colorazione dei vetrini a RT per 30 minuti.</li>
	<li>Lavare con 1x PBS (3x per 5 minuti ciascuno).</li>
	<li>Circondare la sezione con uno strato idrofobo usando una penna barriera.</li>
	<li>Preparare 500 μg/mL di BODIPY 493/503 soluzione madre: sciogliere 1 mg di BODIPY 493/503 in 2 mL di solvente (90% DMSO; 10% 1x PBS). Proteggere dalla luce. Sonicare in un bagno ad ultrasuoni per 1 ora (9,5-10 W) a 37 °C. NOTA: La soluzione può essere conservata a -20 °C per almeno 30 giorni.</li>
	<li>Preparare la soluzione colorante BODIPY (1 μg/ml) aggiungendo 2 μL di soluzione madre BODIPY 493/503 e 0,1 μL di soluzione madre DAPI (5 mg/ml) a 997,9 μL di 1x PBS.</li>
	<li>Incubare i vetrini (75 μL/vetrino) con BODIPY 493/503 (1 μg/mL) e DAPI (0,1 μg/mL) a RT per 40 minuti. NOTA: tenere le diapositive al buio da questo passaggio in poi.</li>
	<li>Lavare i vetrini con 1x PBS (3x per 5 minuti ciascuno).</li>
	<li>Montare i vetrini con vetrini utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza, lasciarli asciugare per 30 minuti e sigillarli con lo smalto. NOTA: I vetrini possono essere conservati a 4 °C fino all'imaging.</li>
</ol>5. Quantificazione dei lipidi
<ol><li>Misurare i livelli sierici di colesterolo totale e TG utilizzando un metodo e un'apparecchiatura automatici e convalidati.</li>
	<li>Misurare i livelli di TG epatici utilizzando un kit di analisi colorimetrica dei trigliceridi (Table of Materials) secondo il protocollo del produttore.</li>
</ol>6. Acquisizione di immagini
<ol><li>Posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio confocale a scansione laser.</li>
	<li>Per la visualizzazione e l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio confocale con obiettivo 20x (planimetria-apocromatica: 20x/0,8).</li>
	<li>Per evitare la diafonia tra BODIPY 493/503 e DAPI, utilizzare la modalità di scansione sequenziale (segnale migliore) sul software confocale.</li>
	<li>Emoziona il BODIPY 593/503 utilizzando la linea laser argon da 488 nm e il DAPI utilizzando la linea laser a 405 nm. Impostare gli intervalli di emissione a 493-589 nm per BODIPY 493/503 e a 410-464 nm per DAPI.</li>
	<li>Utilizzare le seguenti impostazioni: foro stenopeico: 1 UA, risoluzione: 1.024 pixel x 1.024 pixel, profondità di bit: 12, dimensione pixel: 0,415 μm, modalità bidirezionale, velocità di scansione: 7 (~ 1,58 μs/pixel per un obiettivo 20x), media lineare: 2x e zoom digitale: 1. NOTA: I suddetti parametri di scansione devono essere ottimizzati per ogni microscopio confocale e obiettivo utilizzato.</li>
	<li>Impostare il guadagno e il guadagno digitale in modo appropriato in modo che non vengano rilevati pixel saturi sull'indicatore di intervallo. NOTA: correggere il segnale di fondo regolando l'offset.</li>
	<li>Una volta identificati correttamente i LD, acquisire l'immagine con i canali BODIPY e DAPI. NOTA: Tutte le immagini devono essere acquisite nelle stesse condizioni (esposizione e impostazioni generali) per ogni canale colore.</li>
	<li>Per creare immagini ad ampia area (Figura 2), modificare l'obiettivo con obiettivo a10x (plan-neofluar: 10x/0.3).</li>
	<li>Seleziona la modalità Tile Scan e crea mosaici di 5 immagini per 5. NOTA: in questo lavoro, ogni riquadro aveva una sovrapposizione del 10% per unire in modo appropriato le tessere per l'analisi.</li>
	<li>Per creare viste 3D e ortogonali (Figura 3A), posizionare una goccia di olio ad immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e modificare l'obiettivo con una lente obiettivo 40x (plan-neofluar: olio 40x/1,30).</li>
	<li>Selezionare la modalità Z-Stack e, regolando il piano Z, definire la prima e l'ultima posizione per l'acquisizione con una fetta ottica a uno spessore ottimale (~0,5 μm) per garantire che tutte le goccioline vengano catturate. NOTA: Per velocizzare l'acquisizione dell'immagine ed evitare lo sbiancamento, la fetta ottica può essere regolata su una dimensione non ottimale, garantendo almeno il 30% di sovracampionamento per una buona ricostruzione 3D.</li>
	<li>Selezionate il modulo Orto e create viste ortogonali.</li>
	<li>Acquisisci immagini 3D selezionando il modulo 3D seguendo la modalità di rendering della trasparenza con il software del microscopio confocale.</li>
</ol>7. Analisi delle immagini
<ol><li>Elaborare e analizzare le immagini single-plane (ingrandimento 20x) con CellProfiler (versione 4.2.5). NOTA: La pipeline utilizzata in questo lavoro è stata adattata da Adomshick et al.45.</li>
	<li>Fare clic sul modulo Immagini nell'angolo in alto a sinistra della finestra di CellProfiler e caricare le immagini come file .tiff.</li>
	<li>Utilizzare il modulo NamesAndTypes per ordinare tra immagini colorate BODIPY- (droplet) e DAPI- (nuclei) in base ai nomi dei file. Eseguire l'analisi LD solo con immagini colorate con BODIPY.</li>
	<li>Per avviare la costruzione della pipeline, fare clic su Regola moduli e selezionare il modulo ColorToGray per convertire le immagini in immagini in scala di grigi. NOTA: per identificare gli oggetti, sono necessarie immagini in scala di grigi.</li>
	<li>Identificare le goccioline utilizzando il modulo IdentifyPrimaryObjects utilizzando l'immagine in scala di grigi. NOTA: i parametri in questo modulo devono essere regolati per ottenere una buona identificazione LD. In questo lavoro, la definizione di LD con una dimensione compresa tra 6 pixel e 300 pixel e un fattore di correzione soglia di 1,0 ha portato all'identificazione più accurata.</li>
	<li>Per misurare l'intensità dei pixel delle goccioline lipidiche identificate, aggiungere un modulo MeasureObjectIntensity .</li>
	<li>Aggiungere un modulo FilterObjects aggiuntivo per garantire che vengano quantificati solo i segnali più forti mentre i segnali meno intensi siano esclusi dall'analisi finale delle goccioline lipidiche (intensità minima: 0,15; intensità massima: 1 unità arbitraria).</li>
	<li>Per misurare i LD correlati ai dati di output, aggiungere il modulo MeasureObjectSizeShape .</li>
	<li>Aggiungi un modulo OverlayOutlines a questo punto per sovrapporre la goccia identificata sull'immagine originale e, quindi, assicurati che la segmentazione appaia accurata anche sull'immagine non elaborata. NOTA: questo è un passaggio facoltativo (controllo qualità).</li>
	<li>Aggiungi un modulo ExportToSpreadsheet alla fine e fai clic sul pulsante Analizza immagini nell'angolo in basso a sinistra.</li>
</ol>8. Analisi statistica
<ol><li>Esprimere i risultati come media ± errore standard della media (S.E.M.) utilizzando qualsiasi applicazione software di analisi statistica. NOTA: In questo studio, il software GraphPad è stato utilizzato per l'analisi statistica.</li>
	<li>Analizzare la distribuzione dei valori utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov per valutare deviazioni significative dalla normalità. Analizzare i dati parametrici utilizzando il t-test spaiato dello studente. NOTA: valori di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.</li>
</ol>

Valutazione della steatosi epatica con la ricostruzione di goccioline lipidiche a fluorescenza 3D

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la valutazione della LD mirava a sviluppare un nuovo approccio di imaging per la valutazione della steatosi epatica. Data la forte correlazione tra obesità e steatosi epatica, la dieta ricca di grassi in stile occidentale è stata utilizzata per stabilire un modello animale di steatosi epatica26. Un robusto aumento del contenuto di TG epatici è stato confermato da un kit di test colorimetrici quantitativi dei trigliceridi, che ha sugger...

Le goccioline lipidiche (LD), classicamente viste come depositi di energia, sono organelli cellulari specializzati che mediano l'accumulo di lipidi e comprendono un nucleo lipidico neutro idrofobico, che contiene principalmente esteri di colesterolo e trigliceridi (TG), incapsulati da un monostrato fosfolipidico 1,2,3.
La biogenesi LD avviene nel reticolo endoplasmatico (ER), iniziando con la sintesi di triacilglicerolo (TAG) ed esteri sterolici. I lipidi neutri sono diffusi tra i lembi del doppio strato ER a basse concentrazioni, ma si fondono in lenti oleose che crescono e germogliano in goccioline quasi sferiche dalla membrana ER quando la loro concentrazione intracellulare aumenta4. Successivamente, le proteine del doppio strato ER e del citosol, in particolare la famiglia delle proteine perilipina (PLIN), traslocano sulle superfici delle LD per facilitare il germogliamentodi 5,6,7,8,9.
Attraverso la nuova sintesi degli acidi grassi e la fusione o la coalescenza delle LD, le LD crescono in diverse dimensioni. Di conseguenza, la dimensione e il numero di LD differiscono considerevolmente tra i diversi tipi di cellule. Piccole goccioline (300-800 nm di diametro), note come LD iniziali (iLD), possono essere formate da quasi tutte le cellule4. Più tardi nella formazione delle LD, la maggior parte delle cellule è in grado di convertire alcune iLD in LD più grandi che espandono (eLD >1 μm di diametro). Tuttavia, solo specifici tipi di cellule, come adipociti ed epatociti, hanno la capacità di formare LD giganti o sovradimensionati (fino a decine di micron di diametro)4,10.
Le LD svolgono un ruolo molto importante nella regolazione del metabolismo lipidico cellulare, sopprimendo la lipotossicità e prevenendo lo stress ER, la disfunzione mitocondriale e, infine, la morte cellulare causata dagli acidi grassi liberi (FA)11,12,13,14. Inoltre, le LD sono state anche implicate nella regolazione dell'espressione genica, nel sequestro delle proteine di replicazione virale e nel traffico e nella segnalazione di membrana15,16,17. Pertanto, l'errata regolazione della biogenesi della LD è un segno distintivo delle malattie croniche associate alla sindrome metabolica, all'obesità, al diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e / o all'arteriosclerosi, per citarne solo alcuni18,19,20.
Il fegato, come hub metabolico, è principalmente responsabile del metabolismo lipidico immagazzinando ed elaborando i lipidi e, quindi, è costantemente minacciato dalla lipotossicità21. La steatosi epatica (HS) è una caratteristica comune di una serie di malattie epatiche progressive ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di lipidi intracellulari sotto forma di LD citosoliche che, in definitiva, possono portare a disfunzione metabolica epatica, infiammazione e forme avanzate di steatosi epatica non alcolica22,23,24,25. L'HS si verifica quando il tasso di ossidazione ed esportazione degli acidi grassi come trigliceridi all'interno delle lipoproteine a bassissima densità (VLDL) è inferiore al tasso di assorbimento degli acidi grassi epatici dal plasma e dalla sintesi de novo degli acidi grassi26. L'accumulo epatico di lipidi si presenta spesso in due forme - steatosi microvescicolare e macrovescicolare - e queste mostrano caratteristiche citoarchitettoniche distinte27. Tipicamente, la steatosi microvescicolare è caratterizzata dalla presenza di piccole LD disperse in tutto l'epatocita con il nucleo posto centralmente, mentre la steatosi macrovescicolare è caratterizzata dalla presenza di un unico grande LD che occupa la maggior parte dell'epatocita, spingendo il nucleo verso la periferia28,29. In particolare, questi due tipi di steatosi si trovano spesso insieme, e non è chiaro come questi due modelli LD influenzino la patogenesi della malattia, poiché le prove sono ancora incoerenti31,32,33,34. Tuttavia, tale tipo di analisi è spesso impiegato come "standard di riferimento" negli studi preclinici e clinici per comprendere il comportamento dinamico delle LD e caratterizzare la steatosi epatica 29,34,35,36.
Le biopsie epatiche, il gold standard per la diagnosi e la classificazione dell'HS, sono valutate di routine mediante analisi istologica dell'ematossilina e dell'eosina (H & E), dove le goccioline lipidiche sono valutate come vacuoli non colorati nelle sezioni epatiche colorate con H & E37. Sebbene accettabile per la valutazione della steatosi macrovescicolare, questo tipo di colorazione generalmente restringe la valutazione della steatosi microvescicolare38. I coloranti diazo liposolubili, come Oil Red O (ORO), sono classicamente combinati con la microscopia a campo chiaro per analizzare le riserve lipidiche intracellulari, ma questi hanno ancora una serie di svantaggi: (i) l'uso di etanolo o isopropanolo nel processo di colorazione, che spesso causa l'interruzione delle LD native e la fusione occasionale nonostante le cellule siano fissate39; ii) la natura dispendiosa in termini di tempo, in quanto la soluzione ORO richiede la dissoluzione e il filtraggio della polvere fresca a causa della limitata durata di conservazione, contribuendo così a risultati meno coerenti; (iii) e il fatto che ORO colora più di semplici goccioline lipidiche e spesso sovrastima la steatosi epatica38.
Di conseguenza, i fluorofori lipofili permeabili alle cellule, come il rosso del Nilo, sono stati utilizzati in campioni vivi o fissi per superare alcune delle limitazioni di cui sopra. Tuttavia, la natura non specifica della marcatura degli organelli lipidici cellulari restringe ripetutamente le valutazioni LD40. Inoltre, le proprietà spettrali del rosso Nilo variano a seconda della polarità dell'ambiente, che spesso può portare a spostamenti spettrali41.
La sonda fluorescente lipofila 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (lunghezza d'onda di eccitazione: 480 nm; emissione massima: 515 nm; BODIPY 493/503) presenta caratteristiche di idrofobicità che ne consentono il rapido assorbimento da parte delle LD intracellulari, si accumula nel nucleo delle goccioline lipidiche e, successivamente, emette fluorescenza verde brillante12. A differenza del Nilo Red, BODIPY 493/503 è insensibile alla polarità ambientale e ha dimostrato di essere più selettivo, in quanto mostra un'elevata luminosità per l'imaging LD. Al fine di colorare LD neutri, questo colorante può essere utilizzato in cellule vive o fisse e accoppiato con successo con altri metodi di colorazione e / o etichettatura42. Un altro vantaggio del colorante è che richiede poco sforzo per essere inserito in una soluzione ed è stabile, eliminando così la necessità di prepararlo fresco per ogni esperimento42. Anche se la sonda BODIPY 493/503 è stata impiegata con successo per visualizzare la localizzazione e la dinamica delle LD nelle colture cellulari, alcuni rapporti hanno anche dimostrato l'uso affidabile di questo colorante come strumento di imaging LD in tessuti tra cui il muscolo del vasto laterale umano43, il muscolo soleo del ratto 42 e l'intestino del topo44.
Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su BODIPY 493/503 come approccio analitico alternativo per la valutazione del numero, dell'area e del diametro LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica. Questa procedura copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, le condizioni di colorazione, l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati.

<table><tbody><tr><td>Tubo in silicone con diametro interno da 1,6 mm, mini set di gocciolamento per flebo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td><td>Sigma-Aldrich, Lione, Francia</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo al 70%</td><td>Honeywell</td><td>10191455</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td>Utilizzato per progettare le figure</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore automatico Hitachi 717</td><td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germania</td><td>8177-30-0010</td><td></td></tr><tr><td>Penna barriera (Liquid blocker super pap pen)</td><td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Leica</td><td>221052145</td><td>Utilizzato nel criostato</td></tr><tr><td>Cell Profiler versione 4.2.5</td><td>https://cellprofiler.org/releases/</td> <td>Utilizzato per analizzare le immagini</td><td></td>acquisite</tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Menzel-Glaser, Germania</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Tissue-Tek</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat (incluso disco per campioni ed estrattore di calore) CM3050 S</td><td>Leica Biosystems</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td><td>D-8418</td><td>Utilizzato per sciogliere la bodipia per la soluzione madre da 5 mg/mL. ATTENZIONE: Tossico e infiammabile. I vapori possono causare irritazione . Manipolare in una cappa fume . Evitare il contatto diretto con la pelle. Indossare guanti di gomma, occhiali protettivi per gli occhi .</td></tr><tr><td>Contenitore per ghiaccio secco (raffreddatore di polistirolo)</td><td>Novolab</td><td>A26742</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in vetro (H 25 mm, &oslash; 150 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td>Utilizzato per pesare il fegato dopo la dissezione</td></tr><tr><td>Glycergel</td><td>DAKO Omnis</td><td>S303023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software, versione 9.3.1</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta ricca di grassi</td><td>Envigo, Barcellona, Spagna</td><td>MD.08811</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Nimatek&nbsp; 100 mg/mL)</td><td>Dechra</td><td>791/01/14DFVPT</td><td>Utilizzato ad una concentrazione finale di 75 mg/kg</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser&nbsp; (unità di rilevamento QUASAR; )</td><td>Carl Zeiss, germania</td><td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscopio</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina (Sedatore 1 mg/mL)</td><td>Dechra</td><td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td><td>Utilizzato a una concentrazione finale di 1 mg/kg</td></tr><tr><td>Ago</td><td>BD microlancia</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>No 15 Bisturi sterile in acciaio al carbonio Lama</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) e 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td><td>&nbsp; Carl Zeiss, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennelli</td><td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td><td>&nbsp; Utilizzato per gestire criosezioni</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica (Minipuls 3)</td><td>Gilson</td><td>1004170</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH ~ 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich, Lione, Francia</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi, 125 mm (5"), n. 3</td><td>Swann-Morton</td><td>0208</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di colorazione per vetrini StainTray</td><td>Simport Scientific</td><td>M920</td><td></td></tr><tr><td>Dieta standard</td><td>&nbsp; Mucedola</td><td>4RF21</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus vetrini per microscopio</td><td>Menzel-Glaser, Germania</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di montaggio Tissue-Tek OCT</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>361603E</td> Kit di test colorimetrici <td></td></tr><tr><td>per trigliceridi</td><td>Cayman Chemical</td><td>10010303</td><td></td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>&nbsp;TK 52</td><td></td></tr><tr><td>Molla Vannas forbici - 3 mm tagliente</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Nero software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3d per la valutazione della steatosi epatica

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli specializzati che mediano l'accumulo lipidico e svolgono un ruolo molto importante nel sopprimere la lipotossicità e prevenire le disfunzioni causate dagli acidi grassi liberi (FA). Il fegato, dato il suo ruolo critico nel metabolismo dei grassi del corpo, è costantemente minacciato dall'accumulo intracellulare di LD sotto forma di steatosi epatica sia microvescicolare che macrovescicolare. La caratterizzazione istologica delle LD si basa tipicamente su coloranti diazo liposolubili, come la colorazione Oil Red O (ORO), ma una serie di svantaggi ostacola costantemente l'uso di questa analisi con campioni di fegato. Più recentemente, i fluorofori lipofili 493/503 sono diventati popolari per visualizzare e localizzare le LD a causa del loro rapido assorbimento e accumulo nel nucleo delle goccioline lipidiche neutre. Anche se la maggior parte delle applicazioni sono ben descritte in colture cellulari, ci sono meno prove che dimostrano l'uso affidabile di sonde fluorofore lipofile come strumento di imaging LD in campioni di tessuto. Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su dipirrometene di boro (BODIPY) 493/503 per la valutazione delle LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica indotta da dieta ricca di grassi (HFD). Questo protocollo copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, la colorazione BODIPY 493/503, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Dimostriamo un aumento del numero, dell'intensità, del rapporto di area e del diametro delle LD epatiche durante l'alimentazione HFD. Utilizzando proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, è stato possibile osservare l'intero contenuto di lipidi neutri nel nucleo LD, che apparivano come goccioline quasi sferiche. Inoltre, con il fluoroforo BODIPY 493/503, siamo stati in grado di distinguere microvescicole (1 μm < d ≤ 3 μm), vescicole intermedie (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovescicole (d > 9 μm), consentendo la corretta discriminazione della steatosi microvescicolare e macrovescicolare. Nel complesso, questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 è uno strumento affidabile e semplice per la caratterizzazione epatica della LD e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici.

L'esecuzione di successo di questa tecnica dovrebbe comportare una chiara colorazione delle goccioline lipidiche per la caratterizzazione simultanea della morfologia LD (forma e densità del nucleo lipidico basata sulla ricostruzione 3D) insieme alla loro distribuzione spaziale, numero per area totale e dimensione media (valutata con la pipeline sopra descritta, Figura 1).
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Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Questo approccio di imaging consente la ricostruzione tridimensionale della deposizione di goccioline lipidiche epatiche e supera i principali svantaggi della colorazione istologica classica che ha ridotto la discriminazione di successo tra steatosi micro e macrovescicolare. La valutazione della steatosi microvescicolare è quando vengono utilizzate colorazioni istologiche gold standard, sia che rosso olio, a causa della rottura e della fusione occasionale di goccioline lipidiche native. Il pro-BODIPY offre un'alternativa ai protocolli di routine per la valutazione della steatosi epatica microvescicolare grazie alla sua giusta idrofobicità per un rapido assorbimento e un'efficace marcatura delle goccioline lipidiche, essendo non solo insensibile alla polarità ambientale, ma anche estremamente selettivo.Questo approccio di imaging racchiude applicazioni più ampie in combinazione con tecniche di immunochimica, consentendo la rilevazione simultanea di altri antigeni subcellulari che possono far progredire lo studio della biogenesi e della dinamica delle goccioline lipidiche, alla base della steatosi epatica micro e macrovescicolare.

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In questo video, dimostriamo la colorazione in vitro di lipidi neutri negli epatociti per rilevare la steatosi epatica o l'eccessivo accumulo di grasso nel fegato. Il grasso in eccesso si accumula nelle cellule sotto forma di goccioline lipidiche. L'olio rosso O è un colorante liposolubile che si lega ai lipidi neutri intracellulari in queste goccioline lipidiche. Se osservate al microscopio ottico, queste goccioline lipidiche intracellulari appaiono di colore rosso intenso.

Colorazione Oil Red O: una tecnica per colorare i lipidi neutri negli epatociti per rilevare la steatosi epatica in vitro

Qui, vengono descritti metodi ottimizzati per generare modelli in vivo e in vitro di steatosi epatica e per analizzare i fenotipi steatotici e i relativi parametri fisiologici.

Analisi ottimizzata delle<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Epatica steatosi

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato per indurre la steatosi vescicolare del fegato in cellule HepaRG differenziate con l'oleate di sodio acido grasso e impieghiamo metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo di lipidi, compresi gli anti-Stokes coerenti Microscopia a dispersione Raman (CARS), analisi citofluorimetrica, colorazione Oo rosso olio e qPCR.

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.

Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

Il presente protocollo descrive come utilizzare l'olio rosso O per tingere le goccioline lipidiche (LD), calcolare la dimensione e il numero di LD in un modello di epatociti grassi indotto da acidi grassi e utilizzare BODIPY 493/503 per osservare il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD mediante imaging di cellule vive.

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Il presente studio descrive metodologie basate sulla decellularizzazione per la visualizzazione e la quantificazione della deposizione di tessuto adiposo intramuscolare (IMAT) attraverso il volume muscolare intatto, nonché la quantificazione delle metriche dei singoli adipociti che compongono l'IMAT.

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Le malattie degenerative dell'occhio che colpiscono lo strato di epitelio pigmentato retinico dell'occhio hanno origini monogeniche e poligeniche. Diversi modelli di malattia e un'applicazione software, LipidUNet, sono stati sviluppati per studiare i meccanismi della malattia, nonché potenziali interventi terapeutici.

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Questo articolo descrive l'uso di cellule HepG2 indotte da acido oleico come modello per la malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica.

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