Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica
10 marzo 2023
Questo protocollo descrive in dettaglio lo screening di cristallizzazione ad alto rendimento, che va dalla preparazione della piastra di microdosaggio di 1.536 alla fine di una finestra temporale sperimentale di 6 settimane. Sono inclusi dettagli sulla configurazione del campione, sull'imaging ottenuto e su come gli utenti possono eseguire analisi utilizzando un'interfaccia utente grafica abilitata all'intelligenza artificiale per identificare in modo rapido ed efficiente le condizioni di cristallizzazione macromolecolare.
Ottenere un cristallo per eseguire esperimenti di diffrazione rimane una sfida perché è difficile prevedere quali parametri influenzeranno la cristallizzazione. Favoriamo lo sperimentatore esaminando le condizioni di cristallizzazione 1536 in una singola lastra e utilizzando tecnologie di imaging avanzate per identificare anche i più piccoli colpi di cristallo. Le tecniche di biologia strutturale si stanno sviluppando rapidamente e il campo è stato rivoluzionato dalla previsione della struttura computazionale.
Ciò ha fatto sì che il campo diventasse più integrativo con diversi approcci sperimentali o computazionali più comunemente combinati per generare una rappresentazione più dettagliata e accurata dei meccanismi biologici. La generazione di colpi di cristallo è un passo fondamentale per eseguire esperimenti di diffrazione di raggi X a cristallo singolo e per sviluppare tecniche come la micro ED e la cristallografia seriale. Utilizzando metodi di imaging avanzati, UVTBF e SHG insieme alla potenza dell'algoritmo Marco ci aiutano a identificare cristalli utili su tutte le scale di dimensioni.
I nostri metodi di cristallizzazione ad alta produttività hanno generato una grande quantità di dati per sondare domande riguardanti l'efficienza dei componenti del cocktail di cristallizzazione. L'imaging specializzato che facciamo rivela come i metodi ottici non lineari possono essere utilizzati per rilevare cristalli infinitamente piccoli. Trovare le condizioni di cristallizzazione è fondamentale per i metodi strutturali basati sui cristalli, che rappresentano il 90% di tutti i modelli strutturali nella banca dati sulle proteine.
Nel 2021, quasi 2 milioni di file sono stati scaricati al giorno dal PDB, sottolineando l'impatto che le strutture hanno nel preparare la strada a ulteriori indagini scientifiche.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo di screening per la cristallizzazione ad alto rendimento, dettagliando la preparazione di piastre per microdosaggio da 1.536 pozzetti e le procedure sperimentali successive nell'arco di sei settimane. Si sottolinea l'utilizzo di tecnologie avanzate di imaging e di un'interfaccia grafica utente abilitata all'intelligenza artificiale per un'analisi efficiente delle condizioni di cristallizzazione di macromolecole.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Strutturale
- Tecniche di Cristallizzazione
- Tecnologie di Imaging
Sfondo
- La cristallizzazione è fondamentale per gli esperimenti di diffrazione a raggi X.
- I metodi avanzati di imaging migliorano il rilevamento di cristalli di piccole dimensioni.
- La previsione computazionale della struttura ha trasformato la biologia strutturale.
- Condizioni di cristallizzazione efficienti sono essenziali per i modelli strutturali.
Scopo dello studio
- Per semplificare l'identificazione delle condizioni di cristallizzazione.
- Per utilizzare metodi ad alto rendimento per ottenere risultati positivi nella cristallizzazione.
- Per integrare tecnologie di imaging con protocolli di cristallizzazione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di piastre a 1.536 pozzetti con soluzioni cocktail specifiche.
- Utilizzo di sistemi robotizzati per la movimentazione dei liquidi per un dosaggio preciso.
- Applicazione di tecniche di imaging UV-TPF e SHG.
- Analisi delle immagini di cristallizzazione mediante un'interfaccia abilitata all'intelligenza artificiale.
Risultati principali
- Identificazione di cristalli positivi su diverse scale dimensionali.
- Acquisizione di immagini riuscita di cristalli oscurati da precipitato.
- Dati generati per la valutazione dell'efficacia dei cocktail di cristallizzazione.
- Integrazione dell'acquisizione di immagini automatizzata per tutta la durata del processo sperimentale.
Conclusioni
- I metodi ad alto rendimento migliorano significativamente la schermatura della cristallizzazione.
- Le tecniche avanzate di imaging sono fondamentali per rilevare cristalli di piccole dimensioni.
- Gli strumenti di intelligenza artificiale facilitano un'analisi efficiente delle condizioni di cristallizzazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La schermatura della cristallizzazione ad alto rendimento è fondamentale per accelerare i flussi di lavoro della biologia strutturale e consentire un'identificazione rapida dei cristalli proteici necessari per gli studi di diffrazione a raggi X. L'imaging automatizzato e l'analisi guidata dall'intelligenza artificiale aumentano l'affidabilità predittiva e la riproducibilità, influenzando direttamente i punti critici della scoperta precoce e dell'identificazione dei composti promettenti. Queste capacità supportano la progettazione di farmaci basata sulla struttura e la riduzione del rischio meccanicistico su tutta la linea di prodotti nella ricerca e sviluppo del settore biofarmaceutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Consente un'analisi rapida della cristallizzabilità delle proteine per supportare la validazione strutturale dei bersagli.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo dati strutturali ad alta risoluzione per i bersagli candidati.
- Facilita la previsione affidabile nelle decisioni di selezione e triage dei bersagli.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi cristallini validati per flussi di lavoro di screening basati sulla struttura.
- Standardizza le condizioni di cristallizzazione e l'acquisizione delle immagini, garantendo riproducibilità e valutazione quantitativa dei risultati positivi.
- Permette lo screening scalabile e automatizzato per una valutazione affidabile dei composti e il riutilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la generazione di dati strutturali a bersagli proteici rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Permette un avanzamento proporzionato al rischio fornendo informazioni strutturali per la selezione di candidati preclinici.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica integrando approcci computazionali e sperimentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di cristallizzazione e analisi dell'immagine ad alto rendimento collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la ricerca preclinica fornendo una piattaforma standardizzata e scalabile per l'analisi strutturale.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo un'analisi strutturale rapida dei bersagli.
- Screening: Fornisce output di imaging quantitativi e riproducibili per un'identificazione robusta dei risultati positivi e la prontezza del saggio.
- Analisi: Offre un punteggio automatizzato guidato dall'intelligenza artificiale e l'integrazione di metadati per un confronto efficiente delle condizioni di cristallizzazione.
- Ricerca Translazionale: Garantisce la continuità degli approfondimenti strutturali dalla scoperta fino alla validazione preclinica quando allineata a bersagli rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile ad alto rendimento per iniziative di ricerca e sviluppo basate sulla struttura continue nel tempo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'incertezza meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per la cristallizzazione e l'imaging.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go e un avanzamento efficiente in termini di capitale dei programmi di biologia strutturale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento dei progetti di scoperta di farmaci potenziati da dati strutturali, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella cristallizzazione delle proteine, nelle modalità di imaging e negli strumenti di analisi basati sull'intelligenza artificiale.
- Richiede l'accesso a sistemi robotizzati per la manipolazione dei liquidi, sistemi di imaging avanzati e infrastrutture computazionali.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i team per quanto riguarda protocolli e pratiche di gestione dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse classi di proteine o per affrontare specifiche difficoltà nella cristallizzazione.
- È opportuno considerare i limiti relativi alla produttività e all'imaging nel caso di bersagli particolarmente grandi o complessi.
