Name: Una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Scopri la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo per studi di neuroscienza e istologia. Questo metodo garantisce sezioni piatte e intatte essenziali per analisi immunohistochimiche di alta qualità.

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Per il presente studio, gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'UCSF e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Qui sono stati utilizzati topi maschi e femmine adulti di 8-12 settimane C57BL/6 (allevati internamente).
1. Preparazione del campione DRG
<ol><li>Anestetizzare i topi con Avertin al 2,5% (vedi Tabella dei Materiali). Garantire un'anestesia adeguata in caso di mancata risposta alla stimolazione dolorosa. Perfondere gli animali per via transcardiaca con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da formaldeide al 4%, come descritto in precedenza14,15,16.</li>
	<li>Sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale, come descritto in precedenza14,15,16.</li>
	<li>Post-fissare i DRG sezionati in formaldeide al 4% per 3 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettere i DRG in saccarosio al 30% in PBS a 4 °C per una notte.</li>
	<li>Preparazione della temperatura di taglio ottimale di base (OCT)<ol><li>Aggiungere il composto OCT (vedere la tabella dei materiali) per coprire la superficie superiore del blocco di alluminio e congelare a -20 °C per 5-10 minuti (Figura 1A).</li>
		<li>Tagliare la parte superiore dell'OCT utilizzando il criostato (vedere la tabella dei materiali) a uno spessore di 30 μm fino a quando la sua superficie non è piatta come l'OCT di base (Figura 1B).</li>
		<li>Segnare nella parte inferiore (a ore sei) dell'OCT di base per segnarne l'orientamento, prima di togliere il blocco di alluminio dal criostato (Figura 1C).</li>
		<li>Nei passaggi successivi, mantenere il segno a ore sei per mantenere lo stesso orientamento, il che può portare a ottenere più sezioni del campione DRG. NOTA: Se l'orientamento viene perso e il campione DRG viene tagliato con un'angolazione diversa, il campione DRG non può essere tagliato completamente dall'alto verso il basso, il che lascerà alcuni campioni lasciati fuori sull'OCT di base e sprecati, poiché l'OCT di base si incontrerà durante il tentativo di tagliare il campione DRG (Figura 1C).</li>
	</ol></li>
	<li>Esecuzione dell'incorporamento OCT di DRG<ol><li>Asciugare il tessuto DRG prima di metterlo sull'OCT.<ol><li>Prima di aggiungere il DRG al blocco, assicurarsi di rimuovere la soluzione di saccarosio/PBS al 30% intorno al campione.</li>
			<li>Asciugare il campione DRG posizionandolo su una capsula di Petri asciutta (Figura 2A) e spostandolo da una posizione all'altra due o tre volte con una pinzetta asciutta (Figura 2B).</li>
			<li>Asciugare le pinzette con un panno privo di lanugine prima di spostare un altro campione DRG (Figura 2C).</li>
		</ol></li>
		<li>Mettere il DRG asciutto sull'OCT di base.<ol><li>Con una pinzetta asciutta, posizionare il DRG asciutto sull'OCT di base a ore 12 (Figura 1D).</li>
			<li>Mantenere una distanza di almeno 5 mm tra il bordo superiore del DRG e il bordo superiore dell'OCT di base.</li>
			<li>Posizionare la parte dorsale del DRG a ore 12 e la parte ventrale a ore sei (Figura 1D).</li>
		</ol></li>
		<li>Incorporare il tessuto DRG con OCT.<ol><li>Aggiungere altro OCT per coprire l'intero campione DRG in una forma rotonda o ovale, con il DRG al centro (Figura 1E).</li>
			<li>Assicurarsi che il bordo superiore dell'OCT copra il DRG sul bordo superiore dell'OCT di base (Figura 1F), in quanto ciò facilita il trasferimento della sezione sul vetrino (Figura 3A). NOTA: Se l'OCT di copertura si trova al centro dell'OCT di base, il bordo superiore dell'OCT di base bloccherà il vetrino per raccogliere la sezione (Figura 3B).</li>
			<li>Congelare il campione OCT e DRG di copertura a -20 °C per altri 5 minuti (Figura 1G). Non tagliare l'OCT attorno al campione DRG.</li>
			<li>Tagliare la parte superiore del coperchio OCT a uno spessore di 30 μm fino a quando il DRG non è visibile.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Criosezione del DRG
<ol><li>Modificare lo spessore della sezione del criostato a 12 μm per tagliare le sezioni DRG sul vetrino (Figura 1H).</li>
	<li>Tenere la sezione OCT in basso con un piccolo pennello raffreddato a -20 °C. NOTA: È importante non tagliare completamente l'intera sezione, ma lasciare 1-3 mm non tagliati (Figura 1I).</li>
	<li>Utilizzare l'estremità di una pinzetta a temperatura ambiente per toccare delicatamente la parte inferiore (posizione a ore sei) della sezione in modo che aderisca alla superficie della piattaforma (Figura 1J). In questo modo si evita che la sezione si curvi all'indietro in un rotolo, il che rende difficile la raccolta della sezione sulla slitta. NOTA: Quando la parte inferiore della sezione aderisce alla superficie della piattaforma e la parte superiore della sezione si collega ancora con l'OCT di copertura, la sezione ha una forma piatta (Figura 1K), rendendo molto più facile la raccolta della sezione sulla diapositiva.</li>
	<li>Prendi un vetrino di vetro caricato (vedi Tabella dei materiali) e posiziona lentamente il vetrino sulla sezione. Non appena la sezione inizia ad aderire alla slitta, tirare delicatamente la slitta all'indietro (Figura 1L).</li>
	<li>Seguire la stessa procedura per ottenere più sezioni DRG sulla diapositiva senza sovrapporle (Figura 1M). Assicurarsi che una nuova sezione DRG non venga posizionata sopra l'OCT di un'altra sezione DRG (Figura 4), poiché tale sezione non può rimanere bene sul vetrino e può essere lavata via durante il processo di colorazione immunochimica.</li>
</ol>3. Colorazione Nissl della sezione DRG sul vetrino
<ol><li>Lavare le sezioni per 10 minuti in PBS più Triton X-10 allo 0,1%. Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS.</li>
	<li>Applicare una colorazione Nissl 1:300 (vedi Tabella dei materiali) sul vetrino e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la sezione con PBS più Triton X-100 allo 0,1%. Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS per 5 minuti e poi per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Applicare il fluoromount-G 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (vedi Tabella dei materiali) per coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti.</li>
</ol>

Criosezionazione del ganglio della radice dorsale del topo

<ol><li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264(2020).</li>
<li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+study+of+oxytocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).</li>
<li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain%3A+implications+for+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+Research%22%5BJournal%5D)">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li>
<li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li>
<li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+circuit+mechanisms+of+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).</li>
<li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms%3A+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li>
<li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury%3A+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li>
<li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li>
<li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBA1%2FGARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li>
<li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li>
<li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).</li>
<li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).</li>
<li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li>
<li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury%3A+roles+in+inflammation%2C+cell+death+and+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li>
<li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+outgrowth%2C+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).</li>
<li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+Linking+structure+with+polarity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiolology%22%5BJournal%5D)">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li>
<li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li>
<li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752(2021).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRGquant%3A+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce una semplice procedura passo-passo per il sezionamento del criostato del DRG del topo per ottenere sezioni DRG di alta qualità su vetrini in modo affidabile. Ci sono quattro passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il campione DRG e le pinzette devono essere asciutti prima di mettere il campione DRG sull'OCT di base. Qualsiasi liquido che circonda il campione DRG formerà un guscio di ghiaccio attorno ad esso, con il risultato che le sezioni DRG si separano dall'OCT e si curvono. In ...

Il ganglio della radice dorsale (DRG) contiene i neuroni sensoriali primari, i macrofagi tissutali e le cellule satelliti che circondano i neuroni sensoriali primari 1,2,3,4. È una struttura anatomica chiave nell'elaborazione di segnali innocui e nocivi e svolge un ruolo critico nel dolore, nel prurito e in vari disturbi dei nervi periferici 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale del topo14,15,16, la criosezione del tessuto DRG rimane impegnativa poiché il tessuto DRG è piuttosto piccolo e le sezioni del criostato dei campioni DRG tendono a curvarsi in rotoli, rendendo difficile il trasferimento corretto delle sezioni del criostato sui vetrini. Tuttavia, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per gli studi di immunoistochimica e la struttura dei neuroni sensoriali DRG 17,18,19,20,21,22,23. Inoltre, poiché i risultati del sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno rivelato la notevole eterogeneità dei neuroni sensoriali DRG sia nell'uomo24 che nei topi25, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per studiare il ruolo funzionale di diverse cellule DRG in varie condizioni fisiologiche e patologiche.
Sebbene la tecnica di purificazione dei tessuti sia stata applicata per studiare la ricostruzione 3D del DRG26 come tecnica alternativa di criosezione del DRG, la tecnica di purificazione dei tessuti richiede tempo e lavoro. In confronto, la criosezione del DRG è rapida e relativamente facile da eseguire, e quindi rimane una tecnica chiave per l'immunoistochimica e gli studi di struttura del DRG e di altre regioni del sistema nervoso centrale. Tuttavia, ottenere sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini rimane una sfida nella ricerca neuroscientifica a causa delle minuscole dimensioni del campione di tessuti, come il DRG e alcune regioni cerebrali, e non esiste un articolo che descriva il protocollo ottimale a questo punto per la criosezione di campioni di tessuto di piccole dimensioni, come i DRG di topo.
Questo protocollo fornisce una tecnica semplice e passo-passo per il sezionamento criostatico del DRG di topo per ottenere in modo affidabile il maggior numero di sezioni DRG di alta qualità sui vetrini per i successivi studi DRG. Sebbene sia stata progettata specificamente per la criosezione di campioni DRG, questa tecnica può potenzialmente essere utilizzata per la criosezione di vari altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.

<table><tbody><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td>Anestetizzare l'animale</td></tr><tr><td>Epredia&nbsp; Criotomo Criostato Criocassette Diaframma 25 mm Tratteggiato</td><td>Fisherbrand</td><td>1910</td><td>Tenere la sezione OCT in basso&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzetta Ergo</td><td>Fisherbrand</td><td>S95310</td><td>Utilizzando l'estremità di una pinzetta per toccare delicatamente il fondo (6 o' orologio) della sezione in modo che aderisca alla superficie della piattaforma per evitare che la sezione si pieghi all'indietro in un rotolamento&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Vetrini per microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>Per raccogliere la sezione DRG&nbsp;</td></tr><tr><td>Penne per marcatura</td><td>Fisherbrand</td><td>133794</td><td>&nbsp; Segna l'orientamento della base OCT</td></tr><tr><td>Scigen&nbsp; Tissue-Plus O.C.T. Composto</td><td>Fisherbrand</td><td>&nbsp; 23730571</td><td>Terreno di inclusione per campioni di tessuto congelati per garantire una temperatura di taglio ottimale (O.C.T.).</td></tr></tbody></table>

una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

Le sezioni del criostato del ganglio della radice dorsale (DRG) di topo di alta qualità sono fondamentali per una corretta colorazione immunochimica e studi di RNAscope nella ricerca di dolore infiammatorio e neuropatico, prurito e altre condizioni neurologiche periferiche. Tuttavia, rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini a causa delle minuscole dimensioni del campione del tessuto DRG. Finora, non esiste un articolo che descriva un protocollo ottimale per la criosezione DRG. Questo protocollo presenta un metodo passo-passo per risolvere le difficoltà frequentemente incontrate associate alla criosezione DRG. L'articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dai campioni di tessuto DRG, posizionare le sezioni DRG sul vetrino rivolte verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni sul vetrino senza curvare verso l'alto. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per la criosezione dei campioni DRG, può essere applicato per la criosezione di molti altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.

L'attuale studio ha raccolto circa 16 sezioni DRG continue e di alta qualità da un topo L4 DRG. Le sezioni ottenute erano prive di qualsiasi distorsione. La Figura 1 illustra la procedura passo-passo per la criosezione. La rimozione del liquido in eccesso dalle sezioni di tessuto è mostrata nella Figura 2. Il processo di incorporazione OCT dei tessuti è evidenziato nella Figura 3. La Figura 4 mostra il ...

Di seguito viene presentato lo sviluppo per l'acquisizione costante di sezioni criostatiche gangliari a radice dorsale di alta qualità.

Una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

Rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato del ganglio della radice dorsale del topo di alta qualità, intatte e piatte. La ricerca mira a rispondere a come acquisire la sezione ideale del criostato del ganglio della radice dorsale del topo. Questo protocollo fornisce una semplice tecnica passo-passo per la sezione criostatica del DRG del topo nelle sezioni del criostato DRG del topo di alta qualità, intatte e piatte.Questo articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dal tessuto del campione DRG di topo, posizionando le sezioni DRG sui vetrini rivolti verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni DRG senza curvare verso l'alto. Una delle principali sfide è che le sezioni OCT del mouse DRG tendono a curvarsi in un rotolo, rendendo difficile il posizionamento sul vetrino. È anche difficile acquisire sezioni sufficienti da un campione a causa delle piccole dimensioni del DRG del topo.

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Neuroscienze

Vi presentiamo un metodo per immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale. L'approccio può essere utilizzata per identificare specifici siti di legame fattore di trascrizione e di importanti modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA per la rigenerazione degli assoni danneggiati sia nel sistema nervoso periferico e centrale.

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Questo video dimostra un protocollo privo di enzimi per isolare i macrofagi dal ganglio della radice dorsale di topo (DRG) utilizzando una tecnica di dissociazione meccanica. Dopo l'omogeneizzazione del tessuto DRG appena raccolto, vengono utilizzati anticorpi contro i recettori della superficie cellulare sui macrofagi per marcare le cellule in modo fluorescente, seguito dall'esecuzione della citometria a flusso per confermare la presenza di macrofagi nel campione.

Isolamento dei macrofagi dal ganglio della radice dorsale del topo mediante dissociazione meccanica

Questo video mostra un metodo per raccogliere neuroni dai gangli della radice dorsale (DRG). Il DRG della colonna vertebrale di un ratto viene isolato, trattato con enzimi e quindi dissociato meccanicamente per ottenere una sospensione unicellulare. I neuroni vengono separati dalle cellule gliali mediante centrifugazione a gradiente di densità e coltivati in un mezzo di crescita.

Una tecnica per la raccolta e la dissociazione dei gangli della radice dorsale per le colture neuronali

Qui, presentiamo un protocollo per l'estrusione idraulica del midollo spinale, nonché l'identificazione e l'isolamento di specifici gangli della radice dorsale (DRG) nello stesso roditore. Rispetto ai metodi standard di isolamento del midollo spinale, questo metodo è significativamente più veloce e riduce il rischio di danni ai tessuti.

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

Qui presentiamo un protocollo di dissociazione meccanica per isolare rapidamente i macrofagi dal ganglio della radice dorsale per la fenotipizzazione e l'analisi funzionale.

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

Viene presentato un comodo metodo di perfusione alimentato a gravità per l'analisi istologica del sistema nervoso centrale del topo. Il rilevamento immunofluorescente della α-sinucleina fosforilata è dimostrato in un modello murino di malattia di Parkinson. Questo lavoro descrive anche in modo completo le fasi di perfusione transcardica, dissezione, congelamento / incorporamento dei tessuti e sezionamento congelato.

Un metodo di perfusione transcardica alimentato per gravità per l'analisi istologica del sistema nervoso centrale del topo

Questo articolo descrive un protocollo di immunopanning per i gangli della radice dorsale del topo adulto. Aderendo agli anticorpi alle piastre di coltura, possiamo selezionare e rimuovere negativamente le cellule non neuronali. Mostriamo che le colture sono arricchite per i neuroni utilizzando questo protocollo, consentendo uno studio approfondito delle risposte neuronali alla manipolazione.

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Questo articolo presenta una manipolazione per il trattamento della compressione cronica del ganglio della radice dorsale nei ratti utilizzando la terapia Tuina, insieme a un metodo per valutarne l'efficacia in base al comportamento del dolore e ai risultati istopatologici.

Effetto analgesico di Tuina su modelli di ratto con compressione del dolore al ganglio della radice dorsale

Il presente protocollo descrive una strategia pratica per accelerare la fase di verifica delle coordinate di iniezione stereotassiche prima di eseguire il tracciamento virale utilizzando coloranti e sezioni congelate.

Validazione preliminare delle coordinate di iniezione stereotassiche tramite criosezione

I gangli della radice dorsale (DRG) contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali primari e trasmettono segnali sensoriali periferici al midollo spinale. Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione DRG del muro che supporta l'isolamento standardizzato dei gangli strutturalmente intatti, l'identificazione anatomica segmentale, una guida intuitiva per gli utenti principianti e la riduzione del danno procedurale ai tessuti.

Dissezione e isolamento dei gangli dorsali della radice del topo

Scopri la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo per studi di neuroscienza e istologia. Questo metodo garantisce sezioni piatte e intatte essenziali per analisi immunohistochimiche di alta qualità.

Una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo

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