Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata
28 aprile 2023
Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d'oro basata sul meccanismo di soppressione dell'autonucleazione.
Il rilevamento e la localizzazione delle proteine sono essenziali nella ricerca biologica. Il nostro protocollo descrive una nuova tecnologia di etichettatura EM che utilizza tag codificati geneticamente che consente la visualizzazione di singole molecole in situ con un'ultrastruttura ben conservata. È fondamentale evitare un'eccessiva fissazione.
Il metodo di etichettatura si basa sull'attività delle cisteine nelle etichette, che sono altamente sensibili alla reticolazione aldeidica. Il nostro protocollo evita l'uso di fissativi aldeidici e preserva l'attività del tag e l'ultrastruttura. allo stesso tempo.
L'etichettatura EM è sempre stata impegnativa, soffrendo di scarsa morfologia o etichettatura inefficiente. I nostri protocolli sintetizzano nanoparticelle in situ direttamente sulle singole proteine per fornire una localizzazione chiara e precisa delle proteine bersaglio, con un elevato rapporto segnale-rumore, alta efficienza e specificità. Finora abbiamo ottenuto un'eccellente etichettatura in proteine isolate, cellule E.coli, cellule di lievito e cellule HeLa.
Esploreremo e ottimizzeremo il metodo per l'applicazione a campioni di tessuto. La combinazione delle tecnologie crio-FIB e crio-EM prevalenti ci consentirà di affrontare importanti questioni biologiche.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnologia di marcatura per microscopia elettronica (EM) progettata per rilevare proteine marcate con metalotioneina all'interno delle cellule. Sfruttando un meccanismo per sopprimere l'autonucleazione, il metodo consente una visualizzazione precisa a livello di singola molecola preservando al contempo l'ultrastruttura cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Microscopia
- Localizzazione e rilevamento delle proteine
Sfondo
- La rilevazione e la localizzazione delle proteine sono fondamentali per varie applicazioni della ricerca biologica.
- I metodi tradizionali di marcatura al microscopio elettronico spesso compromettono la morfologia e l'efficienza.
- I marcatori codificati geneticamente possono migliorare la sensibilità e la specificità della rilevazione delle proteine.
Metodi Utilizzati
- Una nuova tecnologia di marcatura EM che evita fissativi a base di aldeide per preservare l'attività delle proteine.
- Applicazione su proteine isolate, E. coli, cellule di Pasqua e cellule HeLa.
- Combinazione delle tecnologie criogeniche FIB e criogeniche EM per un imaging migliorato.
Risultati principali
- Sintesi riuscita di nanoparticelle d'oro direttamente su proteine singole.
- Localizzazione chiara e precisa ottenuta con un elevato rapporto segnale-rumore.
- Convalida dell'efficienza e specificità del metodo su diversi campioni biologici.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un notevole progresso nelle tecnologie di rilevamento delle proteine.
- Il metodo mostra potenzialità per affrontare domande biologiche fondamentali a livello molecolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La localizzazione precisa delle proteine a risoluzione ultrastrutturale rappresenta un punto critico per la validazione degli bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. La sintesi diretta di nanoparticelle d'oro visibili al microscopio elettronico su marcatori codificati geneticamente consente la visualizzazione di singole molecole in situ, supportando una maggiore affidabilità predittiva nell'interazione con il bersaglio e nella mappatura dei percorsi metabolici. Questa capacità rafforza la continuità traslazionale dalla scoperta alla ricerca preclinica, preservando l'architettura cellulare nativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una mappatura ad alta risoluzione della localizzazione proteica per chiarire la biologia del bersaglio.
- Supporta la validazione funzionale di marcatori ingegnerizzati in sistemi sia procariotici che eucariotici.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico preservando l'ultrastruttura durante il rilevamento.
- Migliora la sicurezza predittiva per l'interazione con il bersaglio e l'assegnazione del percorso.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un'etichettatura robusta e riproducibile per la rilevazione quantitativa di proteine in saggi basati su cellule.
- Standardizza la generazione della sonda per microscopia elettronica utilizzando marcatori clonabili per flussi di lavoro scalabili.
- Garantisce segnali con elevato rapporto segnale-rumore, consentendo una valutazione affidabile dei composti nelle campagne di screening.
- Prepara sistemi biologici validati per analisi successive basate sulla microscopia elettronica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sulla localizzazione proteica ai contesti ultrastrutturali rilevanti per la malattia.
- Supporta la continuità dalla scoperta a livello singola cellula alla validazione preclinica a livello tissutale.
- Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio fornendo evidenze ultrastrutturali dell'interazione con il bersaglio.
- Facilita l'allineamento dei biomarcatori attraverso una mappatura subcellulare precisa.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa tecnologia di marcatura con microscopia elettronica si integra dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti e alla ricerca preclinica, supportando la verifica delle ipotesi e la validazione meccanicistica.
- Biologia della scoperta: Permette l'indagine ipotetica della funzione e localizzazione delle proteine in ambienti cellulari nativi.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili al microscopio elettronico per lo sviluppo di saggi e la selezione di composti.
- Analisi: Offre un'etichettatura altamente efficiente e specifica mediante nanoparticelle per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il rilevamento di singole molecole a modelli ultrastrutturali di malattia per la validazione di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma per la generazione standardizzata di sonde per microscopia elettronica in diversi programmi di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità del rilevamento proteico basato sulla microscopia elettronica.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza del capitale fornendo evidenze a livello ultrastrutturale.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione di asset scoperta con un adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione dei campioni per microscopia elettronica e nella progettazione di marcatori geneticamente codificati.
- Necessita dell'accesso a tecniche di congelamento ad alta pressione, sostituzione del congelante e strumentazione avanzata per microscopia elettronica.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro delle procedure di fissazione e marcatura per garantire riproducibilità.
- L'adattamento a campioni di tessuto e a diversi sistemi modello potrebbe richiedere ulteriori ottimizzazioni.
- La sensibilità del marcatore ai fissativi a base di aldeide richiede un rigoroso rispetto delle procedure per preservarne l'attività.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:31
Preparing Sapphire Discs for Cell Culture
2:48
High‐Pressure Freezing (HPF),Freeze‐Substitution Fixation (FSF),and Rehydration of Sapphire Disc‐Carrier Assembly
6:02
Gold Nanoparticle Synthesis for Mammalian Cells Using Sapphire Discs
