Name: Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Scopri un metodo preciso per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi come la piccola cicala bruna del riso. Questa tecnica semplice e quantificabile facilita lo studio delle interazioni virus-vettore e delle arbovirosi.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Key R&D Program of China (n. 2022YFD1401700) e dalla National Science Foundation of China (n. 32090013 e n. 32072385).

1. Allevamento di insetti
<ol><li>Aumentare le SBPH utilizzate in questo esperimento nelle piantine di riso (Oryza sativa cv. Nipponbare). Piantare 20 piantine di riso in un'incubatrice (65 mm x 200 mm) e crescere a 25 °C sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.</li>
</ol>2. Dissezione degli SBPH per la raccolta dell'emolinfa
<ol><li>Mettere gli SBPH in una provetta da centrifuga e metterli in un bagno di ghiaccio per 10-30 minuti. NOTA: Non posizionare gli SBPH nel bagno di ghiaccio per meno di 10 minuti, altrimenti gli insetti potrebbero rianimarsi.</li>
	<li>Posizionare un SBPH congelato su un vetrino (vedi Tabella dei materiali) sotto uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali) con l'addome rivolto verso l'alto. Regola la messa a fuoco sulle sei zampe dell'insetto.</li>
	<li>Preparare due pinzette ad alta precisione (vedi Tabella dei materiali) con punte ultrasottili. Usa una pinzetta per premere sul corpo dell'insetto per tenerlo in posizione, e usa l'altra per estrarre con attenzione una delle zampe dall'insetto. NOTA: Per gli insetti con un guscio duro, un bisturi oftalmico può essere utilizzato per tagliare una delle gambe.</li>
	<li>Premere delicatamente il petto dell'insetto con una pinzetta per far fluire l'emolinfa attraverso la ferita. NOTA: L'emolinfa si presenta come goccioline trasparenti senza alcun flocculo bianco visibile. Scartare il lipide se c'è qualche floccullo bianco, che rappresenta la contaminazione del corpo grasso.</li>
</ol>3. Raccolta dell'emolinfa con micropipette
<ol><li>Preparare una micropipetta. Inserire un tubo capillare (vedere Tabella dei materiali) con un volume di 1 μL nel bulbo della pipetta (vedere Tabella dei materiali). Per misurazioni accurate, assicurarsi che la linea della scala sia visibile. NOTA: è necessario un piccolo foro presente sulla parte superiore della lampadina della pipetta.</li>
	<li>Quando si raccoglie l'emolinfa, tenere il bulbo della pipetta della micropipetta e posizionare il tubo capillare vicino alla ferita dell'insetto. Raccogli l'emolinfa che trasuda dalla ferita semplicemente toccando la punta del capillare all'emolinfa.</li>
	<li>Bloccare leggermente il piccolo foro sulla parte superiore del bulbo della pipetta con il dito per interrompere il processo di assorbimento quando il liquido all'interno del tubo capillare raggiunge la linea di calcare desiderata. NOTA: Raccogliere un campione di 1 μL di emolinfa incessantemente e rapidamente per evitare la contaminazione lipidica e l'ostruzione del tubo.</li>
	<li>Premere il bulbo della pipetta per scaricare l'emolinfa raccolta in 100 μL di tampone PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4). NOTA: Il tubo capillare viene inserito nel tampone PBS.</li>
	<li>Passare a un nuovo tubo capillare quando si raccoglie un altro campione di emolinfa da 1 μL.</li>
</ol>4. Colorazione blu Coomassie
<ol><li>Raccogliere 3 campioni di emolinfa con lo stesso volume (1 μL) dalle larve del 3° stadio secondo i protocolli descritti nella fase 3 e scaricare l'emolinfa raccolta nel tampone PBS per ottenere un volume totale di 100 μL.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di tampone di carico proteico 5x (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V Bromophenol Blue, 50% W/V glicerolo, 5% W/V β-mercaptoetanolo) in 100 μL dei campioni emolinfatici diluiti e riscaldare per denaturare le proteine.</li>
	<li>Caricare 20 μL dei campioni bolliti su un gel proteico SDS-PAGE al 10% (vedere Tabella dei materiali) per separare le proteine.</li>
	<li>Colorare il gel in una soluzione di Coomassie Blue (mescolare 1 g di Coomassie Brilliant Blue R-250 con 250 mL di isopropanolo, 100 mL di acido acetico glaciale e 650 mL di ddH2O e filtrare eventuali particelle usando carta da filtro) per 1 ora a temperatura ambiente, quindi decolorare il gel per 1 ora con soluzione decolorante (100 mL di acido acetico, 400 mL di metanolo, 500 mL di ddH2O).</li>
</ol>5. Determinazione della concentrazione proteica
<ol><li>Diluire 10 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) a 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml e 0,3125 mg/ml con tampone PBS utilizzando il metodo di diluizione a due volte.</li>
	<li>Aspirare 5 μL di tampone PBS e ogni concentrazione di soluzioni BSA nella fase 5.1, aggiungere 1 mL di 1x reagente colorante Bradford (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare il tampone PBS nel reagente colorante Bradford come controllo e zero a OD = 595 nm. Misurare i valori di assorbanza di ciascuna delle restanti concentrazioni proteiche e fare una curva standard.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di emolinfa da SBPH larvali, femminili o maschili in 100 μL di tampone PBS, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere gli emociti.</li>
	<li>Aspirare 90 μL di surnatante in una nuova provetta da centrifuga e misurare i valori di assorbanza del surnatante secondo le istruzioni riportate al punto 5.2.</li>
	<li>Calcolare le concentrazioni proteiche dei campioni emolinfatici secondo l'equazione di regressione della curva standard. Includere tre repliche biologiche con tre repliche tecniche negli esperimenti.</li>
</ol>6. Rilevamenti microscopici
<ol><li>Utilizzare micropipette per raccogliere emolinfa da 10-15 SBPH in diverse fasi di sviluppo. Aggiungere l'emolinfa raccolta in un tubo contenente 20 μL di soluzione di paraformaldeide al 4% (vedere Tabella dei materiali). Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti per fissare l'emolinfa.</li>
	<li>Pipettare 20 μL di emociti fissi al centro di un vetrino rivestito di silano (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Asciugare la goccia in uno stendino. NOTA: Evitare un'eccessiva asciugatura.</li>
	<li>Coprire il campione con il reagente antisbiadimento d'oro 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (vedi Tabella dei materiali) e ispezionare il vetrino al microscopio invertito (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>7. Quantificazione cellulare
<ol><li>Raccogliere 1 μL di emolinfa dagli SBPH con una micropipetta e scioglierlo in 20 μL di tampone PBS.</li>
	<li>Diluire i campioni di emolinfa cinque volte con tampone PBS.</li>
	<li>Pipettare 20 μL di soluzione emolinfatica al centro della camera di conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali). Coprire la goccia con un coprislip (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Contare le cellule nei cinque quadrati della camera di conteggio delle cellule (Figura supplementare 1), al microscopio invertito (vedi Tabella dei materiali). Includere tre repliche biologiche con tre repliche tecniche in ciascuno degli esperimenti. Cellule/μL = conteggio totale di cinque quadrati centrali × fattore di diluizione 5 × × 104</li>
</ol>8. Analisi statistiche
<ol><li>Eseguire analisi statistiche con il software corrispondente (vedi Tabella dei materiali). Creare un nuovo file e selezionare la colonna, importare i dati e generare un grafico a dispersione con una barra.</li>
	<li>Calcola la media e la SD per ciascun gruppo di dati utilizzando le statistiche delle colonne e utilizza uno strumento ANOVA unidirezionale per valutare il significato delle differenze tra i gruppi. Determinare la media e la SD da tre repliche biologiche con tre esperimenti indipendenti.</li>
</ol>

Raccolta dell'emolinfa da piccoli artropodi

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

L'emolinfa è il mezzo del sistema circolatorio negli artropodi e gli arbovirus possono invadere altri tessuti degli artropodi solo se sono in grado di sopravvivere all'ambiente emolinfatico ostile. La raccolta di un campione di alta qualità di emolinfa è il primo passo nello studio delle interazioni vettore-virus che si verificano nell'emolinfa. È stato riportato che l'emolinfa degli insetti può essere ottenuta da diversi siti sul corpo dell'insetto, tra cui una ferita sulla gamba anteriore, un'incisione minore nella zon...

Sia i virus animali che quelli vegetali possono essere trasmessi dagli artropodi e questi virus rappresentano una grave minaccia per la salute umana e causano enormi perdite economiche in agricoltura 1,2,3. È importante sottolineare che l'emolinfa degli artropodi, che funge da sistema circolatorio e un elemento vitale del sistema immunitario negli artropodi, svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione arbovirale. I virus acquisiti attraverso l'intestino degli artropodi vengono trasportati ad altri tessuti solo dopo essere sfuggiti con successo all'ambiente emolinfatico avverso 4,5,6,7. Il ciclo di vita dei virus nell'emolinfa degli artropodi comporta la sopravvivenza del virus nel plasma fluido, l'ingresso nell'emocita e il trasporto ad altri tessuti, e vari meccanismi di interazione virus-vettore si verificano nell'emolinfa 8,9,10,11,12. Ad esempio, la trasmissione verticale di RSV da parte dell'SBPH dipende da un'interazione molecolare tra la proteina vitellogenina SBPH e la proteina del capside RSV (virus della striscia di riso)13,14. Alcuni virus possono sfuggire alla risposta immunitaria dell'emolinfa legando specifici fattori vettoriali15,16,17,18. Pertanto, lo studio delle interazioni vettore-virus nell'emolinfa degli artropodi è importante per sviluppare una migliore comprensione della trasmissione dell'arbovirus.
L'emolinfa di alcuni piccoli insetti, come cavallette, cicaline e alcune zanzare, è difficile da raccogliere a causa delle loro dimensioni. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati diversi metodi per raccogliere l'emolinfa, tra cui l'inserimento di un ago da siringa direttamente nel corpo dell'insetto per estrarre un microvolume dell'emolinfa, la raccolta dell'essudato dal sito della ferita con pinzette a punta fine e la centrifugazione diretta. Questi metodi hanno permesso la misurazione dei livelli relativi di espressione genica e dei titoli virali all'interno dell'emolinfa 19,20,21. Tuttavia, un metodo efficace per quantificare il volume dell'emolinfa, necessario per il conteggio degli emociti, la quantificazione delle proteine e l'analisi dell'attività enzimatica, non è attualmente disponibile per questi piccoli insetti.
Il SBPH (piccola cavalletta marrone) è un tipo di piccolo insetto vettore con una lunghezza del corpo di circa 2-4 mm. L'SBPH è in grado di trasmettere una varietà di virus vegetali, tra cui RSV, virus nano grezzo del mais e virus nano striato nero del riso22,23,24. L'interazione tra SBPH e RSV è stata studiata in modo approfondito negli ultimi dieci anni. Per facilitare il lavoro con gli SBPH, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice per raccogliere l'emolinfa. Questo metodo, che si basa sul principio delle forze capillari, utilizza un capillare con un segno di scala per acquisire l'emolinfa dell'insetto in modo preciso e quantificabile. Questo ci permette di raccogliere un volume specifico di emolinfa da piccoli insetti in modo efficiente e di studiare l'ambiente emolinfatico di piccoli vettori in modo più dettagliato.

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE gel proteico</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Separazione e rilevamento delle proteine</td></tr><tr><td>4% paraformaldeide</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Per la fissazione delle cellule o dei tessuti...</td></tr><tr><td>Reagente colorante Bradford</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Rilevamento della concentrazione di proteine</td></tr><tr><td>Capillare</td> 9000101 di <td>Hirschmann</td><td>Per la raccolta dell'emolinfa</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio delle cellule</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Conteggio degli emociti</td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Per la tenuta di insetti</td></tr><tr><td>Vetrino rivestito di silano</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Per la conservazione di campioni al microscopio</td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento in oro con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Colorazione del nucleo</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Per l'osservazione microscopica</td></tr><tr><td>Bulbo per pipette</td><td>Hirschmann</td> 9000101 <td>Per la raccolta dell'emolinfa</td><td></td></tr><tr><td>Software Prisma 8.0</td><td>GraphPad</td><td>/</td><td>Analisi statistiche</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Per la dissezione degli insetti</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Per la dissezione</td></tr><tr><td>degli insetti Microscopio invertito Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Osservazione degli emociti</td></tr></tbody></table>

un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Gli artropodi sono noti per trasmettere una varietà di virus di importanza medica e agricola attraverso la loro emolinfa, che è essenziale per la trasmissione del virus. La raccolta dell'emolinfa è la tecnologia di base per lo studio delle interazioni virus-vettore. Qui, descriviamo un nuovo e semplice metodo per la raccolta quantitativa di emolinfa da piccoli artropodi usando Laodelphax striatellus (la piccola cavalletta bruna, SBPH) come modello di ricerca, poiché questo artropode è il principale vettore del virus della striscia di riso (RSV). In questo protocollo, il processo inizia pizzicando delicatamente una gamba dell'artropode congelato con una pinzetta a punta fine e premendo l'emolinfa fuori dalla ferita. Quindi, una semplice micropipetta composta da un capillare e un bulbo di pipetta viene utilizzata per raccogliere l'emolinfa trasudativa dalla ferita secondo il principio delle forze capillari. Infine, l'emolinfa raccolta può essere sciolta in un tampone specifico per ulteriori studi. Questo nuovo metodo per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi è uno strumento utile ed efficiente per ulteriori ricerche sugli arbovirus e sulle interazioni vettore-virus.

Modello di micropipetta e raccolta dell'emolinfa Abbiamo sviluppato una semplice micropipetta la cui azione si basa sulle forze capillari del tubo capillare. La micropipetta è composta da un tubo capillare e da un bulbo per pipetta (Figura 1A). I tubi capillari sono disponibili in diverse dimensioni di volume che vanno da 1 μL a 20 μL e i volumi dei tubi capillari sono selezionati in base alle esigenze. I tubi capillari con volumi più piccoli non sono suggeriti perché le ...

Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

La nostra ricerca si concentra su arbovirus, insetti e interazioni con le piante. Ottenere campioni di emolinfa da piccoli artropodi rappresenta una sfida tecnica per la ricerca sulle malattie trasmesse dagli insetti. Questo protocollo mostra una tecnica precisa e quantificabile per contrastare questo problema.Recenti sviluppi della ricerca nella trasmissione degli arbovirus hanno scoperto che i virus possono manipolare diversi importanti fattori vettoriali per superare la barriera dell'ospite. Questo protocollo è una tecnica semplice, economica e preziosa che consente una quantificazione precisa dell'emolinfa. Questo metodo offre anche una preziosa tecnologia per avviare le interazioni tra virus e vettori.La nostra prossima ricerca si concentrerà sulla comprensione dei meccanismi molecolari della trasmissione del virus da parte degli insetti vettori, esplorando e migliorando nuove tecniche operative.

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Biologia

Il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus polyphemus, è probabilmente la fonte più conveniente per grandi quantità di sangue di qualsiasi invertebrati. Il sangue è semplice nella composizione, con un solo tipo cellulare nella circolazione generale, il Amebocyte granulare, e solo tre proteine ​​abbondanti nel plasma, hemocyanin, il C-reattiva proteine, e α2-macroglobulina. Il sangue viene raccolto dal cuore e le cellule del sangue e del plasma sono separate per centrifugazione.

Raccolta di sangue dal Granchio Ferro di Cavallo Americano, Limulus Polifemo

Segnalazione dell'insulina conservato percorsi trova nel moscerino della...

L&#39;insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all&#39;insulina nei adulti Drosophila melanogaster</em

Un semplice ma accurato metodo per raccogliere e macchia ematociti concentrati zanzara è descritto. Il nostro metodo combina la semplicità di perfusione con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare. Questo metodo facilita la conoscenza di studi che richiedono i tipi di ematociti concentrati e la loro abbondanza.

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

Emociti insetti svolgere molte funzioni importanti, sia immunitarie e non immunitarie, durante tutte le fasi di sviluppo degli insetti. La nostra attuale conoscenza dei tipi di hemocyte e la funzione viene da studi su insetti modelli genetici. Qui vi presentiamo un metodo per l'estrazione, la quantificazione e la visualizzazione di emociti da bruchi selvatici.

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

L'emolinfa di Drosophila funge sia da sangue che da liquido interstiziale, circolando in tutto il corpo durante gli stadi larvali e adulti. Questo video descrive un protocollo per raccogliere l'emolinfa larvale al fine di quantificare le cellule circolanti.

Rottura delle cuticole: un metodo per raccogliere l'emolinfa dalle larve di Drosophila

Questo video dimostra il test di disturbo dell'emocita, valutando la riadesione degli emociti nelle tasche ematopoietiche delle larve di Drosophila. Il disturbo meccanico rilascia gli emociti residenti, aumentando la conta degli emociti circolanti. Dopo il recupero, la riaderenza degli emociti residenti è confermata, illustrando la reversibilità.

Un test di disturbo degli emociti per valutare la riadesione degli emociti alle tasche ematopoietiche

Le cellule del sangue di Drosophila, o emociti, si alternano tra i siti residenti e la circolazione.  Nella larva, gli emociti residenti (sessili) si localizzano in microambienti induttivi, le tasche ematopoietiche, mentre gli emociti circolanti si muovono liberamente nell'emolinfa. L'obiettivo di questo protocollo è l'isolamento e la quantificazione standardizzati di queste due popolazioni di emociti, comportamentali distinte ma interscambianti.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e condividono molte caratteristiche comuni, rendendo Drosophila un modello genetico interessante per lo studio ematopoiesi. Qui mostriamo dissezione e montaggio del grande organo ematopoietico larvale per immunoistochimica. Descriviamo anche metodi per saggiare i vari compartimenti ematopoietici larvali tra emociti circolanti e le cellule di cristallo sessili.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

L'analisi di tick emolinfa rappresenta un'importante fonte di informazioni su come alcuni patogeni causano malattie e come le zecche rispondono immunologicamente a questa infezione. Il presente studio dimostra come inoculare propagule fungine e raccogliere emolinfa da Rhipicephalus MicroPlus femmine gonfio.

Rivelare la raccolta di hemolymph e l'inoculo di Metarhizium blastospores in Rhipicephalus MicroPlus zecche verso gli studi di patologia degli invertebrati

Questo protocollo descrive un saggio in vivo di fagocitosi usato per valutare e quantificare la capacità degli emociti di Drosophila melanogaster giovani e invecchiati di batteri fagocitosi.

Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

Scopri un metodo preciso per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi come la piccola cicala bruna del riso. Questa tecnica semplice e quantificabile facilita lo studio delle interazioni virus-vettore e delle arbovirosi.

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

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