Name: Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Scopri un protocollo standardizzato di immunofluorescenza per visualizzare le trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini. Questo metodo affronta mascheramento degli epitopi e autofluorescenza per risultati affidabili.

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Questa ricerca è stata fondata dalla Società di Ricerca Tedesca (BO5534). Ringraziamo Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, la Dott.ssa Annika Heuer e il PD Dr. Ingo Königs per averci fornito i campioni. Inoltre, gli autori ringraziano il team della UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) per il supporto con la microscopia a immunofluorescenza.

Questo studio ha incluso tessuti di topo derivati da esperimenti approvati dall'Amministrazione statale di Amburgo per la ricerca sugli animali, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Amburgo, Germania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). I tessuti utilizzati erano polmone e colon di topo da un modello settico e pelle ustionata. Abbiamo usato topi maschi e femmine di 8 settimane. Per tutti gli esperimenti è stata seguita la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. I campioni umani anonimizzati includevano tessuti di enterocolite neonatale, pelle ustionata, atresia biliare, spondilodiscite e miocardio. Secondo il Comitato etico per la ricerca medica di Amburgo, i campioni non avevano bisogno del consenso informato, ma lo studio è stato approvato dal comitato (WF-026/21).
1. Fissaggio del campione
<ol><li>Utilizzare il seguente protocollo derivato da Abu Abed e Brinkmann per la fissazione del campione, la disidratazione, l'inclusione della paraffina, il sezionamento e il montaggio 3,15.<ol><li>Preparare una soluzione di formaldeide al 4% sciogliendo 40 g di paraformaldeide (PFA) in 800 mL di soluzione salina tamponata con Tris, pH 7,4 (TBS).</li>
		<li>Mescolare la miscela a 60 °C sotto una cappa aspirante fino a quando il PFA non si è sciolto. Portare la soluzione a temperatura ambiente (RT) e regolare il volume con TBS a 1.000 ml.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,4. Conservare a 4 °C per 2-3 settimane o a -20 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	</ol></li>
	<li>Per la fissazione del campione, posizionare il tessuto fresco nel tampone TBS e sezionarlo in pezzi di dimensioni inferiori a 20 mm x 30 mm x 3 mm. Immergere le sezioni di tessuto in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 12-24 ore. NOTA: Il protocollo originale utilizzava una soluzione di PFA al 2% e un tempo di fissazione di 8-20 ore. Con questo metodo, alcune sezioni di tessuto non sono state completamente fissate dopo 20 ore, quindi la concentrazione di PFA è stata aumentata al 4% di PFA.</li>
	<li>Trasferire i campioni in cassette per il trattamento dei tessuti etichettati. Utilizzare pennarelli o matite resistenti ai solventi per l'etichettatura.</li>
	<li>Iniziare la disidratazione del campione immergendo le cassette in etanolo al 70% per 1 ora. Quindi, immergere in etanolo all'80%, etanolo al 90%, etanolo al 96% e due volte all'etanolo al 100%, con ogni passaggio della durata di 1 ora.</li>
	<li>Immergere due volte in xilene al 100% (dimetilbenzene) e poi due volte in paraffina a 60 °C per 1 ora ogni volta.</li>
	<li>Utilizzare stampi da incasso per il montaggio e lasciare che la paraffina si solidifichi prima di rimuovere lo stampo.</li>
	<li>Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di tessuto spesse 3 μm.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per stendere le sezioni tagliate a bagnomaria a 37 °C e lasciarle galleggiare sulla superficie per allungare i tagli di tessuto.</li>
	<li>Posizionare le sezioni su vetrini adesivi (Tabella dei materiali) e lasciarle asciugare per una notte in una camera termica a 40 °C.</li>
</ol>2. Reidratazione del campione
<ol><li>Per la deparaffinazione, impilare i vetrini in un rack per vetrini e immergerli due volte per 5 minuti ciascuno nel mezzo sostitutivo dello xilene limonene (Tabella dei materiali) e una volta per 5 minuti in una miscela 1:1 limonene/etanolo. ATTENZIONE: Il limonene è infiammabile a 50 °C e può causare reazioni allergiche. Utilizzare sotto una cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti. Tenere lontano dal fuoco aperto.</li>
	<li>Reidratare i campioni in una serie di etanolo discendente immergendo il rack dei vetrini due volte in etanolo al 100% e una volta in etanolo al 96%, etanolo al 90%, etanolo all'80% ed etanolo al 70% per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Immergere la griglia per vetrini per 5 minuti in acqua deionizzata (acqua deionizzata) per rimuovere eventuali residui di etanolo.</li>
</ol>3. Blocco dell'autofluorescenza e recupero dell'antigene
<ol><li>Preparare la soluzione di recupero del bersaglio del citrato (TRS) a pH 6 (Tabella dei materiali) secondo la scheda tecnica. Questo TRS è concentrato 10 volte. Pertanto, diluire 1:10 con acqua deionizzata. Preriscaldare in un barattolo di plastica a 96 °C. NOTA: TRS rompe i ponti di metilene formati durante la fissazione del campione per esporre gli epitopi dell'antigene. Ciò consente agli anticorpi primari di legarsi al loro antigene bersaglio. Conservare TRS concentrato a 2-8 °C per 8 mesi. Prepara sempre TRS fresco.</li>
	<li>Estrarre i vetrini dalla rastrelliera e riporli in una camera umida. Pipettare una o due gocce di agente autofluorescente (tabella dei materiali) su ciascun campione. Incubare per 5 min. NOTA: L'agente riducente dell'autofluorescenza blocca l'autofluorescenza intrinseca del tessuto causata da fluorofori e fissativi endogeni. Conservare l'agente autofluorescente a RT per un massimo di 1 anno. NOTA: Lavorare solo con piccole sezioni di tessuti per evitare che i campioni si secchino o superino il tempo di incubazione.</li>
	<li>Impilare nuovamente i vetrini nella griglia per vetrini e risciacquare per 1 minuto in etanolo al 60% con movimenti verso l'alto e verso il basso fino a quando tutto il reagente per la riduzione dell'autofluorescenza non utilizzato non è stato lavato via.</li>
	<li>Immergere la griglia per vetrini per 5 minuti in acqua deionizzata.</li>
	<li>Per il prelievo dell'antigene, trasferire i vetrini in un barattolo di colorazione con il TRS preriscaldato. Incubare per 10 minuti a 96 °C a bagnomaria. NOTA: Il bagnomaria a 96 °C può essere sostituito con un forno a microonde o una vaporiera se il TRS è preriscaldato a 96 °C e sono garantiti 10 minuti di incubazione a 96 °C.</li>
	<li>Estrarre il barattolo di colorazione e lasciarlo raffreddare lentamente a RT per circa 60-90 minuti. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui per un massimo di 4 ore, lasciando le diapositive nel TRS.</li>
	<li>Rimuovere il TRS, ma conservare i vetrini nel barattolo. Risciacquare due volte con soluzione salina tamponata Tris con Tween allo 0,05% (TBST, pH 7,4) per 3 minuti ciascuno per lavare via eventuali residui di TRS rimanenti.</li>
	<li>Per la permeabilizzazione, preparare Triton allo 0,2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, e riempirlo nel barattolo di colorazione per permeabilizzare i campioni per 10 minuti. NOTA: La permeabilizzazione migliora il legame degli anticorpi primari con le proteine bersaglio intracellulari nei campioni fissati.</li>
	<li>Sciacquare nuovamente i vetrini due volte in TBST per 3 minuti ogni volta.</li>
	<li>Preparare la camera umida e stendere i vetrini. Pulire l'acqua in eccesso dai vetrini con fazzoletti di carta. Circondare ogni campione con una penna barriera idrofobica per evitare che la soluzione anticorpale fuoriesca. NOTA: Non lasciare che i campioni si asciughino. È meglio lavorare con piccole sezioni.</li>
</ol>4. Blocco del legame anticorpale non specifico
<ol><li>Prelevare una soluzione bloccante pronta all'uso con siero d'asina (Tabella dei materiali) e pipettare una goccia su ogni campione. Incubare per 30 minuti a RT. NOTA: Questa fase di blocco riduce al minimo il legame dell'anticorpo secondario a siti di legame non specifici sul campione. Dopo aver bloccato questi epitopi aspecifici e aver applicato l'anticorpo primario, l'anticorpo secondario si legherà all'anticorpo primario e non interagirà con la superficie del tessuto. Questo reagente bloccante pronto all'uso viene conservato a 2-8 °C per 6 mesi.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso dai vetrini picchiettando il bordo dei vetrini contro una superficie dura. Non risciacquarli.</li>
</ol>5. Anticorpo primario
<ol><li>Diluire gli anticorpi primari in tampone di diluizione degli anticorpi (Tabella dei materiali). Utilizzare circa 100 μL della soluzione finale per ogni campione. Per l'anticorpo NE e H3cit (R8) e l'isocontrollo, diluire a una concentrazione di 5 μg/mL. Per l'MPO e l'isocontrollo corrispondente, utilizzare 10 μg/mL. Preparare una provetta per ogni anticorpo primario e una per ogni anticorpo isocontrollato. NOTA: H3cit (R8)/MPO o NE/MPO e i loro isocontrolli possono essere combinati per la colorazione dei NET. Per la combinazione di H3cit (R8)/MPO, diluire a una concentrazione finale di 5 μg/mL per H3cit (R8) e 10 μg/mL per MPO a un volume finale di 100 μL per campione. Per NE/MPO, diluire a una concentrazione finale di 5 μg/mL per NE e 10 μg/mL per MPO fino a un volume finale di 100 μL per campione. Per l'isocontrollo, utilizzare la stessa concentrazione di ciascun anticorpo corrispondente. Utilizzare sempre un nuovo puntale per pipetta per ogni anticorpo utilizzato. Gli anticorpi primari possono essere conservati a 4 °C per 1-2 settimane e a -20 °C o -80 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Con due campioni su un vetrino, utilizzarne uno per gli anticorpi isocontrol e uno per la diluizione degli anticorpi MPO/H3cit o MPO/NE. Utilizzare circa 100 μL per ogni campione e distribuire uniformemente la soluzione anticorpale. NOTA: Non lasciare che i campioni si asciughino. Fare attenzione a non confondere l'isocontrollo con gli anticorpi primari.</li>
	<li>Conservare in camera umida per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Il giorno successivo, prelevare la soluzione di anticorpi primari in eccesso dai vetrini e impilare i vetrini in una cuvetta. Risciacquare tre volte per 5 minuti ogni volta con TBST per lavare via la soluzione anticorpale primaria rimanente.</li>
</ol>6. Anticorpo secondario
<ol><li>Preparare la soluzione anticorpale secondaria. Utilizzare due diversi anticorpi secondari fluorescenti: asino-anti-capra per MPO e asino-anti-coniglio per la colorazione H3cit. Diluire ciascuno di essi a una concentrazione di 7,5 μg/mL con tampone di diluizione anticorpale (Tabella dei materiali). NOTA: Per la doppia colorazione, utilizzare due anticorpi fluorescenti con aree di eccitazione diverse e sovrapposizione spettrale minima. Combinare entrambi gli anticorpi secondari e diluire a una concentrazione finale di 7,5 μg/mL per ciascun anticorpo per un volume finale di 100 μL per campione. Proteggere gli anticorpi dalla luce. Gli anticorpi secondari possono essere conservati a 2-8 °C per 6-8 settimane o a -80 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Tenere i vetrini nella camera umida e aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale secondaria su ogni campione. Lasciarli incubare per 30 minuti a RT e al riparo dalla luce.</li>
	<li>Picchiettare la soluzione di anticorpi secondari in eccesso e impilare i vetrini nel rack per vetrini. Immergere tre volte per 5 minuti ciascuna in un barattolo colorante riempito di PBS per lavare via eventuali anticorpi non legati rimanenti.</li>
	<li>Preparare la soluzione di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) (Tabella dei materiali) e diluire a una concentrazione di 1 μg/mL con acqua deionizzata. Immergere il rack per vetrini in un barattolo di colorazione con la soluzione DAPI e incubare per 5 minuti a RT al buio. NOTA: DAPI è usato come colorante fluorescente per il DNA a doppio filamento. La soluzione DAPI preparata può essere utilizzata più volte. Conservare la soluzione DAPI preparata presso RT. Il concentrato DAPI può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Immergere il rack per vetrini per 5 minuti in un barattolo colorante con PBS per lavare via la soluzione DAPI in eccesso.</li>
</ol>7. Montaggio e conservazione dei campioni, analisi microscopica
<ol><li>Montare i campioni con vetrini coprioggetti e mezzo di montaggio (Tabella dei materiali). NOTA: Utilizzare solo piccole quantità di mezzo di montaggio e rimuovere il mezzo in eccesso con fazzoletti bagnati. Indossare guanti ed evitare di rimuovere accidentalmente qualsiasi mezzo dai vetrini coprioggetti o dai vetrini. Evitare la formazione di bolle e utilizzare tamponi di cotone per premere delicatamente sui vetrini coprioggetti per rimuovere eventuali bolle dai vetrini.</li>
	<li>Per l'imaging, utilizzare un microscopio a campo largo o un microscopio confocale. NOTA: Scattare prima un'immagine dell'isocontrollo. Ridurre il tempo di esposizione per i filtri a fluorescenza (ad eccezione del filtro blu per DAPI) fino a quando non viene rilevato quasi nessun segnale. Quindi, utilizzare questa impostazione per esaminare i campioni corrispondenti. Cerca le aree in cui è possibile rilevare un segnale fluorescente in ogni singolo campione utilizzando il canale di fluorescenza. Dopo aver scattato un'immagine dell'area, il programma genera un'immagine composta di tutti i canali e mostra i diversi segnali di fluorescenza come una sovrapposizione di diversi colori. L'immagine può quindi essere ulteriormente analizzata per la co-localizzazione con un software di imaging come ImageJ.</li>
	<li>Conservare i vetrini a 4 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>

Colorazione e imaging per visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili

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<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+Mechanisms+and+application+to+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38(2022).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li>
<li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097(2021).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296(2017).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro, abbiamo cercato di adattare e ottimizzare i protocolli esistenti per l'imaging dei NET a più tipi di tessuto, a partire dal processo di colorazione vero e proprio. Il primo passo fondamentale per questo metodo è la selezione degli anticorpi più adatti. Per NE, abbiamo provato un anticorpo NE da un ospite di topo su tessuto umano, che non ha mostrato alcuna colorazione affidabile rispetto a NE da un ospite di coniglio. Inoltre, Thålin et al. hanno proposto H3cit (R8) come anticorpo più specifico per la c...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono state visualizzate per la prima volta da Brinkmann et al. come una via di morte cellulare diversa dall'apoptosi e dalla necrosi nel 20041. In questo percorso, i neutrofili rilasciano la loro cromatina decondensata nello spazio extracellulare per formare grandi strutture simili a ragnatele ricoperte di proteine antimicrobiche che erano precedentemente immagazzinate nei granuli o nel citosol. Queste proteine antimicrobiche includono l'elastasi neutrofila (NE), la mieloperossidasi (MPO) e l'istone citrullinato H3 (H3cit), comunemente usati per la rilevazione in immunofluorescenza indiretta dei NET2. Questo metodo non solo identifica la presenza quantitativa di queste proteine; infatti, ha il vantaggio di rilevare in modo specifico strutture simili a NET. Nei NET, le proteine menzionate co-localizzano con il DNA extracellulare, che può essere rilevato da una sovrapposizione dei segnali di fluorescenza di ciascuna proteina colorata e del DNA extracellulare. In contrasto con i segnali sovrapposti dovuti alla co-localizzazione extracellulare di DNA e proteine nei NET, i neutrofili intatti non mostrano alcuna co-localizzazione. In questo caso, i componenti NET sono solitamente immagazzinati separatamente nei granuli, nei nuclei e nel citosol3.
Sin dalla loro prima scoperta, è stato dimostrato che i NET svolgono un ruolo centrale in numerose malattie, in particolare quelle che coinvolgono l'infiammazione. I NET mostrano funzioni antimicrobiche durante l'infezione attraverso l'intrappolamento e l'uccisione di patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti 4,5. Tuttavia, i NET sono stati anche collegati a malattie autoimmuni e risposte iperinfiammatorie, come il lupus eritematoso sistemico, l'artrite reumatica e l'asma allergica 6,7,8. I NET promuovono la vaso-occlusione e l'infiammazione nell'aterosclerosi, nell'adesione piastrinica e si ipotizza che svolgano un ruolo nel cancro metastatico 9,10,11. Tuttavia, si ritiene che abbiano proprietà antinfiammatorie riducendo i livelli di citochine proinfiammatorie12. Mentre i NET stanno guadagnando sempre più interesse in un campo di ricerca più ampio, un solido metodo di rilevamento dei NET è fondamentale per la ricerca futura.
Anche se la visualizzazione dei NET in diversi tessuti mediante imaging a immunofluorescenza è complessa e richiede personalizzazione, a parte la microscopia elettronica, è attualmente uno dei metodi più rinomati per visualizzare le interazioni tra NET e cellule ed è utilizzato prevalentemente nei tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina (FFPE)13,14. Tuttavia, il confronto tra l'imaging NET è difficile, poiché diversi laboratori utilizzano i propri protocolli personalizzati. Questi protocolli si differenziano per l'uso di anticorpi, il recupero dell'antigene o il metodo di permeabilizzazione e sono spesso ottimizzati per un tipo specifico di tessuto 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Dopo che Brinkmann et al. hanno pubblicato il primo studio metodico che utilizza la visualizzazione immunofluorescente di NET nel tessuto FFPE, abbiamo voluto ottimizzare questo protocollo per una più ampia varietà di tessuti e specie15. Inoltre, per stabilire un protocollo di immunofluorescenza ampiamente applicabile, abbiamo testato diversi protocolli modificati da studi che utilizzavano metodi di immunofluorescenza nel tessuto FFPE per rilevare i NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Inoltre, abbiamo provato un nuovo anticorpo H3cit per una colorazione extracellulare più specifica28. Ipotizziamo che adattando sistematicamente gli attuali protocolli di colorazione a diverse specie e tessuti, l'imaging in vitro possa essere migliorato, con conseguente migliore rappresentazione dell'interazione tra neutrofili e NET sia a livello locale che sistemico.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td><forte>Diluizione</forte></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-elastasi neutrofila 100&micro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 68672&nbsp;</td><td>s1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-istone H3 (citrullina R2 + R8 + R17)&nbsp; 100&micro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 5103</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mieloperossidasi [2C7] anti-umano 100 &micro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 25989</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mieloperossidasi [2D4] anti-topo 50 &micro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 90810</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Software di microscopia Axiovision&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante con siero d'asino (PRONTO ALL'USO) 50ml</td><td>GeneTex</td><td>&nbsp; </td><td></td>GTX30972</tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Marienfeld</td><td>0101202</td><td></td></tr><tr><td>Dako Soluzione per il recupero del bersaglio Citrato pH6 (x10)</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 25 mg</td><td>Roth</td><td>6335.1</td><td>1:25000</td></tr><tr><td>Diluizione degli anticorpi DCS 500 mL</td><td>MDS diagnostica</td><td>MDS AL120R500</td><td></td></tr><tr><td>Formica d'asino capra Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>705-165-147</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Asino anti coniglio AF647</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Asino anti coniglio Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Montaggio Medio</td><td>Invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Cremagliera per vetrini</td><td>Roth</td><td>H552.1</td><td></td></tr><tr><td>Umano/Topo MPO Anticorpo</td><td>R& D Sistemi</td><td>AF 3667&nbsp;</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>KISKER</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>Isokontrolle Coniglio IgG Policlonale 5mg</td><td>abcam</td><td>Ab 37415</td><td>1:2000 e 1:250</td></tr><tr><td>MaxBlock Kit di reagenti per la riduzione dell'autofluorescenza (RUO) 100 ml</td><td>Maxvision</td><td>MB-L</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera per microscopia</td><td>Zeiss</td><td>AxioCamHR3</td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Bosch</td><td>HMT84M421</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 controllo negativo</td><td>Dako</td><td>X0931 Aglient</td><td>1:50 e 1:5</td></tr><tr><td>Normale Controllo IgG di Capra</td><td>R& D Sistemi</td><td>AB-108-C&nbsp;</td><td>s1:100</td></tr><tr><td>PBS Soluzione salina tamponata con fosfato (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>PMP barattolo di colorazione</td><td>Roth</td><td>2292.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ricombinante anti-istone H3 (citrullina R8) 100&micro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 219406</td><td>1:100</td></tr><tr><td>IgG di coniglio ricombinante, monoclonale [EPR25A] - Isotype Control 200&micro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 172730</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ROTI Histol</td><td>Roth</td><td>&nbsp; 6640</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus vetrini</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tris soluzione salina tamponata (x10)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Memmert</td><td>830476</td><td></td></tr><tr><td>Cuociriso</td> <td>a bagnomariareishunger</td><td>RCP-30</td><td></td></tr><tr><td>Camera umida</td><td>Weckert Labortechnik</td><td>600016</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Microscopio a campo largo</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) vengono rilasciate dai neutrofili in risposta a un'infezione batterica o a un danno tissutale traumatico, ma svolgono anche un ruolo nelle malattie autoimmuni e nell'infiammazione sterile. Sono strutture simili a ragnatele composte da filamenti di DNA a doppio filamento, istoni e proteine antimicrobiche. Una volta rilasciati, i NET possono intrappolare e uccidere i patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti. Inoltre, i NET partecipano alla regolazione omeostatica stimolando l'adesione piastrinica e la coagulazione. Tuttavia, la produzione disregolata di NET è stata anche associata a varie malattie, tra cui la sepsi o le malattie autoimmuni, il che li rende un bersaglio promettente per l'intervento terapeutico. Oltre alla microscopia elettronica, la visualizzazione dei NET mediante imaging a immunofluorescenza è attualmente uno dei pochi metodi noti per dimostrare le interazioni NET nei tessuti. Pertanto, sono stati utilizzati vari metodi di colorazione per visualizzare i NET. In letteratura, sono descritti diversi protocolli di colorazione e sono stati identificati quattro componenti chiave che mostrano un'elevata variabilità tra i protocolli: (1) i tipi di anticorpi utilizzati, (2) l'uso di agenti autoriducenti l'autofluorescenza, (3) i metodi di recupero dell'antigene e (4) la permeabilizzazione. Pertanto, i protocolli di colorazione in immunofluorescenza in vitro sono stati sistematicamente adattati e migliorati in questo lavoro per renderli applicabili a diverse specie (topo, uomo) e tessuti (pelle, intestino, polmone, fegato, cuore, disco spinale). Dopo la fissazione e l'inclusione in paraffina, sezioni spesse 3 μm sono state montate su vetrini. Questi campioni sono stati colorati con anticorpi primari per la mieloperossidasi (MPO), l'istone citrullinato H3 (H3cit) e l'elastasi neutrofila (NE) secondo un protocollo di colorazione modificato. I vetrini sono stati colorati con anticorpi secondari ed esaminati utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo. I risultati sono stati analizzati secondo una scheda di valutazione e le differenze sono state registrate in modo semi-quantitativo.
Qui presentiamo un protocollo di colorazione NET ottimizzato adatto a diversi tessuti. Abbiamo utilizzato un nuovo anticorpo primario per colorare H3cit e ridotto la colorazione non specifica con un agente autofluorescente. Inoltre, abbiamo dimostrato che la colorazione NET richiede una temperatura elevata costante e un'attenta manipolazione dei campioni.

Prima di iniziare l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo identificato i passaggi chiave per una colorazione di successo cercando su PubMed gli studi che utilizzavano il tessuto FFPE per l'immunocolorazione dei NET e confrontando i loro protocolli. Le differenze di protocollo più promettenti sono state identificate come i passaggi chiave per l'ottimizzazione del protocollo, mentre i passaggi che per lo più corrispondevano tra loro non sono stati modificati (Tabella 1).
<stron...

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Tra la selezione degli anticorpi per l'imaging tissutale, il processo di fissazione rappresenta una sfida per il mascheramento dell'epitopo. Pertanto, è necessario un passaggio di recupero personalizzato per esporre questi antigeni per il legame degli anticorpi. Inoltre, l'autofluorescenza intrinseca ai tessuti può causare difficoltà fino a un'elevata colorazione di fondo.Tuttavia, l'uso di approcci diversi nei protocolli in letteratura ostacola un confronto standardizzato tra le immagini. Il nostro studio mira a soddisfare la domanda di procedure standardizzate e ad assistere il ricercatore nel superare le sfide durante il processo di imaging. Abbiamo stabilito un protocollo di imaging versatile applicabile a diversi tessuti confrontando vari protocolli diversi.Quindi il nostro lavoro fornisce suggerimenti per la guida e la risoluzione dei problemi, dall'uso degli anticorpi al montaggio del campione, evidenziando le potenziali insidie. I nostri risultati fanno progredire la ricerca introducendo un nuovo anticorpo primario per il citrullinato hisone tre e un agente riducente autofluorescente per ridurre al minimo la colorazione di fondo. Inoltre, per un imaging di successo, sottoli

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Immunologia e Infezioni

Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Questo video dimostra la colorazione fluorescente delle trappole extracellulari dei neutrofili (NET), i componenti del DNA extracellulare espulsi dai neutrofili. Questa tecnica consente la visualizzazione dell'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET.

Microscopia a fluorescenza di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per osservare l'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET

Questo video dimostra l'induzione e la visualizzazione di trappole extracellulari neutrofile o NET in neutrofili pre-marcati utilizzando siero paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili. Inoltre, l'utilizzo di un colorante di DNA impermeabile e della microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione dei NET.

Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.

Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Scopri un protocollo standardizzato di immunofluorescenza per visualizzare le trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini. Questo metodo affronta mascheramento degli epitopi e autofluorescenza per risultati affidabili.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

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