Name: Analisi dellereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e limmunoprecipitazione della cromatina (ChIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri l'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter GFP e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Questo metodo standardizzato aiuta a studiare il silenziamento RNAi e le modificazioni istoniche.

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Desideriamo ringraziare i laboratori della comunità di C. elegans che hanno sviluppato e condiviso gli strumenti e il cui lavoro è citato in questo manoscritto. Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del progetto Canadian Institutes of Health Research (CIHR) ad A.L.S. (PJT-175245). CL è supportato da una borsa di studio post-laurea (PGS-D) del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Eredità epigenetica e ChIP in Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Tutti gli autori confermano di non avere conflitti da rivelare.

In questo protocollo, il dsRNA viene introdotto attraverso l'alimentazione, che è diventato un metodo standard in C. elegans18. Per i saggi di ereditarietà dell'RNAi, l'approccio di alimentazione fornisce un metodo semplice per ottenere un'ampia popolazione P0 2,11,12,22,23,24,25. Tuttavia, la tempistica e la durata dell'esposizione all'RNAi influenzano l'efficacia del silenziamento transgenico26 e la concentrazione dei batteri RNAi influisce sulla persistenza del silenziamento ereditario dell'RNAi1. Pertanto, la crescita standardizzata dei batteri RNAi e dei vermi è importante per ottenere un livello costante di silenziamento della GFP e una durata dell'ereditarietà. Qui, gli embrioni vengono placcati su piastre RNAi in modo che gli animali P0 siano esposti ai batteri RNAi dalla schiusa. Approcci alternativi hanno placcato animali sincronizzati in stadio L1 24,27 oL4 25 su piastre RNAi-NGM. Inoltre, poiché la fame e altri stress influenzano il mantenimento dell'ereditarietà dell'RNAi13, le piastre devono essere monitorate per prevenire il sovraffollamento e l'esaurimento delle scorte di cibo. In alternativa all'inizio dell'RNAi attraverso l'alimentazione, alcuni dei pionieri dell'ereditarietà dell'RNAi di C. elegans hanno indotto l'RNAi attraverso l'iniezione di gonadi, che fornisce un maggiore controllo della concentrazione di dsRNA 1,28.
In questo protocollo, ogni generazione viene fatta passare come una popolazione con trattamento con ipoclorito alcalino, come descritto in precedenza 16,22,23,24. Il trattamento con ipoclorito garantisce che la generazione F1 non venga contaminata da batteri RNAi provenienti dall'ambiente parentale22 e previene potenziali colli di bottiglia indesiderati nella popolazione. Tuttavia, il passaggio di massa può anche essere un limite, poiché i singoli animali possono avere modelli di ereditarietà distinti 1,29. Un metodo alternativo per stabilire ogni generazione è quello di selezionare i singoli animali 1,2,9,11,25. Questo approccio consente di tracciare i fenotipi all'interno dei lignaggi e l'incorporazione di incroci genetici. L'analisi del lignaggio può essere vantaggiosa anche per i fenotipi a bassa penetranza12.
L'espressione della proteina fluorescente è una lettura potente e conveniente del silenziamentoindotto dall'RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Come descritto in questo protocollo, l'espressione GFP può essere valutata manualmente come ON o OFF 11,12,15,16,25. Il punteggio manuale può essere ulteriormente perfezionato assegnando livelli di intensità qualitativa 3,4,14. In alternativa, il punteggio automatico dell'intensità delle immagini al microscopio 11,12,14,25,27 o la misurazione della fluorescenza con citometria a flussodi animali vivi 2 possono fornire una lettura quantitativa e ad alto rendimento. Tuttavia, poiché l'espressione reporter è limitata alla linea germinale, un avvertimento degli approcci automatizzati è che devono anche differenziare tra animali con espressione GFP silenziata rispetto ad animali senza linea germinale, specialmente se lo studio incorpora mutanti con sviluppo germinale anormale. In alternativa alla fluorescenza GFP, la trascrizione inversa (RT)-qPCR può essere utilizzata per quantificare i livelli di pre-mRNA e mRNAtarget RNAi 2,16,23,24. Questo approccio fornisce una lettura più diretta del silenziamento, che prende di mira l'RNA, ed è particolarmente utile per altri bersagli RNAi in cui il silenziamento non produce un fenotipo visibile. Un limite dell'uso di reporter GFP artificiali è che le sequenze esogene ed endogene sono regolate in modo differenziale nell'RNAitransgenerazionale 11. Gli studi con bersagli endogeni, come l'allele letale embrionale sensibile alla temperatura oma-1(zu405)1,11,16,25, dovrebbero quindi essere considerati come un approccio complementare ai reporter transgenici fluorescenti.
L'analisi della ChIP nel contesto dei saggi di ereditarietà dell'RNAi richiede il confronto tra trattamenti e repliche. Innanzitutto, per tenere conto delle differenze nel materiale di partenza tra i campioni, il segnale ChIP viene normalizzato al segnale di ingresso nello stesso luogo della "percentuale di ingresso". L'elaborazione parallela di un ChIP H3 dell'istone aiuterà a determinare se le alterazioni della modificazione dell'istone corrispondono a variazioni nella densità del nucleosoma. Inoltre, poiché ChIP è un processo a più fasi, l'efficienza può variare da un campione all'altro. La selezione di appropriati loci di controllo positivi e negativi è utile per valutare e confrontare il rapporto segnale/rumore tra campioni ed esperimenti. Inoltre, per facilitare i confronti tra i campioni, i valori del ciclo di soglia qPCR del DNA ChIP sul bersaglio RNAi sono spesso normalizzati in un locusdi controllo 3,11,15,23,30,31. Per valutare gli effetti del trattamento con RNAi, viene anche confrontato il rapporto tra il segnale ChIP nell'RNAi di trattamento e le condizioni di controllo o di assenza di RNAi. Un limite dell'approccio attuale è che la ChIP viene eseguita con animali interi, mentre la risposta al trattamento con RNAi può essere unica per la linea germinale. Un approccio per superare questo avvertimento consiste nell'eseguire ChIP utilizzando nuclei germinali isolati. Ulteriori considerazioni tecniche per l'ottimizzazione di ChIP sono state ampiamente discusse altrove32,33.
Nel complesso, questo protocollo di ereditarietà dell'RNAi e ChIP fornisce una base dettagliata e facile da adattare che può essere integrata con altre tecniche per esplorare ulteriormente la regolazione epigenetica transgenerazionale. Ad esempio, è possibile costruire librerie di sequenziamento ad alto rendimento a partire dal DNA ChIP (ChIP-seq) per una visione più dettagliata del panorama della cromatina sia prossimale al bersaglio RNAi che su scala genome-wide.

L'eredità epigenetica consente la trasmissione di informazioni di regolazione genica attraverso le generazioni e può quindi consentire all'ambiente o alle esperienze dei genitori di influenzare la loro progenie. In C. elegans, il silenziamento genico germinale iniziato dall'RNA esogeno a doppio filamento (dsRNA) può essere ereditato per più generazioni in progenie non esposta al trigger originale 1,2,3,4. Questo processo, chiamato ereditarietà dell'interferenza dell'RNA (RNAi), è uno dei numerosi fenomeni di silenziamento epigenetico correlati in C. elegans, tra cui il silenziamento multigenerazionale 2,5 avviato da piRNA, la paramutazione/RNAe (silenziamento epigenetico indotto da RNA)6,7,8 e il silenziamento 9 avviato da array multicopia, che hanno requisiti sovrapposti ma distinti per piccoli meccanismi di regolazione dell'RNA e della cromatina . Nell'RNAi esogeno di C. elegans, il dsRNA viene processato in piccoli RNA interferenti (siRNA) che agiscono in un complesso con le proteine primarie Argonaute per riconoscere il loro mRNA bersaglio. Questo targeting porta all'amplificazione di siRNA secondari che si associano agli Argonauti secondari per silenziare l'mRNA bersaglio attraverso le vie di silenziamento citoplasmatico e nucleare. Per i bersagli RNAi espressi dalla linea germinale, l'Argonaute HRDE-1 secondario nucleare e altri fattori RNAi nucleari prendono di mira i trascritti nascenti, con conseguente repressione trascrizionale e reclutamento di metiltransferasi istoniche per depositare marcature cromatiniche repressive, tra cui H3K9me310. L'istone H3K9me3 promuove l'instaurazione di un silenziamento ereditario dei transgeni della proteina fluorescente verde (GFP) espressa dalla linea germinale mediante l'ereditarietà dell'RNAi11,12.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare un transgene che esprima una proteina di fusione GFP-istone nella linea germinale come reporter per l'ereditarietà dell'RNAi e di saggiare i cambiamenti nelle modificazioni istoniche nel locus del transgene reporter utilizzando l'immunoprecipitazione della cromatina e la reazione a catena della polimerasi quantitativa (ChIP-qPCR). Questo protocollo descrive un approccio standardizzato di alimentazione dell'RNAi basato su piastre per avviare il silenziamento del reporter. Fornisce inoltre una cronologia dettagliata per il passaggio di animali da una generazione all'altra isolando embrioni in utero da adulti gravidi mediante trattamento con ipoclorito alcalino ("sbiancamento"). Vengono inoltre descritti metodi e dati rappresentativi per il monitoraggio della frequenza del silenziamento della GFP in un sottogruppo della popolazione mediante microscopia a fluorescenza e per la ChIP-qPCR dell'istone H3K9me3. I saggi di ereditarietà dell'RNAi basati su reporter forniscono un sistema altamente trattabile per sezionare funzionalmente i ruoli dei fattori genetici e ambientali nella regolazione epigenetica 13,14 e gli screening genetici che utilizzano tali reporter hanno identificato sia i geni che sononecessari per 2,3,15 che i geni che regolano negativamente 16,17 la durata dell'eredità epigenetica transgenerazionale.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Preparare una soluzione da 100 mg/mL in acqua ultrapura. Filtrare-sterilizzare e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio anti-H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>La concentrazione è dipendente dal lotto (0,9 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>La concentrazione dell'anticorpo policlonale di coniglio H3 anti-istone Abcam</td><td></td><td>ab1791</td><td>è dipendente dal lotto (0,7 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Ceppo di candeggina (6% ipoclorito di sodio)</td> <td>Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans con GFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>SX1263</td><td>Sapetschnig et al. 2015 (rif. 7). Un dono dal laboratorio E. Miska, Università di Cambridge.</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Preparare una soluzione da 25 mg/mL in acqua ultrapura. Filtrare-sterilizzare e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli ceppo HT115(DE3)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli ceppo OP50-1</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescenza Stereoscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide (37%)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>Realizzare una soluzione da 1,25 M e conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini stampati idrofobici, 10 pozzetti</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (ottilfenolo etossilato)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Preparare una soluzione al 10% (v/v) in acqua ultrapura e conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropil-beta;-D-tiogalattoside)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Preparare una soluzione da 0,2 g/mL in acqua ultrapura. Filtrare-sterilizzare e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Piastre integrate con 100 &micro; g/mL di Ampicillina</td><td>NA</td><td>NA Ricetta</td><td>standard di laboratorio.</td></tr><tr><td>Levamisolo (Tetramisolo cloridrato)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Preparare una soluzione di 200 mM in acqua ultrapura. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>LiCl (8 m)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Separatore magnetico (provette da 1,5 mL)</td><td>Separatore magnetico Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>(provette da 0,2 mL)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>Scelta del tecnico</td> dei<td>vetrini per microscopio</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>Per tamponi ChIP.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Preparare una soluzione 10 M e conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Piastre NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (p/v) agar, 0,3% (p/v) NaCl, 0,25% (p/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 &mu; g/mL di colesterolo, 25 mM di fosfato di potassio pH 6,0, 1 mM di MgSO4, 50 e micro; g/mL di streptomicina.</td></tr><tr><td>IgG normali di coniglio (1 mg/mL)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide - RNAi di controllo&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plasmide #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide - RNAi mirato a GFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plasmid #1649)</td><td>Nota, possono essere utilizzati plasmidi alternativi derivati da L4440 che hanno come bersaglio la GFP.</td></tr><tr><td>Coppia di primer [-3.3 kb upstream of gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Primer pair [clec-18]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>Coppia di primer [gfp esone 1]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>Coppia di primer [gfp esone 4]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>Coppia di primer [hrp-2]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTCTCCA</td></tr><tr><td>Compresse cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K&nbsp;</td>Kit di purificazione <td>PCR Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastre RNAi-NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (p/v) agar, 0,3% (p/v) NaCl, 0,25% (p/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 &; g/mL di colesterolo, 25 mM di tampone fosfato di potassio pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 e micro; g/mL di carbenicillina e 5 mM di IPTG.</td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sale sodico)</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>Preparare una soluzione al 10% (p/v) e conservare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per un massimo di 1 mese.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>Preparare una soluzione al 10% (p/v) e conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Preparare una soluzione al 5% (p/v) e conservare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per un massimo di 1 mese.</td></tr><tr><td>Tubo di sonicazione</td><td>Evergreen</td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>Tappo del tubo di sonicazione</td><td>Evergreen</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>Preparare una soluzione da 50 mg/mL in acqua ultrapura. Filtrare-sterilizzare e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tampone TAE (1X)</td><td>NA</td><td></td><td>NA 40 mM Tris, 20 mM acetato, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Contatore di conteggio</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>Preparare una soluzione da 5 mg/mL in etanolo e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Preparare una soluzione al 10% (v/v) in acqua ultrapura e conservare a temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in c. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (chip)

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

L'eredità epigenetica transgenerazionale (TEI) consente la trasmissione di informazioni attraverso la linea germinale senza modificare la sequenza del genoma, attraverso fattori come gli RNA non codificanti e le modificazioni della cromatina. Il fenomeno dell'ereditarietà dell'interferenza dell'RNA (RNAi) nel nematode Caenorhabditis elegans è un modello efficace per studiare la TEI che sfrutta il breve ciclo di vita, l'autopropagazione e la trasparenza di questo organismo modello. Nell'ereditarietà dell'RNAi, l'esposizione degli animali all'RNAi porta al silenziamento genico e all'alterazione delle firme della cromatina nel locus bersaglio che persistono per più generazioni in assenza dell'innesco iniziale. Questo protocollo descrive l'analisi dell'ereditarietà dell'RNAi in C. elegans utilizzando un reporter della proteina fluorescente verde nucleare (GFP) espressa dalla linea germinale. Il silenziamento del reporter viene avviato alimentando gli animali con batteri che esprimono RNA a doppio filamento che hanno come bersaglio la GFP. Ad ogni generazione, gli animali vengono sottoposti a uno sviluppo sincronizzato e il silenziamento del gene reporter viene determinato al microscopio. A generazioni selezionate, le popolazioni vengono raccolte e processate per l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)-reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) per misurare l'arricchimento della modificazione istonica nel locus reporter della GFP. Questo protocollo per lo studio dell'ereditarietà dell'RNAi può essere facilmente modificato e combinato con altre analisi per indagare ulteriormente i fattori TEI nelle piccole vie dell'RNA e della cromatina.

Gli animali portatori del reporter H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 espresso dalla linea germinale (Figura 2A) sono stati esposti a GFP RNAi o RNAi di controllo attraverso l'alimentazione e sono passati come descritto nel protocollo e nella Figura 1. Il segnale nucleare GFP nella linea germinale è stato valutato manualmente utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza per un campione della popolazione ad ogni generazione. Il silenziamento del transgene è risultato completamente penetrante negli animali con punteggio P0 e F1 trattati con GFP RNAi (Figura 2B). Nella generazione F2, la percentuale della popolazione che mostrava un'ereditarietà del silenziamento GFP era di circa il 50%. Dalla generazione F5, la maggior parte della popolazione non ha mostrato ereditarietà del silenziamento e dalla generazione F10 non è stata rilevata alcuna ereditarietà, poiché tutti gli animali hanno espresso GFP.
Per determinare la variazione dell'arricchimento dell'istone H3K9me3 corrispondente al silenziamento indotto dall'RNAi, la ChIP-qPCR è stata eseguita su animali della generazione F1 dopo il trattamento con GFP RNAi o RNAi di controllo. Come previsto, la popolazione trattata con GFP RNAi ha mostrato livelli più elevati di istone H3K9me3 al bersaglio GFP e nella regione a valle di 1,3 kb rispetto agli animali di controllo trattati con RNAi (Figura 2C). La specificità dell'istone H3K9me3 ChIP è supportata dall'arricchimento in un locus di controllo positivo (clec-18) noto per essere arricchito in questo mark, ma non in un locus di controllo negativo vicino (hrp-2). L'arricchimento dell'istone H3 e l'arricchimento near-background nelle immunoprecipitazioni di controllo delle IgG sono stati rilevati anche in tutti i loci qPCR, come previsto. Quando l'arricchimento di ChIP al reporter è normalizzato al locus di controllo positivo clec-18 , viene mostrato un maggiore arricchimento dell'istone H3K9me3 su GFP RNAi, mentre l'arricchimento dell'istone H3 è simile tra il controllo e i trattamenti con GFP RNAi (Figura 2D). Poiché non si prevede che l'RNAi GFP influenzi l'istone H3K9me3 o l'occupazione totale dell'istone H3 nel locus clec-18 , questa normalizzazione mitiga le variazioni tecniche, come le differenze nell'efficienza ChIP tra l'RNAi GFP e i campioni di RNAi di controllo. Il fold-change dei livelli di istone H3K9me3 e H3 tra i trattamenti con RNAi mostra l'arricchimento dell'istone H3K9me3 specifico per il reporter GFP, indipendentemente dall'occupazione istonica, in seguito al silenziamento indotto da GFP RNAi (Figura 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Figura 2: Il silenziamento indotto da GFP RNAi corrisponde a un elevato arricchimento di H3K9me3 nel bersaglio dell'RNAi. (A) Diagramma del reporter dell'RNAi GFP espresso dalla linea germinale mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] con regioni di ampliconi qPCR marcate. (B) L'espressione della GFP è stata valutata attraverso le generazioni dopo trattamenti con RNAi a 21 °C. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di due repliche biologiche. (C) ChIP-qPCR di H3K9me3, istone H3 e controllo IgG in giovani adulti F1 da due repliche biologiche. clec-18 e hrp-2 sono rispettivamente i loci di controllo positivo e negativo per l'arricchimento di H3K9me3. (D) L'arricchimento di H3K9me3 e dell'istone H3 al reporter GFP RNAi normalizzato al locus di controllo positivo clec-18. (E) Variazione dell'arricchimento di H3K9me3 e dell'istone H3 tra gli animali trattati con GFP RNAi e RNAi di controllo, con normalizzazione a clec-18. La linea tratteggiata rappresenta un cambio di piegatura pari a 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un test di interferenza dell'RNA e ChIP per studiare l'ereditarietà epigenetica del silenziamento indotto dall'RNAi e le modificazioni della cromatina associate in C. elegans.

Analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

La ricerca nel nostro laboratorio esamina come le proteine associate alla cromatina, le modificazioni istoniche e i piccoli fattori del percorso dell'RNA lavorano insieme nel contesto dello sviluppo e dell'eredità epigenetica transgenerazionale. Il saggio di ereditarietà dell'RNA, utilizzando un reporter GFP, è diventato uno strumento molto potente. Questo protocollo descrive come standardizzare la preparazione, l'assegnazione di punteggi e il passaggio dei worm e la preparazione dei campioni ChIP, che possono aiutare a generare risultati riproducibili.Una delle sfide sperimentali quando si studiano i transgeni espressi dalla linea germinale è isolare gli effetti nella linea germinale dell'animale. Attualmente stiamo utilizzando animali interi per la ChIP, ma in futuro vorremmo sviluppare saggi per esaminare la cromatina, in particolare nella linea germinale. Il nostro laboratorio è interessato alla metilazione degli istoni e alle proteine che riconoscono questi segni.In futuro, vorremmo studiare l'interazione tra questi lettori di cromatina e le piccole vie di RNA nel contesto dell'ereditarietà dell'RNAi nei transgeni e della regolazione di sequenze endogene.

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Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Questo articolo descrive una tecnica per la visualizzazione degli eventi precoci dell'embriogenesi nel...

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive una procedura rapida e a basso consumo di materiale per l'integrazione di array extracromosomici transgenici nel genoma di Caenorhabditis elegans utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV). Inoltre, questo protocollo è particolarmente adatto per le linee transgeniche che trasmettono array extracromosomici ad alta velocità.

Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

Descriviamo le fasi dettagliate di un test chimico ad alto rendimento nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzato per valutare la tossicità germinale. In questo test, l'interruzione della funzione germinale a seguito di esposizione chimica viene monitorata utilizzando un reporter fluorescente specifico per embrioni aneuploidi.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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Scopri l'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter GFP e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Questo metodo standardizzato aiuta a studiare il silenziamento RNAi e le modificazioni istoniche.

Analisi dellereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e limmunoprecipitazione della cromatina (ChIP) (Video) | JoVE Journal

Analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

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